Summary
당사는 양성 선택을 이용하여 살아있는 인간 배아 줄기세포(hESC)의 식별 및 농축을 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 세포 표면 항원의 결합된 검출을 위한 단일클론 항체 TG30(CD9) 및 GCTM-2의 사용을 기술하고 또한 혼합세포 집단으로부터 hESC를 퍼지기 위한 음성 선택의 사용을 설명한다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포 (hESC)는 시험관 내에서무기한 으로 자가 갱신 할 수 있으며 적절한 큐를 사용하여 잠재적으로 모든 체세포 계보로 분화하도록 유도 될 수 있습니다. 분화 hESC 유도체는 잠재적으로 다양한 세포 퇴행성 질환을 치료하기 위해 이식 요법에 사용될 수 있습니다. 그러나, hESC 분화 프로토콜은 일반적으로 잔류 미분화 세포뿐만 아니라 분화 된 표적 및 오프 타겟 세포 유형의 혼합물을 산출한다. 실험실에서 클리닉으로 의 분화 된 hESC 유도체의 번역을 위해, 미분화 (다능성)와 분화 된 세포를 구별하고, 이러한 인구를 분리하는 방법을 생성 할 수 있어야합니다. hESC 유래 체세포 모형의 안전한 응용은 잔류 hESCs가 이식 다음 테라톰으로 알려져 있는 종양을 유도할 수 있기 때문에, 다능한 줄기 세포 없는 인구로만 달성될 수 있습니다. 이를 위해, 여기서우리는 양성 선택을 사용하여 능선 TG30 Hi-GCTM-2Hi hESCs의 식별을 위해 형광 활성 세포 분류(FACS)를 통해 단클론 항체 TG30(CD9) 및 GCTM-2를 이용한 흉부 관련 세포 표면 항원들을 검출하는 방법론을 설명한다. TG30/GCTM-2 FACS 방법론을 사용하여 매우 초기 단계 분화(TG30Neg-GCTM-2Neg)를겪고 있는 인구에서 미차별화 hESC를 감지하고 제거할 수 있었습니다. 추가 연구에서는 TG30/GCTM-2 FACS 프로토콜을 사용하여 선택된 분화TG30 Neg-GCTM-2Neg 세포의 만능 줄기 세포 없는 샘플은 면역 손상 마우스로 이식된 후 성소균을 형성하지 않아 프로토콜의 견고성을 뒷받침합니다. 한편, TG30/GCTM-2 FACS-농축 다능성 TG30 Hi-GCTM-2Hi hESC의 연속 패시징은 체외에서 자체 갱신하는 능력이나 본질적인 자발성 능력에 영향을 미치지 않았습니다. 따라서, TG30/GCTM-2 FACS 방법론의 특성은 분화 분석의 입력으로 hPSC의 고도로 농축된 인구를 얻고 유도체 세포 집단으로부터 잠재적으로 종양성(또는 잔류) hESC를 제거하는 민감한 분석법을 제공한다.
Introduction
HPSC (hPSC)는 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 다능성 줄기 세포 (hIPSC)를 포함한다. HPSC는 "자발성"으로 알려진 능력을 잃지 않고 적절한 문화 조건에서 무기한 으로 자체 갱신할 수 있습니다. Pluripotency는 3개의 배아 세균 세포 층의 각각을 대표하는 세포를 포함하여 본질적으로 어떤 체세포 혈통으로 분화하는 세포에 대한 잠재력으로 정의됩니다. hPSC의 놀라운 잠재력은 치료 옵션을 포함한 다양한 세포 기반 응용 프로그램에 대한 수단을 제공합니다. 예를 들면, 심장 마비, 척추 상해, 당뇨병, 파킨슨 병, 몇몇 암 및 그밖 임상 병기에서와 같이, 인체에 있는 세포의 일반적인 기능이 손상되는 세포 죽음 및 변성을 관련시키는 무질서가 있습니다. 이러한 조건을 앓고 있는 환자는 실험실에서 hPSC에서 파생된 건강하고 기능적인 체세포 세포를 이식하여 잠재적으로 치료될 수 있었습니다. 그러나, 현재 hPSC 분화 프로토콜은 100% 효율적이지 않으며 분화된 표적 및 오프타겟 세포 유형뿐만 아니라 차별화를 거치지 않은 잔류 hPSC의 혼합물을 산출하여1-3을반복한다. 환자로 이식을 위한 hPSC 유래 체세포 샘플에서 소수의 hPSC의 존재는 3개의 배아 배아 층 의 조직을 형성하기 위하여 그들의 본질에 의하여 이 세포로 심각한 임상 리스크를 구성하고, 잠재적으로 기형종으로 알려져 있는 종양의 모형을 생체내에서 형성할 수 있었습니다. 따라서 만능 줄기 세포가 없는 것으로 판단된 표적 세포 집단만이 환자로 이식하는 데 안전하다고 간주될 수 있다. 잠재적으로 차별화 다음 잔류 hPSC의 정화를 달성하기 위해보고 된 몇 가지 방법이 있습니다(검토할 경우 Polanco 및 Laslett4참조). 우리는 이전에 다능성 줄기 세포를 식별하고 hESC 라인5-7의배양에서 분화의 초기 단계를 겪고 세포로부터 그들을 구별하기 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 결합 된 단일 클론 항체 TG30 (CD9) 및 GCTM-2의 사용을보고했다.
