Brug cokultur Detect Kemisk medierede interspecies Interaktioner

Summary

Bakterier producerer udskilte forbindelser, der har potentiale til at påvirke fysiologi deres mikrobielle naboer. Her beskriver vi en cokultur skærm, der tillader detektering af sådanne kemisk medierede interspecies interaktioner ved at blande jordens mikroorganismer med fluorescerende transskriptions reporter stammer af Bacillus subtilis på faste medier.

Abstract

I naturen, sjældent findes bakterier i isolation, de er i stedet omgivet af en bred vifte af andre mikroorganismer, der ændrer det lokale miljø ved at udskille metabolitter. Disse metabolitter har potentiale til at modulere fysiologi og differentiering af deres mikrobielle naboer, og er sandsynligvis vigtige faktorer i etablering og vedligeholdelse af komplekse mikrobielle samfund. Vi har udviklet en fluorescens-baserede cokultur skærmen for at identificere sådanne kemisk medierede mikrobielle interaktioner. Skærmen indebærer at kombinere en fluorescerende transkriptionel reporter stamme med miljømæssige mikrober på faste medier og lade kolonierne til at vokse i cokultur. Den fluorescerende transkriptionelle reporter er udformet således, at den valgte bakteriestamme fluorescerer, når det udtrykker en særlig fænotype af interesse (dvs. biofilmdannelse, sporulation virulensfaktor produktion osv.) Screening udføres under vækstbetingelser where denne fænotype ikke udtrykkes (og derfor reporter stammen er typisk ikke-fluorescerende). Når en miljømæssig mikrobe udskiller en metabolit, der aktiverer denne fænotype, diffunderer gennem agar og aktiverer fluorescerende reporter konstrukt. Dette gør det muligt at inducere-metabolit-producerende mikroorganisme, der skal detekteres: de er ikke-fluorescerende kolonier mest proksimale til de fluorescerende kolonier. Således er denne skærm gør det muligt at identificere miljømæssige mikrober, der producerer diffusible metabolitter, der aktiverer en bestemt fysiologisk reaktion på en reporter stamme. Denne publikation beskrives, hvordan du: a) udvælge passende cokultur screening betingelser, b) udarbejde journalisten og miljømæssige mikrober til screening, c) udføre cokultur skærmen, d) isolere formodede overtalelse organismer, og e) bekræfte deres aktivitet i en sekundær skærm. Vi har udviklet denne metode til at screene for jordlevende organismer, der aktiverer biofilm matrix-produktion i Bacillus subtilis

Introduction

Vi er interesseret i at forstå, hvordan de metabolitter, som bakterierne udskiller påvirker fysiologi og udvikling af de omkringliggende mikrober. Mange metabolitter er blevet karakteriseret for deres bioaktive virkninger på andre mikrober. To velbeskrevne eksempler indbefatter antibiotika, som inhiberer væksten af ​​andre mikroorganismer, og quorum sensing molekyler, som ændrer den globale genekspression af andre mikrober. Men bakterier producerer mange andre små molekyler naturlige produkter, der har ingen kendte bioaktiviteter ^1. Vi hypotesen, at bakterier har udviklet og bevaret evnen til at producere nogle af disse metabolitter, fordi de giver dem mulighed for at modulere cellulære fysiologi af deres mikrobielle naboer i de komplekse mikrobielle samfund inden der findes de fleste bakterier.

Bacillus subtilis celletyper

Vi har fokuseret vores studier på kemisk medierede mikrobielle interaktioner, der involverer Bacillus subtilis. Det er ikke kun på grund af sin status som Gram-positive model bakterien og de resulterende genetiske værktøjer til rådighed for sin manipulation, men også på grund af dens evne til at differentiere til karakteriseret celletyper. Eksempler omfatter celler, der er: svømning, producerer den ekstracellulære matrix, der er nødvendig for robust biofilm dannelse, er kompetente til at tage op DNA fra miljøet, og sporedannende, bl.a. ^2. Hver af disse celletyper udtrykker en karakteristisk transkriptionel regulon, der gør dem fysiologisk og / eller fysisk adskilt fra deres genetisk identiske søskende. Under mange vækstbetingelser, flere celletyper sameksistere så forskellige delpopulationer inden for en enkelt koloni af B. subtilis-celler ^3.. Selv om mange arter af bakterier kan udvise analog celletype heterogenitet, dette fænomen er blevet særlig godt undersøgt i B. subtilis.

Især gener, der er UPRegulated inden for hvert af disse specifikke B. subtilis celletyper er blevet identificeret. Er afgørende for det arbejde, der beskrives her identificere sådanne opreguleres gener fordi mange af disse mikrobielle fænotyper af interesse er svært eller umuligt at observere direkte. For eksempel kan vi ikke visuelt registrerer et træk såsom svømning på solide (1,5%) agarplader, selvom en delpopulation af B. subtilis-celler producerer flageller under disse vilkår ^3. Et andet eksempel er biofilm matrix-produktion. Matrix produktion kan visualiseres ved koloni morfologi (da det resulterer i makroskopisk rynket kolonier), men kun på visse vækstmedium, og først efter flere dages vækst ^4.. Men ved at vide, hvilke gener opreguleres under differentiering, kan vi konstruere transkriptionelle reportere, der fungerer som markører for cellulær differentiering i disse celletyper.

Reporterkonstruktioner

Disse fluorescerende transcriptional reportere består af promotorerne for celletype-specifikke gener driver produktionen af ​​et reporter-gen, for eksempel et fluorescerende protein. Som eksempler kan nævnes P _hag-YFP (til svømning celler), P _Tapa-YFP (for biofilm matrix-producerende celler), og P _sspB-YFP (til sporedannende celler), hvor P _x angiver promotor region for gen x. Disse reporter-konstruktioner er integreret i en neutral locus på kromosomet (fig. 1 og se nedenfor), således at det native regulering af fænotypen efterlades intakt. Men nu, når en celle udtrykker denne fænotype, udtrykker også et fluorescerende protein. Dette giver en let visualiseres udlæsning af aktiveringen af ​​særlig fænotypisk adfærd, hvilket giver os mulighed for at screene for mikrober, der aktiverer denne fysiologisk reaktion. Selv om sådanne journalister er almindeligt anvendt i mikrobiologi, er de ikke blevet bredt anvendt i skærme til identify metaboliske interaktioner mellem mikrober, før denne metode blev beskrevet ^5.

