Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات

Published: October 31, 2013 doi: 10.3791/50863
Automatic Translation
1
1Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

البكتيريا تنتج مركبات يفرز التي لديها القدرة على التأثير في علم وظائف الأعضاء من جيرانهم الميكروبية. نحن هنا وصف شاشة coculture التي تسمح الكشف عن مثل هذه التفاعلات بين الأنواع بوساطة كيميائيا عن طريق خلط التربة مع سلالات الميكروبات مراسل النسخي الفلورسنت من العصوية الرقيقة على وسائل الاعلام الصلبة.

Abstract

في الطبيعة، ونادرا ما توجد البكتيريا في عزلة، بل هي بدلا محاطة مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي تغير البيئة المحلية عن طريق إفراز نواتج الأيض. هذه المركبات لديها القدرة لتعديل وظائف الأعضاء والتفريق بين جيرانهم والميكروبية من العوامل الهامة المحتملة في إنشاء وصيانة للمجتمعات الميكروبية المعقدة. قمنا بتطوير شاشة القائم على مضان coculture لتحديد مثل هذه التفاعلات الميكروبية بوساطة كيميائيا. ينطوي على الشاشة الجمع بين النسخي فلوري مراسل سلالة بالميكروبات البيئية على وسائل الاعلام الصلبة والسماح للمستعمرات أن ينمو في coculture. تم تصميم مراسل النسخي الفلورسنت بحيث السلالة البكتيرية اختيار تتفلور عندما يتم التعبير عن النمط الظاهري معينة من الفائدة (أي تشكيل بيوفيلم، تبوغ والإنتاج عامل الفوعة، الخ.) يتم تنفيذ فحص في ظل ظروف النمو عرجإعادة هذا النمط الظاهري لا يتم التعبير (وبالتالي سلالة المراسل هو عادة nonfluorescent). عندما يفرز الميكروب والبيئية المستقلب الذي ينشط هذا النمط الظاهري، فإنه ينشر من خلال أجار وينشط مراسل بناء الفلورسنت. وهذا يسمح للتحريض-المنتجة للميكروب المستقلب ليتم الكشف عن: هم المستعمرات nonfluorescent معظم الأقرب إلى المستعمرات الفلورسنت. وبالتالي، هذه الشاشة يسمح تحديد الميكروبات البيئية التي تنتج نواتج إنتشاري التي تنشط استجابة فسيولوجية معينة في سلالة المراسل. يناقش هذا المنشور كيفية: أ) تحديد شروط الفحص coculture المناسبة، ب) إعداد المراسل والميكروبات البيئية للفحص، ج) أداء الشاشة coculture، د) عزل المفترضة حمل الكائنات الحية، وه) تأكيد نشاطهم في الشاشة الثانوية. قمنا بتطوير هذه الطريقة للكشف عن الكائنات الحية في التربة التي تنشط بيوفيلم مصفوفة الإنتاج في العصوية الرقيقة

Introduction

ونحن مهتمون في فهم كيف تؤثر على الأيض التي تفرز البكتيريا علم وظائف الأعضاء وتطوير الميكروبات المجاورة. وقد اتسمت العديد من نواتج الأيض للآثار الحيوية النشطة على الميكروبات الأخرى. وتشمل مثالين موصوفة وصفا جيدا المضادات الحيوية، والتي تمنع نمو الميكروبات الأخرى، والجزيئات الاستشعار عن النصاب القانوني، الذي يغير من التعبير الجيني العالمي من الميكروبات الأخرى. ومع ذلك، والبكتيريا تنتج العديد من المنتجات الأخرى الطبيعية جزيء صغير التي ليس لها bioactivities المعروف 1. نحن نفترض أن البكتيريا تطورت والحفاظ على القدرة على إنتاج بعض هذه المركبات لأنها تسمح لهم لتعديل الفيزيولوجيا الخلوية من الجيران الميكروبية في المجتمعات الميكروبية المعقدة التي توجد داخل معظم البكتيريا.

أنواع الخلايا العصوية الرقيقة

فقد ركزنا دراستنا على التفاعلات الميكروبية بوساطة كيميائيا التي تنطوي BacilLUS الرقيقة. هذا ليس فقط بسبب مكانتها باعتبارها البكتيريا إيجابية الجرام النموذج والأدوات الوراثية الناتجة المتاحة للتلاعب، ولكن أيضا بسبب قدرتها على التمايز إلى أنواع الخلايا تتميز. وتشمل الأمثلة الخلايا التي هي: السباحة؛ إنتاج المصفوفة خارج الخلية ما هو مطلوب لتشكيل بيوفيلم قوية؛ المختصة لتولي DNA من البيئة، وsporulating، من بين أمور أخرى 2. كل من هذين النوعين من الخلايا يعبر عن regulon النسخي المميزة التي تجعلها من الناحية الفسيولوجية و / أو جسديا متميزة من أشقائهم متطابقة وراثيا. في ظل العديد من الظروف النمو، أنواع الخلايا متعددة تتعايش مختلف المجموعات السكانية الفرعية كما في مستعمرة واحدة من B. الخلايا الرقيقة 3. على الرغم من أن العديد من أنواع البكتيريا قد تظهر مشابهة نوع من الخلايا عدم التجانس، فإن هذه الظاهرة لا سيما وقد درس جيدا في B. الرقيقة.

على وجه الخصوص، هي الجينات التي الاستعراض الدوري الشاملegulated داخل كل من هذه B. محددة وقد تم تحديد أنواع الخلايا الرقيقة. تحديد هذه الجينات upregulated ضروري لعمل الموصوفة هنا لأن الكثير من هذه الظواهر الميكروبية من الفائدة من الصعب أو من المستحيل مراقبة مباشرة. على سبيل المثال، لا يمكننا الكشف عن سمة بصريا مثل السباحة على الصلبة (1.5٪) لوحات أجار، على الرغم من جزء من السكان من B. الخلايا الرقيقة إنتاج سياط في ظل هذه الظروف 3. مثال آخر هو بيوفيلم مصفوفة الإنتاج. يمكن تصور إنتاج مصفوفة من قبل مستعمرة مورفولوجيا (كما أنه يؤدي إلى المستعمرات متجعد ظاهريا)، ولكن فقط على بعض المتوسطة النمو، وفقط بعد عدة أيام من النمو 4. ومع ذلك، من خلال معرفة الجينات التي upregulated خلال التمايز، يمكننا بناء صحفيين النسخي والتي تكون بمثابة علامات لتمايز الخلايا إلى أنواع الخلايا هذه.

بنيات مراسل

هذه ر الفلورسنتتتكون صحفيين ranscriptional من المروجين لجينات معينة الخلية نوع القيادة إنتاج الجين المراسل، على سبيل المثال بروتين فلوري. وتشمل الأمثلة P-YFP حاج (للسباحة الخلايا)، P-تابا YFP (للخلايا المنتجة للمصفوفة بيوفيلم)، وP-sspB YFP (لsporulating الخلايا)، حيث P س يشير إلى منطقة المروج لجين س. تتكامل هذه التركيبات مراسل في مكان محايد على كروموسوم (الشكل 1 و انظر أدناه) بحيث يتم ترك التنظيم الأم من النمط الظاهري سليمة. ومع ذلك، والآن عندما خلية يعبر عن هذا النمط الظاهري، فإنه يعرب أيضا عن بروتين فلوري. هذا يوفر تصور بسهولة قراءة من تفعيل سيما السلوك المظهري، مما يسمح لنا للكشف عن الميكروبات التي تستخدم لتنشيط هذه الاستجابة الفسيولوجية. على الرغم من أن مثل هذه صحفيين تستخدم عادة في علم الأحياء الدقيقة، فإنها لم تطبق على نطاق واسع في الشاشات لidentifوقد وصفت التفاعلات الأيضية ذ بين الميكروبات قبل هذه الطريقة 5.