세포 표면 항원검출을 위해 항체를 사용하는 한 가지 장점은 표적 세포가 항체 결합 및/또는 라벨링 후에 일반적으로 실행 가능하다는 것입니다. 따라서, 표적 세포는 이식 전에 확장 및 추가 적용을 위해 항체 라벨링 후 수집및 재배양될 수 있다. hPSC에 발현된 세포 표면 항원에게 한 가지 주의사항은 다능성 단계에만 국한되지 않고 많은 경우에 발달 중에 일시적으로 다시 발현되어 있으며 따라서 일부 분화 된 세포 유형에서 검출될 것입니다. 따라서, 항체를 사용하여 인간 다능성 세포를 검출하고 hPSC 유래 세포의 샘플로부터 제거하는 것이 목적이라면, 선택된 항체도 이식을 위한 특정 분화 세포 유형에 항원과 반응해서는 안 된다. 불행히도, 라이브 hPSC 4에서세포 표면 마커를 검출하는 항체의 수가 제한되어 선택을위한 옵션이 제한적입니다. 또한, 몇몇 연구는 하나의 단일 세포 표면 마커의 검출이 모든 hPSC를 제거하기에 충분하지 않다는 것을 지적하고, 모든 hPSC 다능성 하위 집단을 제거하는 모든 시도는 hPSC 9-10에의해 표현된 상이한 에피토프를 검출하는 2개 이상의 항체를 사용하는 방법에 의존해야 한다는 것을 건의합니다. 위에서 언급했듯이, 만능 줄기 세포가 없는 세포 집단으로 결정될 수 있는 hPSC 유래 세포만이 인간 이식에 적합합니다. 이러한 수준의 스트링성에 도달하는 것은 항체 매개 세포 선별 기술을 통과하는 단일 패스로 달성되지 않을 수 있습니다. 분화 된 표적 세포의 농축 된 인구의 재문화 및 세포 분류의 후속 라운드는 결정적으로 다능성 줄기 세포없는 샘플을 얻기 위해 필요할 수 있습니다.
우리의 실험실에서, 우리는 광범위하게 살아있는 다능성 세포의 검출을 위한 2개의 hES 세포 표면 항체, TG30 (CD9) 및 GCTM-2를 특징으로 합니다. 우리의 연구는 TG30과 GCTM-2 둘 다의 결합된 검출이 hESC 라인 5-7에있는 정경 흉부 관련 유전자의 발현과 강하게 상관관계가 있다는 것을 보여주었습니다. TG30/GCTM-2 FACS 면역프로파일링은 hESC 배양이 TG30/GCTM-2 발현 5-7의정량적 연속 그라데이션을 구성한다는 것을 일관되게 보여주었다. 우리는 임의로이 TG30 / GCTM-2 그라데이션 내에서 세포의 네 개의 인구 (P)를 설립했다 : P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30낮은-GCTM-2낮은),P6 (TG30미드-GCTM-2미드)및 P7 (TG30 하이 -GCTM- GCTM 2)하이-GCTM2-7 하이트 - GCTM - 7. 이러한 P4, P5, P6 및 P7 세포 집단의 특성화는 P6 및 P7 과속이 많은 수의 흉부 관련 유전자를 발현하고 FACS 2-3이후의 재배양 시 줄기와 같은 식민지를 효율적으로 형성하는 것으로 나타났다. 한편, P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)세포는 많은 수의 분화 마커를 발현하고 hESC 라인의 배양 확대에서 전형적으로 발생하는 자발적으로 분화된 세포 유형을 구성한다 5-6. 우리는 초기 단계 분화 에 따라 잔류 hPSC의 선택적 제거에 대한 TG30 / GCTM-2 FACS의 잠재력을 테스트하기로 결정, 또한 다능성 줄기 세포 인구의 농축을 위해. 아래에 설명된 프로토콜은 다능성 P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)의제거를 달성하기 위해 FACS 이후의 분화 P4(TG30Neg-GCTM-2Neg)세포를 수집하고 재배양하는 방법을 보여줍니다. 또한, 다능성 P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포의 수집 및 재문화를 설명하여 다능성 세포의 농축 배양을 획득하여, 이는 그 후 정의된 입력 집단으로 사용될 수 있어 잠재적으로 분화 연구의 효율과 일관성을 증가시킬 수 있다.