Der er en række vigtige overvejelser i design og konstruktion af celle-typespecifikke reporter stammer. Vi har udnyttet udelukkende transkriptionelle fluorescerende reportere, selv om andre typer af konstruktioner er bestemt muligt. Vi fraråder brug af translationsfusioner som markører for celletype differentiering i vores skærm, men for to grunde: 1) ønsket om at forlade native celletype-specifikt protein uanfægtet, og 2) anerkendelse af, at en diffus, celle- bred fluorescens vil være lettere at opdage end lokaliseret puncta i cellerne (fælles med translationsfusioner).

Reportergen udvælgelse

Efter at have besluttet at bruge transskription som en udlæsning, skal reportergenet vælges (f.eks LacZ, fluorescens eller luciferase). LacZ har den fordel, at behøve mindst særligeliseret til at detektere, men der er en meget højere sandsynlighed for falske positiver blandt miljømæssige mikrober. I vores hænder, baggrundsniveauet for Lac ⁺ organismer blandt jordens mikroorganismer var uoverkommeligt høj (>> 10% af jordens mikroorganismer var blå (Lac ⁺⁾ på X-gal plader, data ikke vist). Det er muligt, ved at titrere koncentrationen af ​​X-gal i mediet, kan det være optimeret til at tillade anvendelse af en X-gal-reporter, selv om vi ikke forsøge dette. Luciferase giver høj følsomhed påvisning og er den mest retvinklede reporter: Der er næsten ingen chance for miljømæssige mikrober er i sagens natur selvlysende. Vi fandt imidlertid det vanskeligt at identificere instrumentering på vores institution, der tillod luminescens opdagelse på tværs af hele Petri plader, da de fleste var designet til at scanne kun lokaliserede områder i multi-brønds plader. Der kan også være komplikationer i visualisere selvlysende kolonier på en måde, der også tillod samtidig fysisk erolation af inducerende organismer. Mens du bruger tilsynsførende kan have gjort dette muligt, vi i stedet valgt at bruge fluorescerende transkriptionale journalister, som blev vist sig at fungere i B. subtilis, forudsat tilstrækkelig påvisningsfølsomhed og lave falske positive blandt jordorganismer og lov til at bruge af let tilgængelige instrumenter til både visualisering og isolation procedurer.

Fluorophor udvælgelse

Den specifikke Fluoroforen valgt vil afhænge af dine bakteriearter, agar vækstmedium, du bruger, og den særlige fluorescens filter indstiller du har til rådighed. Med vores instrumentering, fandt vi at både B. subtilis kolonier selv og agar, de blev dyrket på udstillet mindre baggrundsfluorescens når YFP (gult fluorescerende protein) filtre blev anvendt, hvilket gør, at reporter overlegen GFP (grønt fluorescerende protein) i vores hænder. Kodonanvendelsen af ​​fluorescerende proteiner erofte optimeret til eukaryoter, hvilket gør det vigtigt at vælge en fluorofor enten kendte fra litteraturen til at arbejde i dine bakteriearter, eller at teste det eksplicit ved hjælp af en konstitutiv promotor. Et stort antal af stadigt udviklende fluorescerende protein varianter findes i øjeblikket ^6, som er blevet revideret i en række kilder ^7,8, hvoraf nogle eksplicit vejlede om at vælge en passende fluorescerende protein til dit eksperiment ^9.

Promotor udvælgelse

Udvælgelsen af ​​en promotor vil i høj grad afhænge af din celletype eller fænotype af interesse. For organismer såsom B. subtilis, har nogle celle-typespecifikke reportergener er etableret i litteraturen. For andre bakteriestammer vil undersøge microarray eller transskriptionelle data være nødvendigt at give oplysninger om, hvilke gener er stærkt opreguleres under de betingelser, hvor din celletype af interesse is manifesteret. En nylig undersøgelse katalogiseret transkription af B. subtilis under 104 forskellige vækstbetingelser hjælp flisebelægning microarrays ^10. Dette dokument indeholder omfattende information om, hvilke gener er stærkt opreguleres under forskellige forhold, hvilket er uvurderligt for mindre velkarakteriserede fænotyper.

Snarere end at kortlægge præcise promotorregioner for hvert gen af ​​interesse, vi typisk blot bruge sekvensen 200-500 bp opstrøms for genet som promotoren. Den nøjagtige sekvens længde afhænger af den genomiske sammenhæng: kortere regioner anvendes når det er nødvendigt at undgå at medtage opstrøms kodende regioner fra tilgrænsende åbne læserammer.

Neutral loci og integration

Hvordan at opretholde reporter konstruktionen i din bakteriestamme bliver det sidste spørgsmål i at designe en fluorescerende transkriptionel reporter stamme. I bakterier er gener af interesse ofte vedligeholdespå plasmider ved hjælp af antibiotisk selektion. Imidlertid kan det ikke være muligt at anvende antibiotika i cokultur uden at dræbe de miljømæssige mikrober. Hvis plasmider stabilt fastholdes i dine bakteriearter, kan det være muligt dyrke din bakterier, der indeholder et plasmid-bårne reporter i tilstedeværelse af antibiotika til at forberede din reporter til screening, og derefter fjerne antibiotika under cokultur selv i håb om, at plasmidet vil være tilstrækkeligt at gøre det muligt for fluorescens. Men hvis plasmider nemt går tabt i din bakterie, eller går tabt under stress betingelser, vil dette ikke være en farbar vej. I mange tilfælde vil den bedste løsning være at integrere reporter konstrukt på det bakterielle kromosom, som tillader stabil opretholdelse af reporter, selv i fravær af selektionstryk. For at integration ikke forstyrre den normale udtryk eller regulering af din gen af ​​interesse, anbefaler vi integrerer en ektopisk sted på kromosomet at CAn fungere som en "neutral locus." I B. subtilis disse integrationsprocesser sites er gener, der - når muteret - overbringe en fænotype i visse minimal medier (tillader integranter kan identificeres uden antibiotisk udvælgelse), endnu ikke ændrer vækst eller sporulation satser i rich media, og omfatter sådanne gener som amyE, Laca, thrC, pyrD, gltA og SACA (fremføring af evnen til at udnytte stivelse, β-galactosider, threonin, uracil, glutamat og saccharose, henholdsvis) ^11-13.