هناك عدد من الاعتبارات المهمة في تصميم وبناء من نوع خاص خلية سلالات المراسل. لقد استخدمت صحفيين الفلورسنت النسخي حصرا، على الرغم من أن أنواع أخرى من بنيات ممكنة بالتأكيد. نحن لا نشجع استخدام اندماج متعدية كعلامات لنوع من الخلايا في التمايز الشاشة لدينا، ولكن لسببين: 1) الرغبة في مغادرة نوع معين من البروتين الخلية الأم رابط الجأش، و 2) الاعتراف بأن منتشر، خلية وسوف يكون من الأسهل مضان واسعة للكشف عن نقاط والمترجمة داخل الخلايا (مشتركة مع اندماج متعدية).

مراسل اختيار الجينات

بعد البت في استخدام النسخ باعتبارها من القراءة، يجب تحديد الجين مراسل (على سبيل المثال LacZ، مضان، أو luciferase المراسل). LacZ له ميزة خاصة التي تحتاج إلى أقلأوتوماتيكية معدات للكشف، ولكن هناك احتمال أكبر بكثير من ايجابيات كاذبة بين الميكروبات البيئية. في أيدينا، كان مستوى خلفية لاك + الكائنات بين الميكروبات في التربة باهظة عالية (>> كان 10٪ من الميكروبات في التربة الأزرق (لاك +) على لوحات X-غال؛ لا تظهر البيانات). فمن الممكن أنه من خلال المعايرة تركيز X-غال في المتوسط، يمكن أن يكون الأمثل لهذا تسمح باستخدام مراسل X-غال، على الرغم من أننا لم يحاول ذلك. يوفر luciferase المراسل حساسية عالية للكشف عن ومراسل معظم متعامد: هناك تقريبا أي فرصة من الميكروبات البيئية كونها الانارة بطبيعتها. ومع ذلك، وجدنا أنه من الصعب تحديد الأجهزة في مؤسستنا التي سمحت الكشف التلألؤ عبر لوحات بيتري بأكملها، كما تم تصميم معظم لمسح المناطق المترجمة فقط في لوحات متعددة جيدا. قد يكون هناك أيضا مضاعفات في تصور المستعمرات الانارة بطريقة تسمح أيضا الجسدية في وقت واحد هوolation الكائنات حمل. أثناء استخدام مؤتمنة قد جعلت هذا الأمر ممكنا، ونحن بدلا من ذلك انتخاب لاستخدام النسخي صحفيين الفلورسنت، والتي ثبت للعمل في B. الرقيقة، شريطة حساسية كافية للكشف وانخفاض معدلات إيجابية كاذبة بين الكائنات الحية في التربة، ويسمح لهم باستخدام الأجهزة المتوفرة بسهولة من كلا التصور وإجراءات العزل.

اختيار Fluorophore

سوف fluorophore محددة مختارة تعتمد على الأنواع البكتيرية الخاصة بك، والمتوسطة النمو أجار الذي تستخدمه، ومرشح مضان خاص يحدد المتاحة لديك. مع الأجهزة لدينا، وجدنا أن كلا من ب. الرقيقة مستعمرات أنفسهم وأجار كانوا نمت على معارضها أقل مضان الخلفية عندما استخدمت YFP (بروتين فلوري الصفراء) مرشحات، مما يجعل أن مراسل متفوقة على GFP (بروتين الفلورية الخضراء) في أيدينا. استخدام كودون من البروتينات الفلورية هيالأمثل في كثير من الأحيان لحقيقيات النوى، مما يجعل من المهم لاختيار fluorophore المعروفة إما من الأدب للعمل في الأنواع البكتيرية الخاصة بك، أو لاختباره بشكل صريح باستخدام المروج التأسيسية. وهناك عدد كبير من المتغيرات المتطورة باستمرار بروتين فلوري المتاحة حاليا 6، والتي تم استعراضها في عدد من المصادر 7،8، والبعض منها توفير التوجيه صراحة على اختيار بروتين فلوري المناسبة لتجربتك 9.

اختيار المروج

فإن اختيار المروج تعتمد إلى حد كبير على نوع من الخلايا أو النمط الظاهري في المصالح. للكائنات مثل B. الرقيقة، وقد وضعت بعض الخلايا من نوع الجينات مراسل محددة في الأدب. لسلالات بكتيرية أخرى، ودراسة البيانات ميكروأري أو النسخي وسوف يكون من الضروري توفير المعلومات حول الجينات التي upregulated للغاية في ظل الظروف حيث نوع من الخلايا اهتمامك طو تجلى. المفهرسة دراسة حديثة نسخ من B. الرقيقة تحت 104 ظروف النمو المختلفة باستخدام ميكروأرس تبليط 10. تقدم هذه الورقة معلومات شاملة عن الجينات التي upregulated للغاية في ظل ظروف مختلفة، والتي لا تقدر بثمن لأقل الظواهر تتميز جيدا.

بدلا من رسم خرائط دقيقة لمناطق المروج كل الجينات في المصالح، ونحن عادة ببساطة استخدام تسلسل غليان 200-500 المنبع من الجين كما المروج. طول التسلسل الدقيق يعتمد على السياق الجيني: وتستخدم المناطق أقصر عند الضرورة لتجنب بما في ذلك المناطق الترميز المنبع من إطارات القراءة المفتوحة المجاورة.

مواضع محايدة والتكامل

كيفية الحفاظ على بناء مراسل في السلالة البكتيرية الخاصة بك يصبح السؤال النهائي في تصميم الفلورسنت سلالة مراسل النسخي. في البكتيريا، وكثيرا ما تحتفظ الجينات ذات الاهتمامعلى البلازميدات باستخدام اختيار المضادات الحيوية. ومع ذلك، فإنه قد لا يكون من الممكن استخدام المضادات الحيوية خلال coculture دون قتل الميكروبات البيئية. إذا تمسك البلازميدات ثابت في الأنواع البكتيرية الخاصة بك، قد يكون من الممكن تنمو البكتيريا الخاصة بك تحتوي على مراسل المنقولة البلازميد في وجود المضادات الحيوية لإعداد المراسل الخاص لفحص، ومن ثم القضاء على المضادات الحيوية خلال coculture نفسها على أمل أن البلازميد سوف يتم الاحتفاظ بما فيه الكفاية للسماح لمضان. ومع ذلك، إذا فقدت البلازميدات بسهولة في البكتيريا، أو تضيع في ظل ظروف الإجهاد، وهذا لن يكون خيارا قابلا للتطبيق. في كثير من الحالات، فإن أفضل حل هو دمج بناء على مراسل الكروموسوم البكتيري، والذي يسمح صيانة مستقرة لمراسل حتى في غياب التحديد. من أجل التكامل لعدم تعطيل التعبير العادي أو تنظيم الجينات اهتمامك، ونحن نوصي الاندماج في موقع خارج الرحم على الكروموسوم الذي كاليفورنيان بمثابة "مكان محايد". في B. الرقيقة هذه المواقع التكامل هي الجينات التي - عندما تحور - ينقل النمط الظاهري في بعض وسائل الاعلام الحد الأدنى (السماح الكشف عن هويته integrants دون اختيار المضادات الحيوية)، ولكن لا يغير النمو أو معدلات تبوغ في الوسائط الغنية، وتشمل مثل هذه الجينات كما amyE، هلال، thrC، pyrD، gltA، وساكا (نقل القدرة على الاستفادة من النشا، β-galactosides، ثريونين، اليوراسيل، الغلوتامات، والسكروز، على التوالي) 11-13.

بينما التكامل في هذه الجينات قد استخدمت بشكل موثوق لسنوات عديدة في B. الرقيقة (وخاصة في amyE وهموم)، قد لا تكون متاحة للجينات في العديد من الأنواع البكتيرية الأخرى المعرفة مماثلة. استخدام مواقع الحجز فج هي البدائل كبيرة لمواقع التكامل الكروموسومات محايدة: لدينا العديد من أنواع محددة 14-16، وكذلك المواقع تكامل العامة مثل موقع المرفق Tn7 (تى تى Tn7)تم تحديدها واستخدامها لالإدراج الجينات في العديد من الأنواع البكتيرية 17،18.