Protocol
다음 프로토콜은 모나시 대학 (멜버른)에서 StemCore 시설에서 제공하는 hESC-MEL111 표준 벌크 문화를 사용하여 수행되었다. 본 세포주들은 bFGF에서 미토티컬 불활성화 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 층에서 일상적으로 배양되어 hESC/KOSR 배지7을 보충하고 각각 5-7일마다효소 해리(Collagenase)로 유지된다. 75cm 2(T75) 플라스크에서 ~80%의 합류로 성장한 hESC 배양은 이 프로토콜에 대한 입력 모집단으로 사용된다. 아래에 설명된 모든 세포 조작 절차는 HEPA 필터링 클래스 II 바이오 안전 캐비닛의 무균 조건하에서 수행되어야 합니다.
TG30/GCTM-2 FACS 분석기를 수행하기 이틀 전에, FACS 후 회복된 세포의 재문화에 사용되는 T75 배양판(섹션 1에 설명)을 준비한다(섹션 4에 설명).
1. MEF의 파종 및 MEF 조절 매체의 준비
1.1 일 -2 : T75 플라스크에 MEF의 도금
- 각 T75 플라스크에 0.1% w/v 젤라틴의 파이펫 10ml를 넣고 표면을 고르게 코팅합니다.
- 생체 안전 캐비닛의 실온에서 30분 동안 배양하십시오.
- 흡인 젤라틴 용액.
- 플라스크에 20ml MEF-배지를 넣고 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 37°C/5%CO2로 미리 평형화한다.
- 플레이트는 다음과 같은 밀도에서 준비된 플라스크에 미토티컬 비활성화된 MEFs를 제공합니다. 1/3 MEF 밀도 시드 1.4 x 104 셀/cm2 (T75= 1 x 106 MEFs). 전체 밀도 MEF 종자 5.3 x 104 셀/cm2 (T75 = 4 x 106 MEFs).
참고: 우리는 일상적으로 γ 조사에 의해 미토흉으로 비활성화된 MEF를 사용합니다. γ 조사 된 MEF의 준비를위한 프로토콜은 Michalska12에서찾을 수 있습니다.
- 인큐베이트는 MEF 배양을 조사한 MEF 배양문화를 하룻밤 사이에 37°C/5%CO2로 조사하였다. 1/3 플라스크는 MEF 중간 변경 없이 1-4일 동안 배양할 수 있습니다. 이러한 플라스크는 FACS 이후 셀의 투석에 사용됩니다(프로토콜 4에서와 같이). 전체 MEF 플라스크는 1.2단계에서 아래당 CM을 생성하기 위해 하룻밤 동안 배양됩니다.
1.2 일 -1 : MEF 조절 매체 (CM) 준비
- 전체 MEF T75 플라스크에서 MEF 배지를 흡인합니다.
- T75 플라스크 당 5 ng/ml 인간 FGF-2로 보충 된 사전 평형 25ml hESC / KOSR 배지를 추가하십시오. 24 시간 동안 37 ° C / 5 % CO2에서 배양하십시오.
- MEF 조절 배지(CM)를 멸균 조직 배양 튜브에 모으고, CM을 10 ng/ml 인간 FGF-2로 새롭게 보충하고 0.22 μm 폴레셔술폰 필터를 사용하여 필터를 드셔 보냅니다.
- 추가 CM을 생성하려면 1주일 동안 동일한 MEF 문화권에서 매일 1.2.2 및 1.2.3 단계를 반복하십시오.
TG30/GCTM-2 분석기를 수행하는 날에는 MEF-배지를 1/3 MEF T75 플라스크에서 CM로 대체하고 아래 설명된 절차에서 회수된 hESC 또는 hESC 유도체 세포를 시드하기 전에 최소 30분 동안 미리 평형화된다. CM은 신선하게 사용되거나 최대 2주 동안 4°C에 저장됩니다. CM은 우리의 손에서와 같이이 프로토콜에서 사용되지만 비조건 된 미디어에 비해 FACS 이후 세포의 생존가능성을 증가시킵니다 (결과가 표시되지 않음).
2. TG30/GCTM-2 FACS 분석 수행: hESC 대량 배양을 단일 셀로 분리
참고: 4°C에서 20% FBS/DMEM-F12 배지.
- hESC/KOSR 미디어를 두 개의 T75 플라스크에서 배양된 hESC 라인으로 흡인합니다.
- 각 T75의 세포를 10ml DPBS로 헹구고 흡인을 제거합니다.
- 각 T75 플라스크에 트립LE 익스프레스 해리 솔루션 3ml을 추가합니다. 37°C/5%CO2에서 5분 동안 배양합니다.
- 플라스크의 측면을 부딪쳐 세포의 완전한 이탈을 얻습니다. 현미경으로 확인하십시오. 세포가 쉽게 빠져가지 않으면 37°C/5% CO2에서2-3분 더 배양한다.