Integrationen i disse gener er blevet anvendt pålideligt i mange år i B. subtilis (specielt ved amyE og Laca) kan tilsvarende viden ikke tilgængelig for gener i mange andre bakteriearter. Brugen af fag-bindingssteder er gode alternativer til neutrale kromosomale integration sites: mange artsspecifikke ^14-16, samt almindelige integrationsindsats steder såsom Tn7 vedhæftede stedet (ATT Tn7) harblevet identificeret og anvendt til genindsætninger i mange bakteriearter ^17,18.

Miljømæssige mikrober

Vi bruger jord som en direkte kilde til miljø mikrober til vores cokultur skærm. Jordbunden indeholder en høj diversitet af mikrober, og mange af disse organismer er rig kilde til naturlige produkter. Ved anvendelse af flydende suspensioner af jord placeret direkte på plader med vores fluorescerende transkriptionel reporter stamme (uden forudgående isolation af bakterier fra jorden), vi i høj grad forenkle eksperimenterende tilgang. Jorden kan enten bruges straks efter høst, eller nedfryses ved -80 ° C til senere brug. Øjeblikkelig brug har den fordel, at en større mangfoldighed af mikrober potentielt kan dyrkes, herunder dem, der ikke vil overleve frysning godt. Det har den ulempe, at koncentrationen af ​​dyrkbare organismer i jorden fra disse prøver er ukendt, øge antallet af skærmplader, der skal anvendes. DelAyed brug har den fordel, at de cfu / ml for hver jord kilde kan bestemmes på forhånd, så en optimeret antallet af kolonier, der skal dyrkes på hver skærm plade. Men det kræver, at de jordorganismer være i stand til at overleve frysning.

Bemærk at diversificere inducer pulje blive undersøgt (dvs. jord kilder), synes at være mere effektive til at identificere nye interspecies interaktioner end dybdegående screening på samme jord: større fylogenetisk diversitet blev observeret i hits identificeret i vores matrix-induktion skærmen som yderligere jord kilder blev undersøgt snarere end screening af de samme jord kilder mere grundigt (EA Shank og R. Kolter, Harvard Medical School, upublicerede resultater).

Oversigt

Den tilgang, vi beskriver her er ligetil i form af de tekniske krav. Det indebærer: 1) at konstruere en fluorescerende transkriptionel reporter i B. subtilis eller enandre bakteriearter af interesse, 2) identifikation af forhold, hvorunder denne reporter ikke er aktiveret, 3) udarbejdelse af portioner af denne reporter stamme og organismer, der skal screenes (i vores tilfælde jord, men andre kilder kunne udnyttes i stedet), 4) at blande disse to sæt af mikrober på faste medier, 5) identificere og isolere formodede inducerende organismer, og 6), hvilket bekræfter, at disse organismer faktisk aktiverer denne fænotype i en sekundær screening. Når identificeret, disse organismer og deres metabolitter give os kemiske redskaber til at modulere bakteriel adfærd, for at studere bakteriel fysiologi og mikrobielle interaktioner, og eventuelt fungere som nye stilladser til fremtidige terapeutiske forbindelser.

Protocol

1.. Vælg et reportergen og konstruere et fluorescerende Transkriptionel Reporter

For B. subtilis:

1. Se JOVE artiklen i henvisning ¹⁹ for en protokol, der beskriver opbygningen af fluorescerende transkriptionale journalister i Bacillus subtilis.

For andre bakteriearter:

1. Identificere et gen, som opreguleres under den fysiologiske reaktion af interesse. Dette kan være baseret på eksisterende litteratur eller transkriptionel analyse af den mikrobe under særlige forhold.
2. Konstruere en fluorescerende transkriptionel reporter for dette gen til at fungere som en proxy for ændringer i fænotype. Denne konstruktion bør omfatte promotoren for dette opreguleret gen driver produktionen af et passende fluorescerende protein (se figur 1).
3. Integrere denne konstruktion i en neutral locus på kromosomet. Dette sikrer, at nativ regfolkning af genet af interesse, ikke forstyrres, og undgår behovet for plasmid selection mekanismer (fx antibiotika) der kan interferere med væksten i miljømæssige mikrober.

2. Bestem cokultur Betingelser

For B. subtilis P _tapa-YFP reporter:

1. Brug 0.1x LB, Lennox (1 g trypton, 0,5 g gærekstrakt, 0,5 g NaCl per liter) medium for denne reporter, da B. subtilis matrix-produktion er minimal på Luria Broth ^20. Dette medium giver mulighed B. subtilis-kolonier at vokse til submillimeter men observerbar størrelse, samtidig med at diverse taxa fra jord til at vokse ^5.
2. Omfatte 100 mM MOPS-buffer for at minimere potentielle pH-ændringer.

For andre bakteriearter:

1. Brug offentliggjort transcriptionale data eller empirisk afprøve forskellige dyrkningsbetingelser til at identificere en, hvor mikrobe vokser men activation af det fluorescerende reporter er ubetydelig (for at tillade aktivering for at blive opdaget, når reporter stammen dyrkes i cokultur med inducerende mikrober.)
2. Brug et medium med lavt næringsindhold (i forhold til traditionelt rige mikrobiologiske medier) ved screening miljømæssige mikrober fra næringsfattige miljøer (såsom jord), da mange næringsfattige bakterier ikke vokser, når de præsenteres med høj næringsstofforholdene ^21. En lav næringsmedium reducerer også koloni størrelse, øge throughput af skærmen.
3. Vælg et medie med lav baggrundsfluorescens og god optisk klarhed.
4. Optimer vækst temperatur for at tillade både reporter stamme og miljømæssige mikrober til at vokse samtidig.
5. Overvej tilsætning af et buffermiddel. Anvendelse af puffer i pladerne vil reducere muligheden for at detektere pH-medierede ændringer i fysiologi ^22, medmindre sådanne interaktioner er af interesse.