الميكروبات البيئية

نستخدم التربة كمصدر مباشر من الميكروبات البيئية للشاشة coculture لدينا. يحتوي على التربة والتنوع عالية من الميكروبات، والعديد من هذه الكائنات الحية هي مصدر غني للمنتجات الطبيعية. باستخدام المعلقات السائلة وضعها مباشرة على لوحات لدينا الفلورسنت سلالة مراسل النسخي (دون العزلة مسبقة من البكتيريا من التربة)، ونحن تبسيط كبير في المنهج التجريبي. يمكن إما أن تستخدم التربة مباشرة بعد الحصاد، أو يتم تجميدها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. استخدام الفوري لديه ميزة أن تنوع أكبر من الميكروبات يمكن أن يحتمل زراعتها، بما في ذلك تلك التي لن تنجو تجميد جيدا. فمن لديه عيب أن تركيز الكائنات الحية في التربة الصالحة للزراعة من هذه العينات غير معروف، وزيادة عدد من لوحات الشاشة التي يجب استخدامها. ديلاستخدام عايد لديه ميزة أن وت م / مل لكل مصدر التربة يمكن تحديد مقدما، والسماح لعدد من المستعمرات الأمثل التي يمكن زراعتها على كل لوحة الشاشة. ومع ذلك، فإنه يتطلب أن تكون الكائنات الحية في التربة قادرة على البقاء التجمد.

نلاحظ أن تنويع تجمع محفز يجري بحثها (أي مصادر التربة) ويبدو أن يكون أكثر فعالية في تحديد التفاعلات بين الأنواع الجديدة من الفحص المتعمق على نفس التربة: لوحظ تنوع أكبر في النشوء والتطور الضربات المحددة في مصفوفة لدينا شاشة الحث على النحو تم فحص مصادر إضافية التربة بدلا من فحص مصادر التربة نفسها أكثر شمولا (EA شانك وR. Kolter، كلية الطب بجامعة هارفارد، نتائج غير منشورة).

نظرة عامة

النهج وصفنا هنا واضح وصريح من حيث المتطلبات التقنية. أنه ينطوي على: 1) بناء مراسل النسخي الفلورسنت في B. الرقيقة أوالأنواع البكتيرية الأخرى ذات الاهتمام، 2) تحديد الشروط التي لم يتم تنشيط هذا المراسل، 3) إعداد aliquots من هذه السلالة مراسل والكائنات ليتم عرضه (في التربة حالتنا، ولكن مصادر أخرى يمكن استخدامها بدلا من ذلك)، 4) خلط هذه مجموعتين من الميكروبات على وسائل الاعلام الصلبة، 5) تحديد وعزل المفترضة حمل الكائنات الحية، و6) مؤكدا أن هذه الكائنات لا بل تنشيط هذا النمط الظاهري في الشاشة الثانوية. مرة واحدة تم تحديدها، وهذه الكائنات الحية ونواتج تفاعلاتها تزويدنا بالأدوات الكيميائية لتعديل السلوك البكتيرية، لدراسة فسيولوجيا بكتيريا والتفاعلات الميكروبية، ويحتمل أن تكون للعمل السقالات الرواية بالنسبة للمركبات العلاجية في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحديد الجينات مراسل وبناء مراسل نيون الترانسكربتي

لB. الرقيقة:

  1. راجع المقالة إن الرب في اشارة 19 لبروتوكول تصف بناء صحفيين الفلورسنت النسخي في العصوية الرقيقة.

الأنواع البكتيرية الأخرى:

  1. تحديد الجين الذي تم upregulated خلال الاستجابة الفسيولوجية من الفائدة. وهذا يمكن أن تستند إلى تحليل الأدب القائمة أو النسخي للميكروب في ظل ظروف معينة.
  2. بناء مراسل النسخي الفلورسنت لهذا الجين ليكون بمثابة وكيل للتغيير في النمط الظاهري. وينبغي أن يشمل هذا بناء المروج من هذا الجين upregulated القيادة إنتاج بروتين فلوري المناسب (انظر الشكل 1).
  3. دمج هذه التركيبة في مكان محايد على الصبغي. هذا يضمن أن ريج الأملا تعطل ulation من الجينات في المصالح، ويتجنب الحاجة إلى آليات اختيار البلازميد (مثل المضادات الحيوية) التي قد تتداخل مع نمو الميكروبات البيئية.

2. تحديد شروط Coculture

لB. الرقيقة P-تابا YFP مراسل:

  1. استخدام 0.1X LB، لينوكس (1 ز تريبتون، 0.5 ز خلاصة الخميرة، 0.5 غرام لكل لتر كلوريد الصوديوم) المتوسطة لهذا المراسل، منذ B. الرقيقة مصفوفة الإنتاج هو الحد الأدنى لوريا على مرق 20. هذه الوسيلة تسمح B. المستعمرات الرقيقة لتنمو إلى حجم يمكن ملاحظتها دون المليمتر ولكن، في الوقت الذي تسمح أصناف متنوعة من التربة لتنمو 5.
  2. تشمل 100 ملي اجتماعات الأطراف العازلة للحد من تغييرات درجة الحموضة المحتملة.

الأنواع البكتيرية الأخرى:

  1. استخدام البيانات المنشورة النسخي أو تجريبيا اختبار الظروف الثقافة المختلفة لتحديد واحد حيث ينمو الميكروب ولكن activatioن لمراسل الفلورسنت لا يكاد يذكر (للسماح تفعيله ليتم الكشف عن عندما يزرع سلالة مراسل في coculture مع الميكروبات حمل.)
  2. استخدام المتوسطة مع المحتوى الغذائي منخفض (نسبة إلى وسائل الإعلام الميكروبيولوجية الغنية تقليديا) عند فحص الميكروبات البيئية من البيئات الشحيحة (مثل التربة)، لأن العديد من البكتيريا الشحيحة التي لا تنمو عندما قدم مع ظروف غذائية عالية 21. وسيط المغذيات منخفضة يقلل أيضا من حجم مستعمرة، وزيادة الإنتاجية من الشاشة.
  3. تحديد المتوسطة مع انخفاض مضان الخلفية وضوح بصري جيد.
  4. تحسين درجة حرارة النمو للسماح كلا من سلالة مراسل والميكروبات البيئية في النمو في وقت واحد.
  5. النظر في إضافة وكيل التخزين المؤقت. فإن استخدام عازلة في لوحات الحد من إمكانية اكتشاف التغيرات في الرقم الهيدروجيني بوساطة الفيزيولوجيا 22، ما لم يكن هذا التفاعل هي التي تهم.

3. إعداد مراسل مأخوذة

لB. الرقيقة P-تابا YFP مراسل:

  1. خط مراسل سلالة من -80 ° C الأسهم المجمدة على طبق من ذهب LB الطازجة باستخدام مسواك العقيمة أو قضيب عصا.
  2. تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  3. أداء التخفيفات التسلسلي في الثقافة السائل لتقليل مضان الخلفية الناشئة عن النمو على وسيط الصلبة:
    1. تطعيم ثقافة السائل 5 مل من LB وتنمو مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية.
    2. عندما تصل الثقافة إلى OD 600 ~ 0.6، يخفف إلى 5 مل LB الطازجة إلى OD 600 من 0.02.
    3. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية مع اهتزاز مرة أخرى حتى يصل الثقافات OD 600 ~ 0.6.
    4. تكرار التخفيفات النمو المسلسل مجموعه 3X.
    5. دعونا الثقافة التخفيف المتسلسل النهائي تنمو إلى OD 600 ~ 0.4.
  4. إضافة الجلسرين إلى 15-20٪.
  5. قسامة 50-200 ميكرولتر إلى 0.5 مل أنابيب microfuge وتجميد في -80 درجة مئوية.
  6. أماهكه مأخوذة يعادل لسلالة الأم nonfluorescent لمراسل (وسوف تكون هناك حاجة خلال الفحص الثانوي).