- 각 T75 플라스크에 10ml 20% FBS/DMEM-F12(4°C로 보관)를 추가합니다. 멸균 10ml 파이펫을 사용하여 플라스크 벽에 대해 여러 번 해리된 세포를 부드럽게 세살하여 주로 단일 세포 현탁액을 달성합니다.
- 70 μm 셀 스트레이너를 멸균 폴리프로필렌 튜브에 놓습니다. 멸균 10ml 파이펫을 사용하여 두 개의 T75 플라스크에서 풀로 풀린 hESC 단일 셀 서스펜션을 스트레이너를 통해 강제로 넣습니다.
- 셀 스트레이너를 버리고 튜브 뚜껑을 교체하고 풀이 된 hESC 서스펜션을 2 분 동안 1,000 x g에서 원심 분리합니다.
- 10ml 20% FBS/DMEM-F12(4°C에서 미리 냉각됨)로 펠릿을 부드럽게 재보페치하여 수퍼네티드를 버리고 셀을 세척하십시오.
- 2 분 동안 1,000 x g에서 두 번째 원심 분리를 수행합니다.
- 수퍼네티드를 버리고, 10ml 20% FBS/DMEM-F12(4°C에서 미리 식)를 추가하고 부드럽게 세드려 세포를 되살립니다. 얼음에 50ml 튜브를 놓습니다. 이 튜브는 아래에 설명된 정렬 샘플 면역 염색 절차에 사용됩니다.
- 혈청계를 사용하여 셀 번호 계수계에 대해 hESC 단세포 서스펜션(step 2.10)의 20 μl을 복용하십시오. T75 플라스크 당 10-15백만 개의 셀의 수율을 기대해야 합니다.
참고: FBS는 FACS 이후 세포 생존 가능성을 높이기 위해 프로토콜의 이 부분에서 사용됩니다.
3. 세포 표면 항원 TG30 및 GCTM-2의 면역 형광 염색
- hESC 단일 세포 현탁액의 알리쿼트 150 μl(~100,000세포)은 1.5ml의 6개의 미세센심분리튜브로 각각 이다. 이 6개의 알리쿼트는 FACS 기계의 분석방법을 보정하는 데 필요한 염색 컨트롤에 사용됩니다. 나머지 ~9 ml 셀 서스펜션은 테이블 1과 2에따라 TG30 및 GCTM-2의 검출을 위해 해리 된 배양이 코스타화되는 정렬 샘플입니다.
- 20% FBS/DMEM-F12에서 1차 항체의 결합 반응을 수행한다. 최종 반응 볼륨은 정렬 샘플의 경우 ~9ml, 컨트롤의 경우 200 μl이어야 합니다. 일차 항체로 등형 대조군을 포함. 튜브를 얼음 위에 수평으로 놓고 흔들기 플랫폼에 30분 동안 부드럽게 섞습니다.
- 원심분리기 1차 항체 반응은 2분 동안 1,000 x g에서 반응한다.
- 상체를 버리고 펠릿을 20ml 20% FBS/DMEM-F12(4°C에서 미리 냉각)하고 컨트롤용 200 μl로 세척하여 세포를 세척한다.
- 2 분 동안 1,000 x g에서 두 번째 스핀을 수행합니다.
- 20% FBS/DMEM-F12에서 이차 항체의 결합 반응을 수행한다. 최종 반응 부피가 정렬 샘플의 경우 2.5ml, 컨트롤의 경우 200 μl이어야 합니다. 이 단계에서 PE 안티 마우스 CD90.2 반응 튜브를 준비합니다. 튜브를 얼음 위에 수평으로 놓고 흔들기 플랫폼에 30분 동안 부드럽게 섞습니다.
참고: 이 잠복기 동안 CM을 수집하고 섹션 1.2와 같이 CM로 1/3 MEF T75 플라스크를 준비하는 것이 편리합니다.
- 원심분리기 이차 항체 반응은 2분 동안 1,000 x g에서 반응합니다.
- 상체를 버리고 20ml 20% FBS/DMEM-F12(4°C에서 미리 냉각됨)로 펠릿을 재보선하여 셀을 두 번 세척하고 컨트롤용 200 μl을 세척한다.
- 각 세척 후 2 분 동안 1,000 x g에서 스핀을 수행하고 얼음에 튜브를 배치합니다.
- 슈퍼나티를 폐기하고 0.3 μg/ml에서 프로피듐 요오드(PI)로 보충된 20% FBS/DMEM-F12에서 셀 펠릿을 재중단합니다. 정렬 샘플에 2-3 ml, 컨트롤에 300 μl을 사용합니다.
참고: 스테인처리되지 않은 셀이 있는 컨트롤 튜브에 PI를 추가하지 마십시오.