3. Forbered Reporter Aliquots

For B. subtilis P _tapa-YFP reporter:

1. Streak reporter stamme fra -80 ° C frossen bestand på en frisk LB-plade ved hjælp af en steril tandstik eller applikatorpind.
2. Grow natten over ved 30 ° C.
3. Udfør seriefortyndinger i flydende kultur for at minimere baggrundsfluorescens hidrørende fra vækst på et fast medium:
   1. At inokulere en 5 ml flydende kultur af LB og vokse under rystning ved 37 ° C.
   2. Når kulturen når en _OD600 ~ 0,6, fortyndes i 5 ml frisk LB til en _OD600 på 0,02.
   3. Vokse ved 37 ° C igen med rystning, indtil kulturerne når _OD600 ~ 0,6.
   4. Gentag serielle vækst fortyndinger alt 3x.
   5. Lad endelig seriefortynding kulturen vokse til _OD600 ~ 0,4.
4. Tilføj glycerol til 15-20%.
5. Alikvot 50-200 ul i 0,5 ml mikrocentrifugerør og fryse ved -80 ° C.
6. MaKE tilsvarende portioner til fluorescerende forælder stamme af reporter (de vil være nødvendig i sekundær screening).

For andre bakteriearter:

1. Anvende celler, der har en lav baggrundsfluorescens (dvs. dyrkes under betingelser, hvor der er ringe ekspression fra promotoren blev anvendt i reportergen).
2. Lav og fryse portioner, der indeholder kendte cfu / ml (kolonidannende enheder pr ml) af reporter stammen, således at et passende antal kolonier kan dyrkes på hver cokultur skærm plade (se ovenstående afsnit for detaljer).
3. Gør tilsvarende portioner til fluorescerende forælder stamme (de vil blive krævet under sekundær screening).

4.. Opnå jordprøver

1. Saml jord i sterile koniske rør eller sterile poser ved hjælp af en spatel, kassere de øverste 0,5 cm af eksponerede overflade jord.
2. Tilføj sterilt saltvand (0,85% NaCl) i et forhold på 10 ml per 1 gaf jord for at gøre en jord opslæmning.
3. Vælg en metode til at fjerne bakterier fra jordpartikler: a) øjeblikkelig anvendelse af frisk prøve eller b), forsinket brug efter frysning af prøven.
   1. Til øjeblikkelig brug, vortex gylle i 1 min.
   2. For forsinket brug, blend jord gylle i blender tre 1 min cyklusser, hvilket placerer blenderglasset på is i 1 min hviler mellem blending cyklusser.
4. Lad jord gylle nøjes med ~ 1 min.
5. Før det øverste vandige lag til et frisk rør.
6. Tilføj glycerol til en slutkoncentration på 15-20%.
7. Alikvot 50-200 ul i 0,5 ml mikrocentrifugerør og fryse ved -80 ° C.

5.. Bestem cfu / ml af Frozen Reporter og jord Aliquots

1. Tø en frossen portion jord og reporter. Jordens mikroorganismer kan optøs på is. Fordi B. subtilis-lyserer ved 4 ° C, bør disse portioner optøs hurtigt ved stuetemperatur for at minimere den tid, ved lav temperatur.
2. Lav to replikat serial fortyndinger (til 10 ^-8) i 0.1x LB eller anden isotonisk puffer.
3. Plate 5 pi pletter af hver seriefortynding på agarplader af det samme medium, som vil blive anvendt til cokultur screeningen.
4. Grow på RT (eller temperaturen, der vil bruge til screening).
5. Den næste dag, tælle antallet af kolonier i hver plet og beregne cfu / ml af hver af de frosne alikvoter.

6.. Bekræft Alikvote Koncentrationer for Spread Screen Plates

1. Tø en frossen portion som i trin 5.1.
2. Fortyndes til 1 x 10 ^5, 2,5 x 10 ^5, 5 x 10 ^5, 1 x 10 ^6, og 2,5 x 10 ⁷ cfu / ml.
3. Tilføj 50 gl plet af hver fortynding til center af de enkelte plader. Disse bør give plader med den beregnede optimale 25.000 kolonier per plade, samt 2 - og 5 - fold mere og mindre, så den bedste faktiske fortynding skal bestemmes.
4. Tilføj cirka 20 sterile glas (3 mm) perler afforsigtigt at banke dem på pladen. Perler giver en mere jævn fordeling af kolonier over pladen end en bøjet glas sprederen gør.
5. Spred celler ved at holde pladerne på stationære og ryste dem frem og tilbage, dreje dem, mens du arbejder, indtil der er absorberet væsken. Fortsæt ikke ryste perlerne, når pladen er tør, da den ellers vil begynde at dræbe bakterier.
6. Flip plader igen og kassér perler ind affald bægerglas indeholdende ethanol.
7. Lad pladerne vokse for den tid af dit assay (fx 24 timer) ved rette temperatur til din analyse (fx 24 ° C / RT).
8. Ved hjælp af en dissekering stereoskop, tælle antallet af kolonier i to eller flere synsfelter.
9. Beregn antallet af kolonier pr området, og bestemme, hvor mange kolonier på hver plade.
10. Juster fremtidige fortyndinger som nødvendigt. Det faktiske antal af kolonier er ikke så vigtigt som at have det samme antal på hver sammenlignelig skærmplade.

1. Tø reporter portion (og jord portion hvis frosne) som i trin 5.1.
2. Fortyndet reporter (til koncentrationer optimeret i afsnit 6) i 0,1 x LB eller andre lav næringsstof, isotonisk opløsning.
   1. For frosne jord: Fortynd til koncentration optimeres i afsnit 6 i 0,1 x LB eller andre lav næringsstof, isotonisk opløsning.
   2. For frisk jord: Lav fortyndinger af frisk jord gylle, baseret på forudsigelse, at de cfu / ml af jordens gylle kan strække sig fra 10 ^-4 til 10 ^-9 cfu / ml.
3. Spot 50 pi jord og reporter fortyndinger onto midten af ​​cokultur skærm plade. Også plade jord alene og reporter alene som kontroller.
4. Spred hjælp glasperler som beskrevet i trin fra 6,4 til 6,6.
5. Hvis der er kendte vækstbetingelser, der aktiverer din fluorescerende reporter, stribe eller plade din reporter under disse betingelser og vokse til at bruge som en positiv kontrol i løbet af screening. Inkuberes ved 24 ° C i 24-28 time (eller hvad der er relevant for din reporter / analyse)