الأنواع البكتيرية الأخرى:

  1. استخدام الخلايا التي تحتوي على مضان خلفية منخفضة (أي تزرع في ظل ظروف حيث هناك القليل من التعبير المروج المستخدمة في المراسل).
  2. جعل وتجميد مأخوذة تحتوي المعروف وت م / مل (مستعمرة تشكيل وحدة في مل) من سلالة مراسل بحيث يمكن زراعتها عدد مناسب من المستعمرات على كل لوحة الشاشة coculture (انظر المقطع أعلاه للحصول على التفاصيل).
  3. جعل مأخوذة يعادل لسلالة nonfluorescent الأم (أنها سوف تكون مطلوبة أثناء الفحص الثانوي).

4. الحصول على عينات التربة

  1. جمع التربة إلى أنابيب مخروطية معقمة أو أكياس معقمة باستخدام ملعقة، ونبذ أعلى 0.5 سم من التربة السطحية المكشوفة.
  2. إضافة ملحي معقم (0.85٪ كلوريد الصوديوم) بنسبة 10 مل لكل 1 غراممن التربة لجعل الطين التربة.
  3. حدد طريقة لطرد البكتيريا من جزيئات التربة: أ) استخدام الفوري من عينة طازجة أو ب) استخدام تأخير بعد تجميد العينة.
    1. للاستخدام الفوري، الطين دوامة لمدة 1 دقيقة.
    2. للاستخدام المتأخر، مزج الطين التربة في الخلاط لمدة ثلاث دورات 1 دقيقة، ووضع جرة خلاط على الجليد لمدة 1 دقيقة بين مساند دورات مزج.
  4. دعونا الطين التربة تسوية ل~ 1 دقيقة.
  5. نقل الطبقة المائية العليا لأنبوب جديد.
  6. إضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 15-20٪.
  7. قسامة 50-200 ميكرولتر إلى 0.5 مل أنابيب microfuge وتجميد في -80 درجة مئوية.

5. تحديد وت م / مل من اللبن مراسل ومأخوذة التربة

  1. ذوبان الجليد والتربة ومراسل قسامة المجمدة. يمكن إذابة الميكروبات في التربة على الجليد. لأن B. الرقيقة lyses في 4 درجات مئوية، يجب إذابة تلك مأخوذة بسرعة في RT لتقليل الوقت الذي يقضيه في درجة حرارة منخفضة.
  2. جعل اثنين من تكرار الدوري الايطاليالتخفيفات لتر (10 -8) في 0.1X LB أو غيرها العازلة متساوي التوتر.
  3. لوحة 5 البقع ميكرولتر من كل تخفيف المسلسل على لوحات أجار من نفس المتوسطة التي سيتم استخدامها لفحص coculture.
  4. تنمو في RT (أو درجة الحرارة التي سوف تستخدم لفحص).
  5. في اليوم التالي، عد عدد من المستعمرات في كل بقعة وحساب وت م / مل من كل من مأخوذة المجمدة.

6. تأكيد قسامة تركيزات لوحات شاشة انتشار

  1. ذوبان الجليد قسامة المجمدة كما في الخطوة 5.1.
  2. تمييع إلى 1 × 10 5، 2.5 × 10 5، 5 × 10 5، 1 × 10 6، و 2.5 × 10 7 خلية / مل.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من كل بقعة التخفيف إلى مركز لوحات فردية. وينبغي لهذه الغلة لوحات مع الأمثل المحسوب ل25،000 المستعمرات في لوحة، وكذلك 2 - و 5 - أضعاف أكثر وأقل، مما يتيح أفضل التخفيف الفعلي يحدد لاحقا.
  4. إضافة حوالي 20 زجاجية معقمة (3 مم) حبات من قبل التنصت بلطف لهم على طبق من ذهب. توفير مزيد من الخرز حتى توزيع المستعمرات عبر لوحة من الزجاج رش عازمة لا.
  5. تنتشر الخلايا عن طريق الحفاظ على لوحات الفوق ويهز لهم ذهابا وإيابا، وتناوب عليها أثناء العمل، حتى يتم امتصاص السائل. لا تستمر يهز حبات مرة واحدة لوحة جافة، وإلا فإنه سوف تبدأ لقتل البكتيريا.
  6. الوجه وحات مرارا وتجاهل حبات في كوب النفايات المحتوية على الإيثانول.
  7. السماح لوحات تنمو في هذا الوقت من فحص الخاص بك (على سبيل المثال 24 ساعة) في درجة الحرارة الصحيحة للفحص الخاص بك (على سبيل المثال 24 ° C / RT).
  8. باستخدام المجسام تشريح، حساب عدد المستعمرات في اثنين أو أكثر من حقول نظر.
  9. حساب عدد المستعمرات في المنطقة، وتحديد كيفية العديد من المستعمرات هي على كل لوحة.
  10. ضبط التخفيفات في المستقبل عند الضرورة. العدد الفعلي للمستعمرات ليس مهما مثل وجود نفس العدد في كل لوحة شاشة قابلة للمقارنة.

= "jove_title"> 7. إعداد لوحات Coculture

  1. ذوبان الجليد قسامة مراسل (وقسامة التربة إذا جمدت) كما في الخطوة 5.1.
  2. تمييع مراسل (لتركيزات الأمثل في القسم 6) في 0.1X LB أو غيرها من المواد الغذائية المنخفضة، حل متساوي التوتر.
    1. لالتربة المجمدة: تمييع لتركيز الأمثل في الفرع 6 في 0.1X LB أو غيرها من المواد الغذائية المنخفضة، حل متساوي التوتر.
    2. لتربة جديدة: جعل التخفيفات من الطين التربة جديدة، استنادا إلى التنبؤ بأن وت م / مل من الطين التربة يمكن أن تتراوح بين 10 -4 إلى 10 -9 وت م / مل.
  3. بقعة 50 ميكرولتر من التربة ومراسل التخفيفات على المركز من لوحة الشاشة coculture. أيضا، لوحة التربة وحده وحده ومراسل والضوابط.
  4. انتشر استخدام الخرز الزجاجي كما هو موضح في الخطوة 6،4-6،6.
  5. إذا كانت هناك ظروف النمو المعروفة التي تنشط الخاص الفلورسنت المراسل، أو لوحة خط مراسل الخاص في ظل هذه الظروف وتنمو لاستخدام كعنصر تحكم إيجابية خلال الفرز. احتضان عند 24 درجة مئوية لمدة 24 - 28 ساعة (أو حسب الاقتضاء لجهودكم مراسل / الفحص)