- P1000 마이크로파이프를 사용하여 35 μm 뚜껑 셀 스트레이너를 통해 각 개별 세포 현탁액을 강제로 사용하며, 5ml 튜브 폴리스티렌 라운드 바닥 테스트 튜브에 결합합니다.
- 50 g/min의 원심분리기는 스트레이너 뚜껑의 잔류 셀 서스펜션을 통해 강제로 합니다.
- 튜브의 측면을 눌러 각 단일 세포 서스펜션을 다시 중단하고 얼음 위에 놓습니다. 이제 세포가 FACS에 대한 준비가 되었습니다. 바로 진행하십시오.
4. 75cm2 (T75) 플라스크에서 TG30 / GCTM-2 부절 세포의 포스트 FACS 문화
- 우리는 이전에 TG30 /GCTM-2 면역 프로파일링7에대한 FACS 기계를 설정하는 방법을보고했다. 이 절차는 MEF가 없는 실행 가능한 단일 hESC의 회수를 허용하며, P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg),P5(TG30Low-GCTM-2Low),P6(TG30Mid-GCTM-2Mid)및 P7(TG30Hi-GCTM-2Hi- 1- 1)을볼 수 있습니다. TG30/GCTM-2 FACS용 FACS 기계를 설정하여 이전 보고서에서와 같이 다음에 사용할 셀 위반을 복구합니다.
- FACS 기계에서 세포를 수집하기 전에 2 개의 5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 테스트 튜브 각각에 1.2 단계로 준비된 1 ml CM을 추가하십시오. 얼음 위에 놓습니다.
- TG30/GCTM-2 FACS를 사용하여 분화 P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)및 다능성 P7(TG30Hi-GCTM-2Hi)세포 전복으로부터 각각 400,000개의 세포를 회수합니다.
- 원심 분리기 수집 튜브를 1,000 x g에서 5 분 동안 분리합니다.
- 슈퍼네이넌트들을 흡인시합니다. P1000 마이크로파이프를 사용하여 각 셀 펠릿을 재보위해 37°C/5% CO2 CM로 추정된 1ml를 추가합니다. CM로 미리 평형된 1/3 MEF T75 플라스크에 각 분획에 대한 셀을 시드합니다(1.2단계당 준비)
- 세포 배양인에서 24시간 동안 37°C/5%CO2의 배양.
- 매일 CM을 흡인하고 약 2 주 동안 갓 준비 된 CM (1.2 단계)로 대체하십시오. 다능성 P7의 배양 (TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포는 1 주일 후에 인간 줄기 와 같은 식민지를 보여주고 9-11 일에 ~80 % 합류에 도달합니다. P4의 배양 (TG30Neg-GCTM-2Neg)세포는 주로 11-13 일에 합류에 도달하는 섬유 아세포 와 같은 세포의 잔디로 성장한다. 이 단계에서, 필요한 경우, P4 및 P7 세포 배양은 P4 또는 P7 서브절의 연속 재문화를 중재TG30/GCTM-2 FACS에 사용할 수 있습니다(그림 2 및 3참조).
Representative Results
다능성 줄기 세포가 없는 hESC 유도체는 P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)굴절으로부터 세포의 연속적인 패시징에 의해 얻을 수 있다.
이전 보고서는 hESC 표준 배양에서 분면성5,6,13과관련된 유전자의 발현 그라데이션을 나타내는 하위 집단의 혼합물이 공존한다는 것을 확립했다. TG30(CD9) 및 GCTM-2와 같은 세포 표면 항원을 결합하여 줄기 세포 마커 및 계보 특이적 전사인자의발현에 의해 나타난 바와 같이, 다능성 단계 및 초기 분화의 다양한 단계에서 다수의 세포 소집합의 차별을 허용한다. 이전 보고서에 동의하여, 우리는 P4 (TG30 Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30로우-GCTM-2로우),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid),및 P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)세포를 hESC-MEL1 라인(이 1)에사용되는 것으로 구별 할 수 있었습니다. 이 결과, 아래 설명된 연구에서 추가 배양을위해 분화P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)세포 및 다능성 P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포를 수집하여 진행하였다.
우리는 매우 초기 단계 분화를 겪고 세포 인구에서 미분화 hESC를 제거 할 수 있는지 여부를 부정적인 선택 접근 방식을 사용하여 조사 (TG30Neg-GCTM-2Neg). 약 2주 동안 연속적으로 배양된 P4(TG30Neg-GCTM-2Neg)세포를사용하고, 각 통로에서 상대하기 전에 TG30/GCTM-2 FACS를 사용하여 재분석하였다. 결과는 TG30 Neg-GCTM-2 Neg분화 세포 유형에 대한 농축 된 P4 서브절율이 연속 패시징 후 농축되고, 초기 통로에서 P7 (TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포의 사소한 존재가 결국 더 통과 한 후 사라졌으며 만능 줄기 세포가없는 샘플(그림 2A, 3)이되었다.