8.. Screen cokultur Plader til Fluorescence

1. Brug brightfield belysning, fokusere din stereoskop så kolonierne er skarpe.
2. Kig på pladerne i jorden kun at afgøre, om din jordprøve har autofluorescerende kolonier. Hvis ja, kan denne jord resultere i en høj rate af falske positiver (med en samtidig stigning i sekundær screening).
   1. Brug en høj andel af reporter: jord i din cokultur plader for at øge chancen for, at en inducer vil være omgivet af flere reporter kolonier, hvilket reducerer chancen for de vil blive afsløret som falsk-positive (figur 2).
   2. Brug et andet fluorescerende protein (en, der udsender i en anden kanal).
3. Bestem assay timing. For de fleste nye reportere, timingen af ​​potentielle induktion er ukendt, og således skal bestemmes empirisk.
   1. Begynd screening for fluorescens, så snart kolonier bliver tydeligt med dissekere stereoskop (forstørrelse ~ 30X), og fortsætte behandlingen pladerne periodisk indtil væksten er ophørt og / eller baggrund fluorescens bliver for høj.
   2. Når tiden vindue potentiel induktion bestemmes for en bestemt journalist, bør det være ens for alle cokultur plader indeholdende denne reporter, forenkle overvågningen af ​​skærmpladerne. For B. subtilis P _tapa-YFP reporter, et passende tidspunkt til at undersøge pladerne er mellem 24-28 timer efter udpladning af celler til B. subtilis P _sspB-YFP reporter, det er mellem 26-32 timers vækst.
4. Maksimere din fluorescens følsomhed:
   1. Sørg for at din fluorescens dissekere omfang er i et mørkt rum eller omgivet af mørklægningsgardiner. Induktion vil sandsynligvis være mindre intens end et konstitutivt produceret FP og kræver større følsomhedaktivitet at opdage.
   2. Give tid til fluorescens lampe til at stabilisere og dine øjne til at tilpasse sig til mørket, før du forsøger at detektere fluorescens fra dine cokultur plader (mindst 1-2 min.)
5. Ved hjælp af en positiv kontrol (hvis du har en), sikre, at forstørrelsen du bruger, giver dig mulighed for at opdage fluorescens. Forstørrelsen er typisk bedst, hvis dit synsfelt er ca 30-50x din typiske koloni diameter (200-400X).
6. Sluk lys og åbne lukkeren for din fluorescens.
7. Når dine øjne har vænnet sig til mørket, langsomt bevæge pladen frem og tilbage på tværs af dit synsfelt, på udkig efter lyspunkter.
   1. Start fra toppen af ​​pladen og bruge et zigzag-mønster for at flytte pladen fra side til side, som man bevæger sig mod bunden af ​​pladen.
   2. Øv flytter pladen i lysfelt at få en fornemmelse for, hvordan langsomt at flytte til pladen, og for at være sikker på at du dækker hele suransigt område.
   3. Flyt pladen langsomt nok, at kolonierne ikke bliver sløret. Det er bedre at oversample overfladen snarere end miss områder.
   4. Efter en fuld sweep, drej pladen 90 ° og gentag. Menneskelige øjne er bemærkelsesværdigt gode til at opdage selv svag fluorescens gennem denne metode.
8. Hvis du opdager fluorescens, stopper med at bevæge pladen og gå tilbage og finde det fluorescerende område.
9. Tænde brightfield langsomt, afgøre, om fluorescens er forbundet med en bakteriel koloni (og ikke autofluorescerende jord detritus eller medier komponenter). Hvis dette er tilfældet, ikke-fluorescerende kolonier proximale til den fluorescerende kolonien formodede inducerende organismer.

9.. Isoler Formodede Inducing organismer

1. Når inducerede (fluorescerende) kolonier er blevet identificeret, isolere disse kolonier udskiller de inducerende forbindelser.
   1. Hvis en tilstrækkelig høj koncentration af reporter kolonier vokser på pladen(> 0,5:1 reporter: jord cfu), vil de formodede inducerende kolonier være omgivet af flere fluorescerende kolonier (igen, se figur 2).
   2. I tilfælde, hvor kompleksiteten af ​​væksten cokultur gør det tvetydige som koloni er induktor isolere flere potentielle inducerende kolonier til efterfølgende test i den sekundære skærm.
2. Lokalisere kolonier, du ønsker at plukke i midten af ​​synsfeltet.
   1. Hvis de er tæt på kanten af pladen, dreje pladen, så læben af pladen er væk fra din dominerende hånd (dvs. hvis du er højrehåndet, sætte læben af pladen til venstre). Dette giver dig mulighed for at henvende sig til kolonierne i en lav vinkel, hvilket forbedrer nøjagtigheden af ​​dit plukning.
3. Placer friske plader til at streak de formodede inducerende organismer til nærliggende, samt et spild bæger til at kassere brugte tips ind.
4. Forlader fluorescens lampen på, drejes skarpt lys langsomtpå, så du vil være i stand til at identificere (ved form og position), fluorescerende koloni og de omkringliggende formodede inducerende organismer. Du kan være nødt til at gå frem og tilbage med lyset et par gange for at være i stand til at identificere de kolonier, du ønsker at vælge, når der ikke er nogen fluorescens og kun skarpt lys.
5. Brug et glas stang (200 mm lang diameter x 5 mm) for at hente en steril, rund 200 pi gel-loading spids og holde det som en blyant. Dette er plukning værktøj, du vil bruge til at isolere enkelte kolonier.
6. Hvil din ydre håndflade mod scenen for at stabilisere den på arbejde overflade. Placer den anden hånd på det indre, tommelfinger side af din hånd til at stabilisere din plukning værktøj.
7. Hvis det er nødvendigt, vend igen mellem fluorescens og lysfelt udsigt til at identificere de kolonier, du ønsker at vælge.
8. Holde pipettespidsen over pladens overflade, flytte den ind i dit synsfelt og centrere det over kolonien, du gerne vil plukke. Vil spidsen være ude af fokus.
9. Brug yderkanten af ​​din hånd (som hviler på mikroskopbordet eller arbejde overflade), dreje pipettespidsen langsomt ned til kolonien at blive plukket. Rør det meget let, forsøger at minimere, hvor mange andre kolonier spidsen kontakter.
10. Uden at rotere dirkeværktøj, stribe på et afsnit af en frisk plade. Spred med en soft touch for at undgå udhuling agaren. Da antallet af celler, der overføres af denne metode er ret små (kolonierne er meget mindre end typisk manipuleret), vil en enkelt kontinuerlig stribe resultere i isolerede kolonier.
11. Gentag denne proces med andre formodede inducerende organismer.
12. Pladerne inkuberes ved 24 ° C (eller temperaturen på dit assay).

10.. Streak Formodede Inducing organismer til opnåelse af isolerede enkelte kolonier

1. Ved hjælp af en stereoskop, fastlægge - baseret på koloni struktur eller morfologi - om der er forskellige typer koloni indeholdt i hver af dine formodede plukket inducing organismer.
   1. Kig på kolonier ved hjælp af en fase, hvor du kan belyse kolonier fra både over såvel som fra nedenfor for at afsløre potentielle forskelle koloni.
2. Restreak hver forskellig morphotype på en frisk plade og inkuber indtil vokset.
3. Restreak en gang mere, og lad vokse. Hvis der er forskellige morphotypes fortsætter, fortsætter med at restreak til renhed.

11.. Gentest Formodede Inducing organismer i Sekundær skærm

1. Gentest alle de formodede inducerende organismer i en sekundær screening for at bestemme, hvilken aktiverer den fluorescerende transkriptionel reporter. Den sekundære skærm består af en græsplæne af mikrokolonier af fluorescerende transkriptionelle reporter stamme, sammen med kontrol-plader, hvorpå formodede inducerende organismer er lappet eller plettet.
2. Oprettet tre identiske plader: det ene indeholder et mikrokoloni plænen af ​​fluorescerende transkriptionelle reporter stamme (ved samme koncentration as blev anvendt under cokultur screening), en indeholdende en mikrokoloni plænen af ​​vild-type forælder-stamme uden et fluorescens-reporter, og en, der ikke indeholder græsplæne.
   1. Markere toppen af ​​bagsiden af ​​hver plade til at bestemme pladens orientering.
   2. Tilføj positionelle markører for patches / pletter, op til ti formodede inducerende organismer kan afprøves i hvert sæt af plader (fig. 3).
   3. Optø græsplæne portioner (reporter og fluorescerende forælder stamme) som i trin 5.1.
   4. Spred 50 pi af en 5 x 10 ⁵ cfu / ml fortynding på græsplæne plader (eller andre optimerede fortyndinger) med sterile perler som i trin 6.4.
   5. Lad plader tørre.
3. Patch eller spot formodede inducerende organismer:
   1. Vælg patching hvis der ønskes en lettere og hurtigere metode, og det er acceptabelt at have en mindre præcise antal celler deponeret. At lappe:
      1. Tryk på en steril tandstik til kolonien til prøve - ikke afhente alle cellerne.
      2. Patch (lave en lille stribe) på den tomme tallerken.
      3. Gentag plaster med frisk tandstikker på reporter plade.
      4. Gentag plaster med frisk tandstikker på kontrol plade.
   2. Vælg spotting hvis der ønskes en kvantitativ og reproducerbar fremgangsmåde. Spotting gør antallet af deponerede celler, der skal normaliseres (se reference 5 for yderligere oplysninger), og tillader den relative styrke af de forskellige inducerende organismer, der skal sammenlignes. At få øje på:
      1. Resuspender formodede inducerende organismer i 1 ml flydende medier i en steril plastik kuvette.
      2. Tag OD ₆₀₀ af de resuspensions.
      3. Ved hjælp af formlen X = 250 ÷ (OD _{600 til} 0,5), tilsættes den mængde X for hver resuspension til 500 ul flydende medium til at få en løsning med en _OD600 på 0,5. Denne metode forenkler de nødvendige pipetteringstrin når der udføres flere fortyndinger at normalisere OD er ​​fordi du kan bruge den samme mængde (500 ul) for alle dine dilutants.
      4. Spot 1 pi af hver OD-normaliseret resuspension til hver af de tre plader.
4. Lad vokse ved 24 ° C i 24-28 time (eller hvad der er relevant for din reporter / analyse).
5. Brug det fluorescerende dissektionsmikroskop at identificere formodede inducerende organismer, der aktiverer din fluorescerende reporter stamme, men ikke din forældrekontrol stamme. Disse isolater er dine positive hit - de miljømæssige mikrober, der udskiller stoffer, der inducerer din fænotype af interesse.

Representative Results

Denne skærm blev anvendt til at identificere jordorganismerne secernerende stoffer som ændrer fysiologi B. subtilis. De her beskrevne resultater fokusere på matrix-producerende celle type B. subtilis, der producerer proteinet og exopolysaccharid, der kræves for robust biofilmdannelse i denne bakterie. Vi valgte promotor af tapa-sipW-Tasa operon for vores fluorescerende reporter konstruktion (P _tapa-YFP). Denne operon koder for proteinet strukturelle komponent i matrixen og opreguleres under biofilm matrixproduktion ^23. Vores matrix reporter (figur 1) blev konstrueret som tidligere beskrevet ^19.

Tidligere arbejde har vist, at B. subtilis producerer matrix som reaktion på den selv-producerede quorum-sensing-lignende molekyle surfactin samt oprensede metabolitter produceret af jord andre bakterier ^20. Vi var interesseret i at udvideSE undersøgelser for at undersøge mere bredt som jordens mikroorganismer gør metabolitter stand til at fremkalde matrix produktion i B. subtilis. Vi har valgt at bruge fortyndet LB for vækst, da dette medie allerede var kendt for at føre til dårlig matrix produktion ^20, giver os en vækst tilstand, hvor vores reporter stammen var fluorescerende. Vi derefter optimeres antallet af kolonier er egnede til screening under disse vækstbetingelser. For at optimere hver skærm plade, er det nødvendigt at bestemme, hvor mange kolonier vokse fra de frosne portioner jord og reporter, og hvad den passende koncentration af kolonier og næringsstoffer betingelser er. Ideelt set ønsker vi hver cokultur plade til at indeholde et tilsvarende antal kolonier jord og reporter (dvs. et 1:1 forhold af reporter: jord) og at være tæt afstand, individuelle kolonier. Denne høje andel af reporter kolonier øger sandsynligheden for, at en inducer vil aktivere flere omgivende reporter kolonier. At have flere acveret inducer kolonier omgiver en formodet inducer koloni øger tilliden til indkredsning selve overtalelse organisme (figur 2). Næringsindholdet styrer omfanget af vækst / kolonidannelse mens fortynding af inoculum afgør, om de resulterende kolonier på passende dispergeret. På en standard diameter på 10 cm petriskål med lav næringsmedium, fandt vi, at omkring 25.000 kolonier alt pr plade (50 pi af en 5 x 10 ⁵ cfu / ml fortynding) forudsat den bedste adskillelse af B. subtilis-kolonier på 0.1x LB MOPS medium (figur 4).

Selv om den beregnede cfu / ml af serielle fortyndinger giver en omtrentlig koncentration af bakterier i portioner, er det nødvendigt at sikre, at koncentrationen af ​​de resulterende kolonier er passende, når en hel plade spredes med celler. Den beregnede cfu / plade og faktisk cfu / plade er ikke altid identisk (figur 4

Efter fremstilling af portioner af reporteren og jord blandede vi dem på cokultur skærmplader og undersøgte dem for fluorescens under anvendelse af et stereoskop (figur 5). Vi belagte også kontroller, der kun blev podet med enten jord eller B. subtilis P _tapa-YFP reporter stamme. B. subtilis producerer biofilm matrix (fluorescens) som svar på en lang række mikrober fra jorden som set af de fluorescerende kolonier i cokultur billedet i figur 5.. For de jordtyper, vi undersøgte, havde vi en høj hit satser for P _tapa-YFP reporter. Som beskrevet i reference 5, mellem 12-67% af isolaterne (fra seks forskellige jordprøver) havde evnen til induce fluorescens i P _tapa-YFP reporter stamme. Dette er i modsætning til vores upublicerede resultater fra analoge skærme med sporuleringen (P _sspB-YFP) og kompetence (P _comG-YFP) reportere. Efter omfattende screening (> 200.000 kolonier for hver reporter), var der kun to organismer identificeret at fremkalde sporulation, mens ingen blev identificeret, der inducerer kompetence. Således er de hit satser for forskellige celletyper være meget varierende og kan være vanskeligt på forhånd at forudsige.

Vi derefter plukket enkelte formodede inducerende kolonier. Kolonierne på cokultur skærmpladerne er ganske små med lav næringsstof medium anbefaler vi (submillimeter diameter). Ikke desto mindre er det muligt præcist at vælge og isolere meget små kolonier med hånden (figur 6) inde fra en kompliceret cokultur skærm plade. Den manuelle metode, vi bruger, er enkel og kræver hverken specialværktøj eller flamme sterilisering. Disse formodede inducer kolonier derefter restruck til isolation. Fordi cokultur pladerne overfyldt med kolonier, er det ikke usædvanligt - selv med meget omhyggelig plukning teknik - at have mere end én organisme vokser fra hver formodet inducer prøve. Omhyggelig undersøgelse bør tillade isolering af morfologisk adskilte kolonier. Alle formodede inducerende organismer testes derefter i en sekundær skærm. Positive og negative resultater fra både lappen og spot metode er vist i figur 3.. I betragtning af deres tætte vækst, vores evne til fysisk at samle overtalelse kolonier fra cokultur pladerne var ganske god, med cirka 50% af de undersøgte i vores sekundære skærm være sande positive kolonier. Yderligere resultater fra denne skærm samt opfølgende arbejde på vej fra det tidligere har været beskrevet ^5.

/ Ftp_upload/50863/50863fig1.jpg "/>
Figur 1. Fluorescerende transkriptionel reporter konstrukt. Den blå oval repræsenterer en bakteriel celle og den stiplede linie repræsenterer dens kromosom. Dette eksempel viser en fluorescerende transkriptionel reporter til fremstilling af matrixen. Den native locus forbliver intakt (P _{matrix-matrix,} hvor "P", og pilen angiver promotorregionen), mens reporter konstrukt (P _matrix-YFP) indsættes andetsteds i kromosomet i en neutral locus.

Figur 2. Idealiserede eksempler på cokultur screening resultater med forskellige forhold mellem reporter: miljømæssige mikrober. A) Brug en lav reporter: miljømæssig mikrobe-forholdet fører til mere tvetydighed at identificere formodede inducerende organismer end når B) En høj reporter: miljømæssig mikrobe-forholdet anvendes. De brune cirkler repræsenterer jordorganismer de røde cirkler repræsenterer inducerer jordorganismer de blå cirkler repræsenterer uinducerede reporter kolonier, og de grønne kolonier repræsenterer induceret reporter kolonier. De stiplede røde linjer angiver aktionsradius det inducerende metabolit. Stjerner indikerer fluorescerende kolonier, der - baseret på deres nærhed til de fluorescerende kolonier - er formodede inducerende organismer og skal plukkes og testes igen i den sekundære skærm.

Figur 3. Sekundær skærm. A og B) Skema af hvordan man kan distribuere lappet eller plettet isolater på sekundære skærm plader, henholdsvis for B. subtilis matrix reporter. Kan kræves mere generøs afstand til andre journalister eller inducerende isolater, depslutter på diffusibiliteten af deres aktive metabolitter. C og D) Repræsentative resultater fra lappet jord isolater, som er negative og positive, henholdsvis for at inducere B. subtilis P _{tapa-YFP-reporter.} Toppanelerne er lysfelt billeder; lavere paneler er fluorescens billeder. Målestokken er 1 mm. E) Negativ og positive resultater fra plettet jord isolerer for den samme journalist. Målestokken er 2 mm.

Figur 4.. Bestemmelse af mikrokoloni koncentration. Fordelingen og størrelsen af dine kolonier vil både afhænge af næringsstoffer og cellekoncentrationerne. A) Forskelle i væksten af B. subtilis på 0.01x LB (øverste række) versus 0.08x LB (nederste række). Celler på 0.01x LB ikke danner ind mikrokolonier, mens tslange på 0.08x LB gør. (Bemærk, at for vores skærme vi øget næringsstof niveauer lidt fra dem, der vises her:. Fra 0.08x LB til 0,1 x LB) Disse billeder er fra 1 gl pletter af sekventielle 01:05 opløsninger på kendte cfu / ml. Ekstrapolere disse koncentrationer, at få lignende fordelinger af kolonier på tværs af en 10 cm petriskål ville kræve plating (fra venstre): 3.200.000, 640.000 og 128.000 cfu alt pr plade. Men spotting resulterer i ujævn fordeling af celler (de er koncentreret på stedet kanter) i forhold til spredning af celler over hele pladen. Således, når en næringsstofkoncentrationen er valgt, er det vigtigt at undersøge plader spredt med en række koncentrationer. Målestokken er 0,1 mm B) Disse paneler viser resultaterne af at sprede (fra venstre) 50.000. 25.000 og 5.000 total cfu pr plade på 0.08x LB plader. Fra disse billeder, valgte vi 25.000 som vores mål antal cfu / plade. Målestokken er 0,1 mm.