8. لوحات الشاشة CoCulture لالإسفار

  1. باستخدام إضاءة brightfield، والتركيز المجسام بحيث المستعمرات حادة.
  2. ننظر إلى لوحات التربة فقط لتحديد ما إذا كان عينة التربة الخاصة بك قد autofluorescent المستعمرات. إذا كان الأمر كذلك، قد تؤدي هذه التربة في نسبة عالية من ايجابيات كاذبة (مع زيادة مصاحبة في الفحص الثاني).
    1. استخدام نسبة عالية من مراسل: التربة في لوحات coculture لزيادة فرصة أن محفز سوف تكون محاطة المستعمرات مراسل متعددة، مما يقلل من فرصة وسوف يتم الكشف عن ايجابيات كاذبة كما هو و(الشكل 2).
    2. استخدام بروتين فلوري مختلفة (واحد التي تنبعث في قناة مختلفة).
  3. تحديد توقيت الفحص. بالنسبة لمعظم الصحفيين جديدة، توقيت الاستقراء المحتملة غير معروف، وبالتالي يجب أن تحدد تجريبيا.
    1. بدء الكشف عن مضان في أقرب وقت أصبحت المستعمرات واضحة للعيان مع المجسام تشريح (التكبير 30X ~) ومواصلة النظر في لوحات بشكل دوري حتى توقف النمو و / أو يصبح مضان الخلفية عالية جدا.
    2. مرة واحدة يتم تحديد النافذة وقت الحث المحتملة لمراسل وجه الخصوص، ينبغي أن تكون مماثلة لجميع لوحات تحتوي على coculture أن المراسل، وتبسيط رصد لوحات الشاشة. لB. مراسل الرقيقة P-تابا YFP، والوقت المناسب للنظر في لوحات ما بين 24-28 ساعة بعد طلاء الخلايا، وبالنسبة للB. P الرقيقة مراسل sspB-YFP، فمن بين 26-32 ساعة من النمو.
  4. تعظيم حساسية مضان الخاصة بك:
    1. ضمان مضان الخاص تشريح نطاق هو في غرفة مظلمة أو محاطة ستائر التعتيم. سوف تحريض من المرجح أن تكون أقل كثافة من FP أنتجت جوهري ويتطلب سينسي أكبرtivity للكشف.
    2. إتاحة الوقت للمصباح مضان لتحقيق الاستقرار وعينيك على التكيف مع الظلام قبل محاولة للكشف عن مضان من لوحات coculture الخاص بك (على الأقل 1-2 دقيقة).
  5. باستخدام مراقبة إيجابية (إذا كان لديك واحدة)، تأكد من أن التكبير الذي تستخدمه يسمح لك لاكتشاف مضان. التكبير هو عادة أفضل إذا مجال نظرك ما يقرب من 30-50X الخاص قطر مستعمرة نموذجية (200-400X).
  6. إيقاف الضوء الساطع وفتح مصراع لمضان الخاص بك.
  7. بعد عينيك عدلت إلى الظلام، التحرك ببطء لوحة ذهابا وإيابا عبر حقل نظرك، وتبحث عن النقاط المضيئة.
    1. تبدأ من أعلى لوحة واستخدام نمط متعرج لنقل جنبا إلى جنب لوحة وأنت تتحرك نحو الجزء السفلي من اللوحة.
    2. الممارسة تتحرك لوحة في brightfield للحصول على شعور لكيفية ببطء للانتقال إلى لوحة، والتأكد من أنك تغطي سور بأكملهاتواجه المنطقة.
    3. نقل لوحة ببطء يكفي أن المستعمرات لا تصبح ضبابية. فمن الأفضل أن oversample السطح بدلا من المناطق تفوت.
    4. بعد الاجتياح الكامل واحد، وتحويل لوحة 90 ° وتكرار. العين البشرية هي جيدة بشكل ملحوظ في الكشف عن مضان خافت حتى من خلال هذا الأسلوب.
  8. إذا كنت الكشف عن مضان، يتوقف عن الحركة لوحة والعودة والعثور على منطقة الفلورسنت.
  9. تحويل brightfield على ببطء، تحديد ما إذا كان يرتبط مضان مع مستعمرة بكتيرية (وليس المخلفات التربة autofluorescent أو مكونات وسائل الإعلام). إذا كان الأمر كذلك، المستعمرات nonfluorescent الأقرب إلى مستعمرة الفلورسنت هي كائنات حمل المفترضة.

9. عزل المزعومين الإقناع الكائنات

  1. وقد تم تحديد مرة واحدة بفعل (الفلورسنت) المستعمرات، وعزل تلك المستعمرات إفراز مركبات حمل.
    1. إذا كان تركيز عال بما فيه الكفاية من المستعمرات مراسل تتزايد على لوحة(> 0.5:1 مراسل: وت التربة)، وسوف يكون محاطا المستعمرات على حث المفترضة من قبل المستعمرات الفلورسنت متعددة (مرة أخرى، انظر الشكل 2).
    2. في الحالات التي يكون فيها تعقيد النمو coculture يجعلها غامضة والتي هي مستعمرة محفز، عزل عدة مستعمرات على حث المحتملة لاختبار لاحقة في الشاشة الثانوية.
  2. توطين المستعمرات كنت ترغب في اختيار في مركز مجال الرؤية.
    1. إذا كانت قريبة إلى حافة اللوحة، وتناوب لوحة بحيث الشفة من لوحة بعيدا عن يدك المهيمنة (أي إذا كنت اليد اليمنى، ووضع الشفة من لوحة على اليسار). هذا يسمح لك الاقتراب من المستعمرات في زاوية منخفضة، مما يحسن من دقة التقاط الخاصة بك.
  3. وضع لوحات جديدة لخط الكائنات حمل المفترضة إلى مكان قريب، وكذلك كوب النفايات لتجاهل نصائح المستخدمة في.
  4. مغادرة مصباح مضان على، وتحويل الضوء الساطع ببطءعلى، حتى يتسنى لك أن تكون قادرة على تحديد (عن طريق الشكل والموقف)، ومستعمرة الفلورسنت والكائنات المحيطة حمل المفترضة. قد تحتاج إلى الانتقال ذهابا وإيابا مع ضوء عدة مرات لتكون قادرة على التعرف على مستعمرات كنت ترغب في اختيار عندما لا يكون هناك مضان والضوء الساطع فقط.
  5. استخدام قضيب الزجاج (200 ملم طولا × 5 مم قطر) لالتقاط العقيمة، على مدار 200 ميكرولتر طرف جل التحميل والاحتفاظ بها مثل قلم رصاص. هذا هو أداة قطف سوف تستخدم لعزل المستعمرات الفردية.
  6. بقية النخيل الخارجي الخاص بك ضد المرحلة لتحقيق الاستقرار على سطح العمل. وضع يدك الأخرى على الداخلية، الجانب إبهام يدك لتحقيق الاستقرار أداة قطف الخاص بك.
  7. إذا لزم الأمر، والوجه مرة أخرى بين وجهات النظر ومضان brightfield لتحديد المستعمرات كنت ترغب في اختيار.
  8. حفظ غيض ماصة فوق سطح لوحة، وتحريكه في مجال نظرك وتركز ذلك فوق مستعمرة كنت ترغب في اختيار. وسوف يكون غيض من التركيز.
  9. باستخدام الحافة الخارجية من يدك (والذي يستريح على المسرح المجهر أو سطح العمل)، الإرتكاز غيض ماصة ببطء وصولا الى مستعمرة ويمكن الحصول عليها. مسها طفيفة جدا، في محاولة للحد من كيفية العديد من المستعمرات الأخرى الاتصالات غيض.
  10. دون تناوب أداة قطف، خط على جزء من لوحة جديدة. تنتشر مع لمسة ناعمة لتجنب تلاعب آغار. لأن عدد الخلايا نقلها بواسطة هذه الطريقة هي صغيرة جدا (المستعمرات هي أصغر بكثير من التلاعب عادة)، سوف يشكل حلقة في سلسلة متواصلة واحد يؤدي إلى مستعمرات معزولة.
  11. كرر هذه العملية مع غيرها من الكائنات الحية على حث المفترضة.
  12. احتضان لوحات عند 24 درجة مئوية (أو درجة حرارة الفحص الخاص بك).

10. خط المزعومين الإقناع الكائنات الحصول المستعمرات المعزولة واحدة

  1. باستخدام المجسام، وتحديد - على أساس هيكل مستعمرة أو التشكل - ما إذا كانت هناك أنواع مختلفة مستعمرة الواردة في كل من دائرة الهجرة والجنسية الخاصة بك التقطت المفترضةucing الكائنات الحية.
    1. ننظر المستعمرات باستخدام المرحلة حيث يمكنك إلقاء الضوء على المستعمرات من كل من أعلاه، وكذلك من الأسفل للكشف عن الاختلافات مستعمرة المحتملة.
  2. Restreak كل نمط شكلي مختلفة على لوحة جديدة واحتضان حتى نمت.
  3. Restreak احد مزيد من الوقت والسماح النمو. إذا استمرت morphotypes مختلفة، والاستمرار في restreak إلى النقاء.