다능성 hESC 세포의 농축은 세포 TG30 Hi-GCTM-2Hi 세포의 수집에 의해 달성될 수 있다.
이 분석서를 이용한 이전 관측에 기초하여, 우리는 hESC 식민지를 형성해야 P7 (TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포를 수집하여 다능성 hESC의 농축을 기대할 것입니다. 따라서, 우리는 또한 TG30/GCTM-2 FACS 매개 다능성 P7 (TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포의 연속 패시징을 조사했습니다. 이들 P7 배양에서, TG30/GCTM-2 FACS 면역프로파일링은 각 통로에서 세포를 결합하기 전에 수행되었고P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포만 재배양하였다. 이러한 방식으로, 세포의 대부분은 만리분력(P6 및 P7)과 관련된 서브절율에 위치하고 있음을 관찰하여, P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)세포(그림3A)의소량을 분화하고 생성하는 능력을 유지하는 다능성 세포의 농축을 나타낸다. 더욱이, P7 세포의 배양은 패시징(도3B)동안 많은 수의 hESC 와 같은 식민지를 보였으며, 또한 흉부 상태의 유지를 나타낸다.
그림 1. TG30/GCTM-2 FACS 서브절율을 얻기 위한 대표적인 선별 전략. (A): 해리된 hES 세포 현탁액은 단일 세포로 분류되고 잠재적 인 덩어리 또는 이중은 높이 및 영역 (FSC-H 및 FSC-A)에 대한 전방 분산으로 문지어져 있습니다. (B): 잠재적 인 파편은 FSC-A 및 SSC-A로 제거되며 그대로 셀만 더 정렬됩니다. (C): 비생존 세포는 프로피듐 요오드(PI) 형광(FSC-A 및 FL3-A)에 기초하여 제외된다. (D): MEF 피더 세포는 마우스 CD90.2-PE(FL2-A 및 SSC-A)의 발현에 기초하여 음수 선택에 의해 밖으로 문지였다. (E): MEF 피더가 없는 고립된 실행 가능한 hESC 분획은 마침내 P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg),P5(TG30Low-GCTM-2Low),P6(TG30Mid-GCTM-2Mid),및 P7(TG30Hi-GCTM-2Hi)하위 집단으로 분획됩니다. 네거티브 게이트(TG30 Neg-GCTM-2Neg,명명된 P4)는 스테인드되지 않은 세포에 대한 배경 자동 형광및 동형 대조군에도 따라 설정되었다. (F): TG30/GCTM-2 유동 세포분석 해석의 전형적인 다른 게이트 하위 집단의 백분율. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. hESC-MEL1 라인에서 자발적으로 분화된 P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)세포의 대표적인 연속 배양. (A): 대표적인 TG30/GCTM-2 FACS 플롯은 TG30 및 GCTM-2 셀 표면 마커의 검출된 발현 수준에 의해 구별되는 세포의 게이트 하위 집합(P4, P5, P6 및 P7)을 보여주는 플롯입니다. P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)면역프로포팅을 나타내는400,000hESC-유도체의 초기 인구는 hESC-MEL1 라인의 벌크 배양으로부터 수집된다. 이러한 P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)세포는 T75 플라스크에서 hESC 갱신을 지지하는 조건에서 FACS 이후 연속적으로 통과되어 컨플루엔트(11-13일)에 도달한다. 각 통로에 앞서 TG30/GCTM-2 FACS는 P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)분화세포 유형만 수집하고 재문화하기 위해 수행됩니다. (B): 14일 후 분화P4(TG30Neg-GCTM-2Neg)세포의 잔디밭의 전형적인 형태. (C): 14일 후에 본 산발적 hESC와 같은 콜로니는 P4(TG30Neg-GCTM-2Neg)세포와 섞인 후 1번 통로에서만, P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포를 오염시킴으로써 생성될 가능성이 가장 높다. 스케일 바 = 200 μm. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. hESC 라인에서 파생된 P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포는 본질적인 만능 특성을 잃지 않고 FACS 이후 연속적으로 통로될 수 있다. 대표적인 TG30/GCTM-2 FACS 면역프로파일링은 TG30 및 GCTM-2의 발현 수준에 따라 세포(P4, P5, P6 및 P7)의 차별하위집합을 나타내고 있다. (A): P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)특성을 나타내는 400,000개의 세포의 시작 모집단은 hESC-MEL1 라인의 벌크 배양으로부터 회수된다. 다능성 P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포는 T75 플라스크에서 hESC 갱신을 지지하는 조건에서 FACS 이후 연속적으로 통과되어 -80%의 인플루언서(9-11일)에 도달한다. TG30/GCTM-2 FACS 면역프로파일링은 각 통로에서 세포를 결합하기 전에 수행되며 P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포만 재배양된다. 결과는 P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)세포가 후속 통과와 함께 다능성 특성을 보존한다는 것을 보여줍니다. (TG30 Hi-GCTM-2Hi)발현, hESC와 같은 식민지(B에 도시됨)를 형성하고 각 FACS 그라데이션에서 차별화된 P4(TG30Neg-GCTM-2Neg)의작은 부분의 회수로부터 추론될 수 있는 구별능력을 유지한다. 스케일 바 = 200 μm. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 샘플(반응 볼륨) | 1차 항체 | 이차 항체 | PE 쥐 안티 마우스 CD90.2 b | 프로피듐 요오디드 c |
| 정렬 샘플 (기본 AB의 경우 ~ 9 ml, 보조 AB의 경우 2.5 ml) | (TG30 + GCTM-2) a | AF 488 염소 안티 마우스 IgG2a + AF 647 염소 안티 마우스 IgM | + | + |
| 제어-1: TG30 (200 μl) | TG30 | AF 488 염소 안티 마우스 IgG2a | - | + |
| 제어-2: GCTM-2 (200 μl) | GCTM-2 | AF 647 염소 안티 마우스 IgM | - | + |
| 제어-3: 마우스 방지 CD90.2 (200 μl) | - | - | + | + |
| 제어-4: 물리에리트린 (PE) (200 μl) | 마우스 IgG2a 아이소타입 | R-phycoerythrin 염소 안티 마우스 IgG2a | - | + |
| 제어-5: 마우스 면역글로불린 이소형 (200 μl) | 마우스 IgG2a 아이소타입 + IgM 아이소타입 | AF 488 염소 안티 마우스 IgG2a + AF 647 염소 안티 마우스 IgM | - | + |
| 제어-6: 스테인드 셀(200 μl) | - | - | - | - |
표 1. FACS 정렬을 위해 샘플 및 컨트롤을 정렬합니다. a 정렬 샘플은 TG30 및 GCTM-2 항체와 동시에 면역 염색된다. b PE-안티 마우스 CD90.2는 FACS14동안 마우스 세포를 인식하고 hESC에서 MEFs를 제거하는 데 사용된다. c 비생존 세포는 0.3 μg/ml의 최종 농도에서 공화 요오드를 사용하여 제외됩니다. 반응 튜브에 첨가되지 않은 시약(+)을 추가했습니다.
| 항체 | 호스트 | 이소타입 | 희석 작업 |
| TG30 (1.4 mg/ml) | 마우스 | IgG2a | 1:1,000 |
| GCTM-2 (하이브리드종 상수) | 마우스 | IgM | 1:5 ~ 1:10 a |
| AF 488 염소 안티 마우스 IgG2a | 염소 | 폴리클로날 | 1:500 |
| AF 647 염소 안티 마우스 IgM | 염소 | 폴리클로날 | 1:500 |
| R-phycoerythrin (PE) 염소 안티 마우스 IgG2a | 염소 | 폴리클로날 | 1:1,000 |
| 마우스 방지 CD90.2 | 쥐 | IgG2b | 1:100 |
| 정제 마우스 IgG2a, θ 이소타입 제어 | 마우스 | IgG2a | 1:200 |
| 정제 마우스 IgM, θ 이소타입 제어 | 마우스 | IgM | 1:200 |
표 2. FACS 분류를 위한 항체 세부 정보 및 희석. a hESC의 세포 표면에 GCTM-2의 매우 높은 발현으로 인해 이 항체로 포화도에 도달할 수 없다. GCTM-2 hybridoma 상체체의 각 배치는 표준 제어 또는 이전 배치에 대해 적정화되어야 하며, hESC와 유사한 결과를 얻고 과염색을 피해야 합니다.
| 중간 의 이름 | 구성 |
| hESC/KOSR 매체 | 덜벡코의 수정독수리 매체: 영양 혼합물 F-12 (DMEM/F-12) 20% 녹아웃 세럼 교체 (KOSR), 2 mM 글루타맥스, 1% MEM 비본질성 아미노산, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml 인간 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF-2) 및 10 ng/ml 인간 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF-2) 및 10 ng/ml 인간 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF-2) 및 10 ng/ml |
| MEF 배지 | 덜벡코의 수정 된 독수리 매체, 높은 포도당 (DMEM) 10% 태아 소 세럼으로 보충 (FBS), 2 mM 글루타맥스, 펜 / 스트렙 1 x. |
표 3. 문화 매체의 구성.
Discussion
임상 맥락에서, 분화된 체세포 유형은 이식 및 치료 응용을 위한 최종 바람직한 제품이며, hPSC는 실험실에서 그 체세포 또는 그들의 선조를 생성하는 자기 갱신 및 확장 가능한 근원입니다. 기종 형성에 대한 고유의 잠재력을 가진 잔여 미분화 hESC의 존재는 환자로 이식하기 위한 hESC 유래 체세포를 고려할 때 안전 위험입니다. 이 및 세포 치료와 관련 된 다른 위험의 검토에 대 한 Sharpe 외 를 참조 하시기 바랍니다. 16 그러한 응용 을 실현하기 위해 연구자들은 다능성 줄기 세포가없는 표적 세포 집단을 생성하는 것을 목표로하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 TG30/GCTM-2 FACS 방법론을 사용하면 다능성 세포(TG30 Hi-GCTM-2Hi)의존재를 분화하는 세포 인구에서 모니터링하고 FACS 후 농축 및 재배양할 수 있는 실행 가능한 hESC 분화 유도체를 얻을 수 있음을 입증합니다. 우리의 프로토콜의 단일 패스로 100 % 만능 줄기 세포 없는 샘플을 얻을 수는 없지만, 농축 hESC 유도체는 재배양 될 수 있으며 연속 적으로 100 % 체세포 순도를 달성한다. FACS 이후 확장에 대한 체세포의 입증된 생존능력은 잠재적 이식 요법에 적합한 적절한 수의 세포의 생산을 가능하게 합니다.
이 파일럿 연구의 고무적인 결과는 몇몇 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (hiPSC) 선15를가진 비교 연구 결과에서 우리의 TG30/GCTM-2 프로토콜을 사용하여 보다 포괄적인 조사를 능력을 발휘하도록 자극했습니다. 그 연구에서, 우리는 우리의 TG30/GCTM-2 FACS 프로토콜을 사용하여 얻은 다능성 줄기 세포 없는 견본이 면역 박탈마우스로 이식될 때 성각을 생성하지 않았다는 것을 것을을 발견했습니다. 따라서, 우리는 자신있게 이 시험관 내 프로토콜의 사용으로, 다능성 TG30 Hi-GCTM-2Hi 세포가 생체 내에서 테라토마를 개발하지 않는 것으로 결정된 초기 단계 분화 세포 배양이 생체 내에서 테라토마를 개발하지 않는다는 것을 자신있게 밝힐 수 있다. 이것은 임상 응용 프로그램에서 hPSC 유래 세포를 사용하기 전에 기종 형성의 위험을 제거하는 잠재적 인 접근 법을 제공하는 분석의 견고성을 강력하게 지원합니다.
반대로, 우리는 또한 TG30/GCTM-2 FACS 분석이 이 두 표면 항원 (TG30 Hi-GCTM-2Hi)의높은 수준의 발현을 가진 다능성 세포 집단을 회수하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이전 연구는 TG30Hi-GCTM-2Hi 세포가 OCT4hi 발현과 가장 높은 상관관계를 나타내고 hESC와 같은 콜로니5,6,13,15의가장 높은 수를 형성한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 우리는 Pluripotency 네트워크가 TG30Hi-GCTM-2Hi 발현 셀의 최대 수준에서 활성화되는 것을 추론합니다. 우리는 TG30/GCTM-2 FACS 프로토콜을 사용하고 P7(TG30Hi-GCTM-2Hi)세포를 사용하여 분화 분석서에 대한 입력으로 농축 된 살아있는 hESC 배양을 대규모로 정화 할 수 있다고 생각합니다.
결론적으로, 우리는 hESC의 정화 및 농축 모두에 대한 표면 항원 TG30 및 GCTM-2의 결합 된 표현을 기반으로 FACS 어약의 잠재력을 여기에서 보여줍니다. hPSC의 지시된 분화를 위한 프로토콜을 가진 미래 연구는 또한 이 잠재력에 관하여 유익할 확률이 높습니다. 우리는 분화 된 hESC 유도체가 일시적으로 TG30 (CD9) 또는 GCTM-2를 발현하는 일부 분석서에서, 이 두 항체는 분석6의특정 시점에서 분화 된 인구로부터 다능성 세포를 제거하기에 적절하지 않거나 충분하지 않을 수 있음을 알고 있다. 따라서, 일부 분화 세포 유형과의 교차 반응의 가능한 한계를 극복하기 위해 살아있는 hESC를 구체적으로 인식하는 새로운 항체를 찾아야 할 필요성이 지속적으로 존재한다.
Disclosures
아무것도 공개할 수 없습니다.
Acknowledgments
모나쉬 대학의 StemCore 시설에서 hESC 라인과 모나시 대학의 FlowCore 시설 FACS 서비스를 제공해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 호주 줄기 세포 센터에서 연구 보조금에 의해 지원 되었다, 뉴 사우스 웨일즈와 빅토리아 정부 줄기 세포 연구 보조금 프로그램 모두에. ALL은 호주 줄기 세포 과학, 줄기 세포 호주에서 호주 연구 위원회 (ARC) 특별 연구 이니셔티브의 파트너 조사자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. | |||
References
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