Figur 5. Cokultur B. subtilis P _tapa-YFP blandet med jord organismer. Overlay af lysfelt og fluorescens billede fra en cokultur skærm plade indeholdende B. subtilis P _tapa-YFP matrix reporter blandet med jord organismer. Pilespids angiver formodede inducer omgivet af fluorescens reporter mikrokolonier. Målestokken er 1 mm.

Figur 6. Demonstration af gennemførligheden af at isolere små bakteriekolonier fra cokultur plader. A og B) Disse paneler viser to muligheder for udsyn agarplader indeholdende komplekse mikrobielle samfund fra jorden. Kolonier så små som 0,1 mm kan isoleres ved anvendelse plukningen beskrevne teknikher. Top paneler er synsfeltet før koloni plukning og bundpanelet er de samme synsfelter efter koloni plukning. Røde pile angiver, hvor celler er blevet fjernet.

Discussion

En af de iboende begrænsninger i denne protokol er, at det beror på den cultivability af mikrobielle organismer. Som det er veldokumenteret ²⁴ mest mikrobielt liv på planeten, kan ikke (endnu) ikke dyrkes under dyrkningsbetingelser udforsket til dato. Således vil et stort antal interaktioner mellem mikrobielle arter, der forekommer i naturlige omgivelser gå upåagtet at bruge denne fremgangsmåde. , Da vores ønske er at ikke kun identificere eksistensen af ​​sådanne interaktioner, men så også studere de mekanismer og molekyler, der er involveret i mediering dem, evnen til at dyrke disse mikrober er imidlertid en nødvendighed. Selv inden for dyrkbare arter, er dette område blevet dårligt udforsket, hvilket gør den fremgangsmåde, der er beskrevet her et værdifuldt bidrag som en metode til at identificere kemisk medierede interaktioner mellem mikrober. Derudover, selv om dette protokol er blevet optimeret til at screene for matrix-induktion af Bacillus subtilis, kan teoretisk anvendes på ety transkriptionel fluorescerende reporter i andre bakteriearter.

En anden relateret begrænsning af denne tilgang er, at denne skærm (pr. definition) kræver cokultur. I naturlige miljøer, kan mikrober med forskellige vækstrater stadig sameksistere i rumlig nærhed samtidig udnytte forskellige miljømæssige nicher. Sådanne mikrobielle interaktioner ville gå upåagtet af vores cokultur skærm, som imidlertid kun vil tillade væksten i miljømæssige mikrober med næringsstofbehov og vækstrater, der svarer til de reporter arter. Ændringer, der ville adskille væksten af ​​de potentielle inducerende organismer fra væksten i reporter stammen er bestemt muligt. Vi forventede også, at hyfevækst af svampe - fælles i jord - kunne medføre vanskeligheder i skærmen co-kultur. Mens den korte tidshorisont i vores skærm med B. subtilis betød, at nogle svampe blev opdaget, tilføjer svampedræbende forbindelser til vækstmediet kunne minimize denne bekymring.

Evnen til at vælge en passende fænotype og genet for den fluorescerende reporter konstruktion burde ikke være svært, i betragtning af den rigdom af sekventering og transkriptionale data enten allerede foreligger, eller let opnåelige for mange bakteriearter. Men en vanskelighed med den strategi, der er beskrevet her, er behovet for at identificere vækstvilkår, der minimerer baggrundsfluorescensen din reporter stamme, så påvisning af fluorescens induktion. Identifikationen af disse betingelser ofte gøres empirisk, selvom transkriptionale data kan hjælpe denne søgning (for eksempel den flisebelægning microarray data for vækst i B. subtilis muliggør identifikation af forhold, hvor gener af interesse er dårligt udtrykt ^10). For nogle reportere denne empiriske søgning kan være udfordrende, dels fordi et udtryk for mange bakterielle fænotyper er heterogen. Med andre ord, det er sjældent at finde cETINGELSER hvor ingen celler i populationen udtrykker Fænotype X. Således, afhængig af antallet af celler inden for denne subpopulation og styrken af genekspression, kan det være vanskeligt at identificere betingelser, der giver tilstrækkelig lav baggrundsfluorescens at tillade induktion skal detekteres . Et alternativ til denne empiriske søgning efter ideelle screeningsbetingelser kan være at "tune" ekspressionsniveauerne af reporter ved hjælp af styret mutagenese. Ved at ændre promotorregionen og / eller ribosombindingsstedet for reporter konstrukt kunne baggrundsfluorescens niveauer reduceres. Dette kunne udvide nytten af ​​denne skærm ved at tillade selv gener med nogle konstitutiv aktivering skal undersøges for induktion.

Når inducerende organismer er blevet identificeret og bekræftet i en sekundær skærm, kan de fylogenetisk identificeres ved sekventering deres 16S rRNA-genet. Det er også muligt at kvantificere omfanget af fluorescerendecens hjælp _{OD600-normaliseret} plet i den sekundære skærm ^5.. Dette kan give oplysninger om, hvilke medlemmer af samfundet producerer forbindelser, der påvirker din reporter stamme og i hvilket omfang. Derfor kan det føre til hypoteser om, hvilke mikrobielle interaktioner kan forekommer i naturlige omgivelser og evnen til at undersøge mulighederne coevolution af disse producerer og responderende organismer. Andre fremtidige retninger omfatter belyse strukturen af ​​det udskilte molekyle selv bestemme virkningsmekanisme (r), hvorved reagerer organismen registrerer dette stof, og bruge det som et kemisk værktøj til at modulere bakterielle fænotyper.

Selv med de overvejelser, der er skitseret ovenfor, den her beskrevne fremgangsmåde er et væsentligt bidrag. Det undgår man er involveret i at samle et bibliotek af miljømæssige mikrober arbejdskraft, men tillader deres fysiske adskillelse og isolation ved hjælp af faste medier. Styrken af ​​denne cokultur skærm er, atdet giver et konceptuelt og teknisk enkel metode til at screene gennem tusindvis af mikrobielle arter for at identificere dem, der udskiller bioaktive forbindelser af interesse og samtidig være gældende for mange bakteriearter og fænotyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.