11. إعادة اختبار المزعومين الإقناع الكائنات في الشاشة الثانوية

  1. إعادة اختبار جميع الكائنات الحية حمل المفترضة في الشاشة الثانوية لتحديد ما يتم تفعيل النسخي مراسل الفلورسنت. تتكون الشاشة الثانوية حشيش microcolonies من الفلورسنت سلالة مراسل النسخي، جنبا إلى جنب مع لوحات التحكم، والتي يتم تصحيحها على الكائنات الحية حمل المفترضة أو رصدت.
  2. تشكيل ثلاث لوحات مماثلة: واحدة تحتوي على العشب مستعمرة مجهرية من الفلورسنت سلالة مراسل النسخي (في نفس التركيز وكان يستخدم خلال الفحص coculture ق)، واحدة تحتوي على العشب مستعمرة مجهرية من نوع السلالة البرية الوالدين دون مراسل مضان، واحدة لا تحتوي على الحشيش.
    1. بمناسبة قمة الجزء الخلفي من كل لوحة لتحديد اتجاه اللوحة.
    2. إضافة علامات الموضعية للبقع / البقع، ويمكن اختبار ما يصل إلى عشرة الكائنات حمل المفترضة على كل مجموعة من لوحات (الشكل 3).
    3. مأخوذة العشب ذوبان الجليد (مراسل وسلالة الأم nonfluorescent) كما في الخطوة 5.1.
    4. نشر 50 ميكرولتر من التخفيف 5 × 10 5 خلية / مل على لوحات في الحديقة (أو التخفيفات الأمثل غيرها) باستخدام الخرز العقيمة كما في الخطوة 6.4.
    5. السماح لوحات الجافة.
  3. التصحيح أو بقعة المفترضة حمل الكائنات الحية:
    1. حدد الترقيع إذا كان المطلوب اتباع نهج أسهل وأسرع، وكان مقبولا لديها عدد أقل دقة من الخلايا المودعة. لرأب الصدع:
      1. لمس مسواك العقيمة إلى المستعمرة لاختبار - لا تلتقط كل الخلايا.
      2. التصحيح (جعل خط صغير) على لوحة فارغة.
      3. كرر التصحيح مع مسواك جديدة على لوحة المراسل.
      4. كرر التصحيح مع مسواك جديدة على لوحة التحكم.
    2. حدد اكتشاف إذا كان المطلوب نهج الكمي وقابلة للتكرار. اكتشاف يسمح عدد الخلايا المودعة إلى أن تطبيع (أنظر المرجع 5 للحصول على تفاصيل كاملة)، ويسمح للقوة النسبية للكائنات الحية على حث مختلفة ليتم مقارنتها. على الفور:
      1. في resuspend المفترضة حمل الكائنات الحية في 1 مل من السائل في وسائل الإعلام كفيت بلاستيكية معقمة.
      2. اتخاذ OD 600 من resuspensions.
      3. باستخدام الصيغة X = 250 ÷ (OD 600-،5)، إضافة X حجم إعادة تعليق لكل 500 ميكرولتر من السائل المتوسطة للحصول على حل مع OD 600 من 0.5. هذه الطريقة يبسط الخطوات المطلوبة عند تنفيذ pipetting لالتخفيفات متعددة لتطبيع OD في أنه يمكنك استخدام نفس حجم (500 ميكرولتر) لجميع dilutants الخاص بك.
      4. بقعة 1 ميكرولتر من كل إعادة تعليق OD-تطبيع إلى كل من لوحات الثلاثة.
  4. اسمحوا ينمو بمعدل 24 درجة مئوية لمدة 24-28 ساعة (أو حسب الاقتضاء لجهودكم مراسل / الفحص).
  5. استخدام المجهر الفلورسنت تشريح لتحديد الكائنات حمل المفترضة التي تنشط الخاصة بك سلالة مراسل الفلورسنت ولكن ليس لديك سلالة الرقابة الأبوية. هذه العزلات هي الفعالية إيجابية الخاص - الميكروبات البيئية التي تفرز مركبات التي تحفز على النمط الظاهري اهتمامك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام هذه الشاشة لتحديد الكائنات الحية في التربة إفراز مركبات التي تغير فسيولوجيا B. الرقيقة. نتائج وصفها هنا التركيز على نوع من الخلايا المنتجة للمصفوفة B. الرقيقة، التي تنتج البروتين وexopolysaccharide التي مطلوبة من أجل تشكيل بيوفيلم قوية في هذه البكتيريا. اخترنا المروج من الاوبرون تابا-sipW-تاسا لدينا بناء مراسل الفلورسنت (P-تابا YFP). هذا الاوبرون بترميز البروتين المكون الهيكلي للمصفوفة وupregulated خلال الإنتاج بيوفيلم مصفوفة 23. شيد لدينا مراسل مصفوفة (الشكل 1) كما هو موضح سابقا 19.

وقد أظهرت الأعمال السابقة التي B. الرقيقة تنتج مصفوفة ردا على النصاب، مثل الاستشعار عن جزيء surfactin الذات المنتجة، وكذلك نواتج تنقية تنتجها بكتيريا التربة الأخرى 20. ونحن مهتمون في توسيعالدراسات ذاتها للتحقيق على نطاق أوسع مما جعل التربة الميكروبات الأيض قادرة على إحداث إنتاج مصفوفة في B. الرقيقة. انتخبنا لاستخدام مخفف LB للنمو، لأن هذا كان معروفا بالفعل المتوسطة أن تؤدي إلى ضعف إنتاج مصفوفة 20، تزويدنا حالة النمو حيث كانت سلالة مراسلنا nonfluorescent. نحن ثم الأمثل لعدد من المستعمرات المناسبة لفحص النمو في ظل هذه الظروف. من أجل تحسين كل لوحة الشاشة، فمن الضروري تحديد كيفية العديد من المستعمرات تنمو من التربة ومراسل مأخوذة المجمدة وما تركيز مناسب من المستعمرات والشروط هي المغذيات. من الناحية المثالية نريد كل لوحة coculture لاحتواء عدد مساو من التربة ومراسل المستعمرات (أي نسبة 1:1 من مراسل: التربة)، وأن تكون متباعدة عن كثب، والمستعمرات الفردية. هذه النسبة العالية من المستعمرات مراسل يزيد من احتمال أن محفز سيتم تنشيط متعددة المستعمرات مراسل المحيطة. وجود تيار متعددةالمستعمرات محفز tivated المحيطة الثقة زيادات محفز مستعمرة المفترضة في إبراز الكائن على حث الفعلية (الشكل 2). المحتوى الغذائي يسيطر على مدى تشكيل النمو / مستعمرة في حين أن التخفيف من يحدد ما إذا كان اللقاح المستعمرات الناتجة منتشرة بشكل مناسب. على مستوى 10 سم القطر بيتري لوحة متوسطة منخفضة مع المواد الغذائية، وجدنا أن ما يقرب من 25،000 المستعمرات الإجمالية لكل لوحة المقدمة (50 ميكرولتر من 5 × 10 5 خلية / مل التخفيف) أفضل فصل B. الرقيقة المستعمرات على 0.1X LB اجتماعات الأطراف المتوسطة (الشكل 4).

على الرغم من أن يحسب وت م / مل من التخفيفات المسلسل يوفر تركيز تقريبي من البكتيريا في مأخوذة، فمن الضروري لضمان تركيز المستعمرات الناتجة من المناسب عندما ينتشر لوحة كامل مع الخلايا. ويحسب وت / لوحة والفعلية وت م / لوحة ليست دائما متطابقة (الشكل 4

بعد إعداد مأخوذة من مراسل والتربة، ونحن مختلطة منهم على لوحات الشاشة coculture وفحصها لهم لمضان باستخدام المجسام (الشكل 5). نحن أيضا مطلي الضوابط التي تم تلقيح فقط إما مع التربة أو B. الرقيقة P-تابا YFP سلالة المراسل. B. الرقيقة تنتج مصفوفة بيوفيلم (مضان) ردا على العديد من الميكروبات من التربة كما يراها المستعمرات الفلورسنت في الصورة coculture في الشكل 5. لالتربة درسنا، كان لدينا ارتفاع معدلات ضرب لمراسل P-تابا YFP. كما هو موضح في إشارة 5، وبين 12-67٪ من العزلات (من ست عينات مختلفة من التربة) لديها القدرة على ايندوم مضان في سلالة مراسل P-تابا YFP. هذا هو على النقيض من نتائج غير منشورة لدينا من شاشات مماثلة باستخدام تبوغ (P-sspB YFP) والكفاءة (P-comG YFP) للصحفيين. بعد الفحص واسعة (> 200،000 المستعمرات لكل مراسل)، تم تحديد الكائنات اثنين فقط التي تحفز على تبوغ، في حين تم تحديد أي التي تحفز الكفاءة. وبالتالي، وتكون معدلات ضرب لأنواع مختلفة من الخلايا متغير بدرجة كبيرة، وربما يكون من الصعب التنبؤ مقدما.

نحن بعد ذلك التقطت الفردية المستعمرات على حث المفترضة. المستعمرات على لوحات الشاشة coculture صغيرة جدا على المدى المتوسط ​​منخفض بالمغذيات نوصي (قطر دون المليمتر). ومع ذلك، فمن الممكن أن يلتقط بدقة وعزل مستعمرات صغيرة جدا باليد (الشكل 6) من داخل معقدة لوحة الشاشة coculture. الطريقة اليدوية التي نستخدمها بشكل بسيط ويتطلب أدوات متخصصة ولا لا لهب التعقيم. هذه المستعمرات محفز المفترضة ثم يتم restruck إلى العزلة. لأن تزدحم لوحات coculture مع المستعمرات، فإنه ليس من غير المألوف - حتى مع تقنية قطف حذرين للغاية - أن يكون كائن واحد أو أكثر من كل عينة المتزايد محفز المفترضة. دراسة متأنية يجب أن تسمح عزل المستعمرات متميزة شكليا. ثم يتم اختبار جميع الكائنات حمل المفترضة في الشاشة الثانوية. وتظهر النتائج الإيجابية والسلبية على حد سواء من التصحيح وطريقة بقعة في الشكل 3. النظر في نموها كثيفة، فإن قدرتنا على جمع جسديا حمل المستعمرات من لوحات coculture كانت جيدة جدا، مع ما يقرب من 50٪ من المستعمرات درست في الشاشة الثانوية جودنا ايجابيات صحيح. نتائج إضافية من هذه الشاشة، فضلا عن متابعة العمل الناشئة عن ذلك تم وصفها سابقا 5.

/ ftp_upload/50863/50863fig1.jpg "/>
الشكل 1. مراسل النسخي الفلورسنت بناء. يمثل البيضاوي الأزرق خلية البكتيرية وخط متقطع يمثل كروموسوم لها. يوضح هذا المثال مراسل النسخي الفلورسنت لإنتاج المصفوفة. لا يزال موضع الأم سليمة (P مصفوفة مصفوفة، حيث "P" والسهم يشير إلى منطقة المروج)، في حين يتم إدراج بناء مراسل (P-YFP المصفوفة) في أماكن أخرى من كروموسوم في مكان محايد.

الرقم 2
الشكل 2. الأمثلة المثالية من نتائج الفحص coculture مع نسب مختلفة من المراسل: الميكروبات البيئية. A) عن طريق مراسل منخفض: نسبة الميكروب البيئية يؤدي إلى مزيد من الغموض في تحديد الكائنات حمل المفترضة من عند Bأ) مراسل عالية: ويستخدم نسبة الميكروب البيئية. تمثل الدوائر البني الكائنات الحية في التربة، وتمثل الدوائر الحمراء حمل الكائنات الحية في التربة، وتمثل الدوائر الزرقاء المستعمرات مراسل uninduced، وتمثل المستعمرات الخضراء المستعمرات مراسل يسببها. الخطوط الحمراء المتقطعة تشير إلى دائرة نصف قطرها عمل الأيض حمل. نجوم تشير إلى المستعمرات nonfluorescent ذلك - على أساس قربها من المستعمرات الفلورسنت - هي كائنات حمل المفترضة وينبغي أن ينتبه واختبارها في الشاشة الثانوية.

الرقم 3
الرقم 3. الشاشة الثانوية. ألف وباء) الخطط لكيفية توزيع مصححة أو يعزل رصدت على لوحات الشاشة الثانوية، على التوالي، لB. الرقيقة مراسل المصفوفة. قد تكون هناك حاجة تباعد أكثر سخاء للصحفيين آخرين أو العزلات حمل، إقلاعتنتهي في الإنتشارية من المركبات النشطة. C و D) ممثل النتائج من التربة مصححة يعزل التي هي سلبية وإيجابية، على التوالي، لإحداث B. الرقيقة P-تابا YFP-المراسل. لوحات أعلى هي الصور brightfield؛ وحات أقل هي الصور مضان. شريط النطاق هو 1 مم. E) سلبي ونتائج إيجابية من التربة رصدت يعزل لنفس المراسل. شريط النطاق هو 2 مم.

الرقم 4
الشكل 4. تحديد تركيز مستعمرة مجهرية. توزيع وحجم المستعمرات الخاص بك سوف تعتمد على حد سواء على تركيزات المغذيات والخلية. أ) الاختلافات في نمو B. الرقيقة على 0.01x LB (الصف العلوي) مقابل 0.08x LB (الصف السفلي). الخلايا على 0.01x LB لا تشكل في microcolonies، في حين ر خرطوم على 0.08x LB القيام به. (لاحظ أن لشاشاتنا قمنا بزيادة مستويات المغذيات قليلا عن تلك التي تظهر هنا: من 0.08x LB إلى 0.1X LB) هذه الصور هي من البقع 1 ميكرولتر من التخفيفات في 01:05 متتابعة المعروف وت م / مل. أن استقراء من هذه التركيزات، للحصول على توزيعات مماثلة من مستعمرات عبر لوحة 10 سم بيتري تتطلب الطلاء (من اليسار): 3،200،000؛ 640،000؛ و128،000 مجموع وت م لكل لوحة. ومع ذلك، اكتشاف النتائج في التوزيع غير المتكافئ للخلايا (تتركز عند حواف البقعة) بالمقارنة مع انتشار الخلايا على لوحة كاملة. وهكذا، مرة واحدة يتم تحديد تركيز المغذيات، فمن المهم دراسة لوحات انتشرت مع مجموعة متنوعة من التركيزات. شريط المقياس هو 0.1 ملم B) تظهر هذه الألواح نتائج ينتشر (من اليسار) 50،000؛ 25،000؛ و5،000 وت الإجمالية لكل لوحة على لوحات 0.08x LB. من هذه الصور، اخترنا 25،000 كرقم هدفنا من وت م / لوحة. شريط المقياس هو 0.1 ملم.

في صفحة = "دائما"> الرقم 5
الرقم 5. Coculture من B. الرقيقة P-تابا YFP مختلطة مع الكائنات الحية في التربة. تراكب من brightfield وصورة مضان من لوحة الشاشة coculture تحتوي على B. الرقيقة P-تابا YFP مراسل مصفوفة مختلطة مع الكائنات الحية في التربة. رأس السهم يشير إلى محفز المفترضة محاطة microcolonies مراسل مضان. شريط النطاق هو 1 مم.

الرقم 6
الرقم 6. مظاهرة من جدوى عزل المستعمرات البكتيرية صغيرة من لوحات coculture. ألف وباء) هذه اللوحات تظهر حقلين نظر تحتوي على لوحات أجار المجتمعات الميكروبية معقدة من التربة. مستعمرات صغيرة مثل 0.1 ملم يمكن أن تكون معزولة باستخدام تقنية التقاط وصفهاهنا. لوحات أعلى هي مجال الرؤية قبل قطف مستعمرة، واللوحة السفلية هي نفسها مجالات العرض بعد قطف مستعمرة. تشير السهام الحمراء حيث تم إزالة الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

واحدة من القيود المتأصلة في هذا البروتوكول هو أنه يعتمد على cultivability الكائنات الميكروبية. كما تم توثيقه جيدا 24، معظم الحياة الميكروبية على هذا الكوكب لا يمكن (حتى الآن) يمكن زراعتها تحت ظروف زراعة استكشافها حتى الآن. وبالتالي، فإن عددا كبيرا من التفاعلات بين الأنواع الميكروبية التي تحدث في البيئات الطبيعية تكتشف باستخدام هذا النهج. ومع ذلك، منذ رغبتنا في تحديد ليس فقط وجود مثل هذه التفاعلات، ولكن بعد ذلك أيضا دراسة آليات والجزيئات تشارك في التوسط بينها، والقدرة على زراعة هذه الميكروبات هو ضرورة. حتى داخل الأنواع القابلة للزراعة، وقد تم استكشاف هذا المجال ضعيفة، مما يجعل وصف نهج هنا مساهمة قيمة كوسيلة لتحديد التفاعلات بوساطة كيميائيا بين الميكروبات. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تحسين للكشف عن مصفوفة تحريض العصوية الرقيقة، فإنه يمكن من الناحية النظرية أن تطبق لذ مراسل الفلورسنت النسخي في أي نوع من الأنواع البكتيرية الأخرى.

آخر القيد المتعلقة لهذا النهج هو أن هذه الشاشة (حسب التعريف) يتطلب coculture. في البيئات الطبيعية، قد الميكروبات مع معدلات النمو المختلفة لا تزال تتعايش في القرب المكاني الوقت الذي تستغل فيه محاريب البيئية المختلفة. ان مثل هذه التفاعلات الميكروبية تكتشف عن طريق شاشة coculture لدينا، ومع ذلك، والتي سوف تسمح فقط نمو الميكروبات البيئية مع الاحتياجات الغذائية ومعدلات نمو مشابهة لتلك الأنواع المراسل. التعديلات التي من شأنها أن تفصل في نمو الكائنات الحية على حث المحتملة من النمو من سلالة مراسل ممكنة بالتأكيد. كنا نتوقع أيضا أن النمو خوطي من الفطريات - شائع في التربة - قد يسبب صعوبات في الشاشة شارك في الثقافة. في حين أن الجدول الزمني القصير من الشاشة لدينا مع B. الرقيقة يعني أن تم الكشف عن عدد قليل من الفطريات، مضيفا المركبات المضادة للفطريات إلى متوسطة النمو يمكن مinimize هذا القلق.

القدرة على تحديد النمط الظاهري والجينات المناسبة لمراسل بناء الفلورسنت لا ينبغي أن يكون صعبا، بالنظر إلى ثروة من البيانات والتسلسل النسخي إما متاحة بالفعل أو التي يمكن الحصول عليها بسهولة لكثير من الأنواع البكتيرية. ومع ذلك، وصعوبة واحدة مع النهج الموصوف هنا هو الحاجة إلى تحديد شروط النمو التي تقلل من مضان الخلفية من سلالة مراسل الخاص بك، مما يتيح الكشف عن مضان الاستقراء. يجب في كثير من الأحيان أن يتم تحديد هذه الشروط تجريبيا، على الرغم من أن البيانات النسخي يمكن أن يساعد هذا البحث (على سبيل المثال البيانات تبليط ميكروأري المتاحة للنمو B. الرقيقة يسمح تحديد الظروف التي يتم التعبير عن الجينات ذات الاهتمام ضعيفا 10). لبعض الصحفيين هذا البحث التجريبي قد تكون صعبة، وذلك جزئيا بسبب التعبير عن العديد من الظواهر الجرثومي هو غير المتجانسة. وبعبارة أخرى، فمن النادر أن تجد جonditions التي لم الخلايا داخل السكان يعبرون عن النمط الظاهري X. وهكذا، وهذا يتوقف على عدد من الخلايا ضمن تلك الفئات السكانية وقوة التعبير الجيني، قد يكون من الصعب تحديد الظروف التي توفر بشكل كاف منخفضة مضان الخلفية للسماح التعريفي ليتم الكشف عن . كبديل لهذا البحث التجريبي لفحص ظروف مثالية قد تكون ل"لحن" مستويات التعبير لمراسل باستخدام الطفرات الموجهة. عن طريق تغيير منطقة المروج و / أو الريباسي موقع الملزم للبناء المراسل، يمكن انخفضت مستويات مضان الخلفية. وهذا يمكن أن تعظيم وفائدة هذه الشاشة من خلال السماح حتى مع بعض الجينات تفعيل التأسيسية للفحص لتحريض.

وقد تم تحديد الكائنات الحية مرة واحدة حمل وأكد في الشاشة الثانوية، ويمكن تحديدها من قبل phylogenetically تسلسلها 16S الرنا الريباسي الجينات. ومن الممكن أيضا لقياس مدى الفلوريةcence باستخدام OD-600 بقعة طبيعية في الشاشة الثانوية 5. هذا يمكن أن توفر معلومات حول أي أعضاء المجتمع تنتج المركبات التي تؤثر على سلالة مراسل الخاص بك، وإلى أي مدى. وبالتالي، فإن هذا يمكن أن يؤدي إلى فرضيات حول التفاعلات الميكروبية التي قد تحدث في البيئات الطبيعية والقدرة على استكشاف إمكانات التطور المشترك من هذه الكائنات المنتجة والاستجابة. وتشمل اتجاهات أخرى في المستقبل توضيح بنية جزيء يفرز نفسه، وتحديد آلية (ق) التي الكائن الاستجابة الحواس هذا المركب، واستخدامه كأداة لتعديل الظواهر الكيميائية البكتيرية.

حتى مع الاعتبارات المذكورة أعلاه، فإن الطريقة الموصوفة هنا هو مساهمة كبيرة. أنه يتجنب العمل المشاركة في تجميع مكتبة من الميكروبات البيئية، ولكن يسمح الفصل المادي والعزلة عن طريق استخدام وسائل الاعلام الصلبة. قوة هذه الشاشة coculture هو أنفإنه يوفر طريقة المفاهيمية والتقنية مباشرة إلى الشاشة من خلال الآلاف من الأنواع الميكروبية لتحديد تلك التي تفرز مركبات الحيوية النشطة من الفائدة في حين يجري تنطبق على العديد من الأنواع البكتيرية والظواهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

المؤلف بفضل روبرتو Kolter (كلية هارفارد الطبية) لتقديم المشورة والمساعدة له أثناء وضع هذه الشاشة coculture لا تقدر بثمن. وقالت انها أيضا وذلك بفضل ماثيو القوى لقراءة المخطوطة من أجل الوضوح، وشيا يي تشنغ للمساعدة في الحصول على الشكل 6.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox VWR 80017-484 Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm VWR 26396-508
Gel loading tips, round VWR 29442-666
Glass rods VWR 59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope Zeiss N/A The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).
  2. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).
  3. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
  4. Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
  5. Shank, E. A., et al. Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).
  6. Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).
  7. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).
  8. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
  9. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
  10. Nicolas, P., et al. Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science. 335, 1103-1106 (2012).
  11. Middleton, R., Hofmeister, A. New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis. Plasmid. 51, 238-245 (2004).
  12. Shimotsu, H., Henner, D. J. Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis. Gene. 43, 85-94 (1986).
  13. Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis. Gene. 180, 57-61 (1996).
  14. Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera. J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).
  15. Charpentier, E., et al. Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).
  16. Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1. J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).
  17. Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).
  18. Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).
  19. Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).
  20. Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
  21. Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. Strategies for culture of 'unculturable' bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).
  22. Romano, J. D., Kolter, R. Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival. J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).
  23. Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
  24. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).

Tags

علم الأحياء الدقيقة، العدد 80، الفرز الفائق الإنتاجية فحوصات، الجينات، مراسل، الميكروبية التفاعلات، علم الأحياء الدقيقة التربة، Coculture، والتفاعلات الميكروبية، والشاشة، للصحفيين الفلورسنت النسخي،
باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shank, E. A. Using Coculture to… More

Shank, E. A. Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions. J. Vis. Exp. (80), e50863, doi:10.3791/50863 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter