采用共培养，以检测化学介导的种间相互作用

Summary

细菌产生有可能影响到他们的邻居微生物的生理潜力分泌的化合物。在这里，我们描述了一个共同培养屏幕，可以检测这些化学介导的种间相互作用的混合土壤中的微生物与固体培养基上枯草芽孢杆菌的荧光转录记者株。

Abstract

在自然界中，细菌很少孤立存在的，它们不是包围，从而改变当地环境通过分泌代谢物等微生物的多样化。这些代谢产物具有调节他们的邻居微生物的生理和分化的潜能，并在建立和维护复杂的微生物群落可能的重要因素。我们已经开发了一种基于荧光共培养筛选，以确定这些化学介导的微生物的相互作用。画面涉及结合荧光转录记者株在固体培养基上的微生物环境，并允许殖民地共培养成长。荧光转录记者被设计成使得当它被表达感兴趣的特定表型选择的细菌菌株发出荧光（ 即生物膜的形成，孢子形成，毒力因子的生产， 等等 ）被筛选生长的条件下进行的磨片再此表型是不表达的（并且因此报告菌株通常是无荧光）。当环境微生物分泌的代谢物激活此表型，它扩散通过琼脂并激活荧光报道构建体。这允许待检测的诱导代谢物生产的微生物：它们是无荧光的菌落最邻近的荧光菌落。因此，该屏幕允许产生的代谢物扩散激活在记者应变特定的生理响应环境微生物的鉴定。该出版物讨论如何：1）选择合适的共培养筛选条件，二）准备的记者和环境微生物的筛选，C）进行共培养屏，四）隔离推测诱导有机体，以及e）确认其在辅助屏幕活动。我们开发这个 ​​方法来筛选土壤生物激活生物膜基质生产的枯草芽孢杆菌

Introduction

我们感兴趣的是了解细菌分泌的代谢产物是如何影响相邻的微生物的生理和发育。许多代谢产物进行了表征他们对其他微生物的生物活性的影响。两个良好描述的实例包括抗生素，抑制其它微生物的生长，而群体感应分子，从而改变其它微生物的全基因表达。然而，细菌产生有没有已知的生物活性¹许多其他的小分子天然产品。我们推测，细菌已经进化和保存产生一些代谢产物的能力，因为他们让他们在调节范围内大多数细菌存在于复杂的微生物群落的微生物邻居的细胞生理学。

枯草芽孢杆菌的细胞类型

我们一直专注于研究，涉及Bacil化学介导的微生物的相互作用LUS芽孢杆菌。这不仅是因为其为革兰氏阳性菌的模型和用于它的操作所得到的遗传工具的状态，也由于其分化为特征的细胞类型的能力。例子包括细胞，分别是：游泳;生产所需要的强大的生物膜形成的细胞外基质，能吸收来自环境的DNA，并形成孢子，等等^2。每种类型的细胞表达的特性的转录调节子，使它们的生理和/或物理上不同的从他们的遗传上相同的同胞。根据许多生长条件下，多种细胞类型中B的单个菌落中共存的各种亚群枯草芽孢杆菌细胞^3。虽然许多种细菌可以表现出类似的细胞类型异质性，这种现象已被特别好地研究了B。枯草芽孢杆菌 。

尤其是，基因是不饱和聚酯树脂在每一个特定的B的egulated 枯草芽孢杆菌细胞类型已被确定。识别这样的上调基因是这里所描述的工作至关重要，因为许多这些利益微生物的表型是很难或不可能直接观察。例如，我们不能直观地检测出性状如固体（1.5％）琼脂平板上游泳，即使B的亚群枯草芽孢杆菌细胞产生这些条件³下鞭毛。另一个例子是生物膜基质生产。基质的产生可以通过菌落形态可视化（因为它导致宏观皱殖民地），但仅限于特定的生长培养基，只有经过增长⁴多天。然而，通过了解哪些基因分化过程中被上调，我们可以构建转录记者，作为标记物的细胞分化成这些类型的细胞。

记者构造

这些荧光吨ranscriptional记者组成的启动子对细胞类型特异性基因驱动的生产报告基因，例如一个荧光蛋白。实例包括对_HAG-YFP（游泳细胞），P _TAPA-YFP（生物膜基质产生细胞）和P _SSPB-YFP（对于形成孢子的细胞），其中，P _x表示的启动子区域进行X基因。这些报道构建整合到染色体上的中立位点（ 图1和见下文），从而使表型的天然调节保持不变。但是，现在，当一个细胞表达这种表型，它也表现为一种荧光蛋白。这提供了一个可视化容易读出的特定表型行为的活化，使我们能够筛选的微生物，激活这个生理反应。虽然这样的记者，在微生物学通常被使用，它们没有被广泛地在屏幕上以便识别适用此方法之前微生物之间Ÿ代谢相互作用被描述^5。

有许多的细胞类型特异性记者菌株的设计和施工的重要考虑因素。我们已经利用专门的转录荧光记者，虽然其他类型的结构是可能的。我们不鼓励使用翻译融合作为标记物在我们的屏幕细胞类型的分化，但是，有两个原因：1）离开原生细胞类型特异性蛋白沉着的欲望，和2）认识到弥漫，细胞广泛的荧光会更容易发现比细胞内的局部泪点（常见的翻译融合）。

报告基因的选择

在决定使用转录为读出后，将报告基因，必须选择（ 如 LacZ基因，荧光，或荧光素酶）。 LacZ的有需要的至少是特殊的优势美化版设备来检测，但有假阳性微生物的环境中高得多的可能性。在我们的手中，紫胶⁺生物土壤中的微生物本底水平是高的惊人（>>土壤微生物的10％是蓝色的（紫胶^+）对X-gal的平板;数据未显示）。这可能是通过滴定培养基中的X-gal的浓度，这可被优化以允许使用的X-gal的记者，尽管我们并没有试图这样。荧光素酶提供检测灵敏度高，是最正交记者：几乎没有任何机会的环境是微生物本身发光。然而，我们发现它很难识别仪器在我们的机构，允许发光检测在整个培养皿，因为大多数被设计为仅扫描局部区域的多孔板。也可能存在于可视化发光殖民地的方式，也让同步物理是并发症olation诱导有机体。当使用受信人可能有这样的可能，我们反而选择使用荧光转录记者，这是在证明B.工作枯草芽孢杆菌 ，提供了检测和土壤生物体中低假阳性率的足够的灵敏度，并允许使用容易获得的仪器为可视化和分离步骤。

荧光基团的选择

所选的特定荧光团将取决于你的细菌种类，您所使用的琼脂培养基，和特定的荧光滤镜设置您有可用。随着我国仪器仪表中，我们发现，无论是B。枯草芽孢杆菌菌落自己和他们生长在展出较少的背景荧光，当被用于YFP（黄色荧光蛋白）过滤器，使得在我们手中了记者优于GFP（绿色荧光蛋白）的琼脂。荧光蛋白的密码子使用的是经常用于真核生物的优化，因此有必要选择荧光团从文献中已知的任一中的细菌物种的工作，或者使用组成型启动子明确地对其进行测试。是大量的不断变化的荧光蛋白变种现有^6，已在多个源^7,8，其中一些对实验⁹选择合适的荧光蛋白质明确地提供指导审阅。

启动子的选择

一个启动子的选择将在很大程度上取决于你的细胞类型或感兴趣的表型。对于生物体，如B。枯草芽孢杆菌 ，某些细胞类型特异性的报告基因已经建立在文献中。对于其他细菌菌株，研究微阵列或转录的数据将需要提供哪些基因的条件下是高度上调的信息，其中的利益，我的细胞类型s的体现。最近的一项研究编目B的转录根据使用平铺芯片¹⁰ 104不同的生长条件芽孢杆菌 。本文提供全面的信息基因在不同条件下高度上调哪些，这是非常宝贵的不太充分表征的表型。

而不是绘制精确的启动子区域的每个感兴趣的基因，我们通常只需使用序列200-500 bp的基因的启动子上游。确切的序列长度依赖于基因组的上下文：较短的区域被使用时，必须避免包括上游编码区从邻近的开放阅读框。

中性位点和整合

如何保持你的细菌菌株记者构造成为设计的荧光转录报告菌株的最后一个问题。在细菌中，目的基因经常保持在使用抗生素的选择质粒。然而，它可能无法共存期间使用抗生素而不杀死的微生物环境。如果质粒稳定地保持在你的细菌种类，它可能会成长含有质粒携带的记者在抗生素存在的细菌以制备的记者进行筛选，然后在共存本身中消除抗生素，希望该质粒将被充分地维持，以允许荧光。然而，如果质粒容易丢失更多的细菌，或胁迫条件下会丢失，这不会是一个可行的选择。在许多情况下，最好的解决方法是将本报道构建整合到细菌染色体上，允许稳定地维持记者的即使在没有选择的。为了使整合不会破坏你感兴趣的基因的正常表达调控，我们建议在染色体上的整合到一个网站异位该CAÑ​​充当“中性位点。” B.中枯草这些整合位点是基因-突变时-表达的表型在某些基本培养基（允许不用抗生素的选择应确定整合体），但不改变在富媒体的增长或产孢率，并且包括这些基因作为AMYE，LACA，的thrC，pyrD，的gltA，和萨卡 （输送到利用淀粉的能力，β-半乳糖苷，苏氨酸，尿嘧啶，谷氨酸盐，蔗糖，分别^）11-13。

而整合这些基因得到了可靠的使用多年的B。枯草芽孢杆菌 （尤其是在的AmyE和LACA），类似知识可能不提供对基因在许多其他细菌物种。利用噬菌体附着位点是中性染色体整合位点伟大的替代品：许多物种特异性^14-16，以及一般的整合位点，如Tn7转附着部位（ATT Tn7转）有已经确定，并用于基因插入在许多种细菌^17,18。

环境微生物

我们利用土壤作为环境微生物为我们的共同培养​​屏幕的直接来源。土壤中含有微生物的高度多样性，许多这些生物是天然产物来源丰富。通过使用土壤的液体悬浮液直接置于板与我们的荧光转录报告菌株（不含从土壤细菌事先隔离），我们大大简化了实验方法。土可以被用来收割后立即，或者在-80℃下以供将来使用被冻结。立即使用具有微生物的更大的多样性可能会被种植的优势，包括那些将无法生存冻结很好。它的缺点是可耕土壤生物体从这些样品中的浓度是未知的，增加了必须使用屏板的数目。德尔AYED使用具有的优点是对菌落形成单位/毫升的各土壤源可以预先确定，从而允许在每个屏板将要生长的菌落的一个优化的数目。然而，它需要的土壤生物能力经受冻结。

需要注意的是多元化宗正（ 即土壤源）诱导池似乎是更有效地识别较深入的筛查在同一土壤中的新物种间的相互作用：更大的系统发育多样性，观察在我们的基质诱导屏确定为命中额外的土壤源进行了检查，而不是筛选同一土壤源更彻底（EA柄和R. Kolter声称，哈佛医学院，未公布结果）。

概观

我们在这里描述的方法是直接在其技术要求方面。它包括：1）构建荧光转录记者在B。枯草芽孢杆菌或其他感兴趣的细菌菌种来说，2）识别条件下与记者没有被激活，3）制备本报告菌株和生物体被筛选的等份（在我们的情况下的土壤，但是其它来源可以被用来代替），4）将这些两组在固体培养基上，5）鉴定和分离推定的诱导有机体，和6），确认​​这些生物体确实激活这种表型在二级屏幕的微生物。一旦确定，这些微生物及其代谢产物为我们提供化学工具来调节细菌行为，研究细菌的生理和微生物的相互作用，并有可能作为新型支架的未来治疗性化合物。

Protocol

1。选择一个报告基因，并构建一个荧光转录记者

对于枯草芽孢杆菌：

1. 见参考图¹⁹描述的荧光转录记者在枯草芽孢杆菌建设协议的朱庇特的文章。

对于其他细菌物种：

1. 确定是在感兴趣的生理反应上调的基因。这可以是基于现有的文献中或特定条件下，微生物的转录分析。
2. 构建荧光转录记者这个基因充当的表型变化的代理。该构建体应包括这个上调的基因的启动子驱动的生产合适的荧光蛋白（ 见图1）。
3. 整合该构建到染色体上的中性轨迹。这确保了原生章感兴趣的基因的ulation不被中断，并且避免了需要的质粒的选择机制（ 例如抗生素），可能与环境微生物的生长产生干扰。

2。确定共培养条件

对于枯草芽孢杆菌P _TAPA-YFP记者：

1. 使用0.1X LB，伦诺克斯（1克蛋白胨，0.5克酵母提取物，每升0.5克氯化钠）的媒介记者，因为B。枯草基质生产是最小的在Luria肉汤^20。这种介质可以让B。枯草芽孢杆菌菌落长到亚毫米波但观察到的尺寸，同时允许从土壤中不同类群增长^5。
2. 包括100毫米MOPS缓冲，以减少潜在的pH值的变化。

对于其他细菌物种：

1. 利用转录公布的数据或实证检验各种培养条件，以确定一个地方的微生物生长，但推荐阅读。n个荧光记者是可以忽略不计（允许当记者株生长在共培养与诱导微生物被检测到其激活。）
2. 筛选从贫营养环境（如土壤）环境微生物时，使用介质，养分含量低（相对于传统丰富的微生物培养基），因为具有高营养条件提出了²¹多的时候贫营养细菌不生长。低营养培养基也降低菌落大小，增加了屏幕的吞吐量。
3. 选择具有低背景荧光和良好的光学清晰度的媒介。
4. 优化生长温度，使双方的报告菌株和环境微生物同时增长。
5. 考虑加入一种缓冲剂。在板使用缓冲区将减少检测生理pH值为^22-介导的变化的可能性，除非这种相互作用的兴趣。

3。记者准备等分

对于枯草芽孢杆菌P _TAPA-YFP记者：

1. 从-80℃冷冻股票数报告菌株上用无菌牙签或涂药棒新鲜的LB平板。
2. 一夜之间成长在30°C
3. 在液体培养基中进行连续稀释，尽量减少从生长在固体培养基上产生的背景荧光：
   1. 接种LB的5毫升的液体培养和振荡，在37℃下生长
   2. 当培养物达到外径_600〜0.6，稀释到5ml新鲜LB至0.02外径_600。
   3. 振荡培养直到达到外径_600〜0.6再次增长在37℃。
   4. 重复序列的增长稀释共有3倍的。
   5. 让我们最后连续稀释培养成长为外径_600〜0.4。
4. 加入甘油至15-20％。
5. 分装50-200微升，用0.5 ml离心管中，并冻结在-80°C。
6. 妈（他们会二次筛选过程中需要）科相当于等份记者的非荧光母株。

对于其他细菌物种：

1. 使用的细胞，具有低背景荧光（ 即正在条件下有自中，记者使用的启动子表达的小下生长）。
2. 令和冻结包含报告菌株已知CFU /毫升（菌落形成每毫升为单位）等分，使菌落适当数量可以在每个屏幕上共培养板中生长（参见上面的内容）。
3. 使相当于等分的非荧光亲株（他们将二次筛选过程中需要）。

4。获取土壤样品

1. 收集到的土壤无菌锥形管或用刮刀无菌袋，丢弃前0.5厘米暴露表面的土壤。
2. 加无菌生理盐水（0.85％NaCl）中以每1克10ml的比例的土壤，使土壤泥浆。
3. 选择一个方法，从土壤颗粒赶走细菌：1）直接使用新鲜样品或b）样品冷冻后延迟使用。
   1. 可立即使用，涡流浆料1分钟。
   2. 对于延迟使用，混合土壤泥浆搅拌机中三个1分钟周期，把搅拌杯冰上1分钟休止符混合周期之间。
4. 让土壤泥浆沉降〜1分钟。
5. 移动上面的水层至新管。
6. 添加甘油至15％-20％的最终浓度。
7. 分装50-200微升，用0.5 ml离心管中，并冻结在-80°C。

5。决定冻结记者土壤等分的CFU /毫升

1. 解冻冻结的土壤和记者等分。土壤中的微生物可以在冰上解冻。由于二枯草裂解，在4℃，这些等份应迅速解冻在RT，以尽量减少在低温下使用的时间。
2. 使两个重复赛瑞亚升稀释液（10 ^-8）的0.1倍LB或其他等渗缓冲。
3. 板5微升斑点各系列稀释到将被用于共培养筛选的相同培养基的琼脂平板上的。
4. 生长在RT（或将要使用用于筛选的温度）。
5. 第二天，计数菌落数的每个点内，并计算各冷冻等分试样的菌落形成单位/毫升。

6。确认分装浓度为传播筛板

1. 解冻冷冻等分如步骤5.1。
2. 稀释至1×10 ^{5，2.5×10 5，5×10 5，1×10 6}和2.5×10 ⁷ CFU /毫升。
3. 将每个稀释50μL点至个别板块的中心。这些应该产生板，每板25000菌落计算出的最佳值，以及2 - 和5 - 倍多和少，允许要确定的最好的实际稀释。
4. 加入约20无菌玻璃（3毫米），由珠轻轻拍打它们拖到板。珠提供了整个板块分布更均匀的菌落比热弯玻璃吊具一样。
5. 通过保持板在台式和他们摇晃来回，旋转它们，你的工作，直至液体被吸收分散细胞。不要继续摇晃珠一旦板是干燥的，否则它会开始杀死细菌。
6. 在翻转板和丢弃珠串成含乙醇的废物烧杯中。
7. 让板在正确的温度下生长的实验（ 如 24小时）的时间为您的检测（ 如 24℃/ RT）。
8. 用解剖体视镜，计数菌落在视图中的两个或多个字段的数量。
9. 计算每个区域的菌落数，并确定有多少菌落在每个板。
10. 调整将来的稀释是必要的。菌落的实际数量是不为对各可比屏板相同数量一样重要。

1. 记者解冻等分（如果冻土等分），如步骤5.1。
2. 在0.1倍LB或其他低营养，等渗溶液稀释记者（于浓度在第6优化）。
   1. 冻土：稀释到浓度在0.1倍LB或其他低营养，等渗溶液第6条进行了优化。
   2. 对于新鲜的土壤：使新鲜的土壤泥浆稀释，基于预测的土壤泥浆的CFU / ml的范围可以从10 ^{-4〜10 -9} CFU /毫升。
3. 现货50微升的土壤和记者稀释到共培养屏板的中心。此外，独板的土壤和单独作为对照组的记者。
4. 传播与步骤6.4-6.6描述使用玻璃珠。
5. 如果有激活荧光报告，条纹或板块的记者在这些条件下，成长为在筛查阳性对照用已知的生长条件。 孵化在24℃，24 - 28小时（或适用于您的报告/分析）

8。屏幕共培养板的荧光

1. 使用明照明，集中你的体视镜，使殖民地是雪亮的。
2. 看土板只有以确定您的土壤样品是否已经自发荧光的菌落。如果是这样，这种土壤可能导致高误报率（在第二次筛选随之增加）。
   1. 使用高比率记者：在你的共培养板的土壤，以增加的可能性，诱导将由多个记者菌落包围，减少它们将被检测为假阳性的可能性（ 图2）。
   2. 使用不同的荧光蛋白（一个发射在不同的频道）。
3. 确定所述测定时间。对于大多数新记者，潜在诱导的定时是未知的，因此必须根据经验来确定。
   1. 立即开始殖民地成为清晰可见的解剖体视镜（放大倍率〜30X），并继续定期检查板，直到增长已经停止和/或背景荧光过高筛查荧光。
   2. 一旦潜在的诱导的时间窗口被确定为一个特定的记者，它应该是相似的包含该记者所有共培养板，简化了屏板的监测。为B。枯草 P _TAPA-YFP记者，适当的时候来检查板是24-28小时之间电镀细胞后，为B。枯草 P _SSPB-YFP记者，这是26-32小时增长之间。
4. 最大限度地发挥你的荧光灵敏度：
   1. 确保你的荧光解剖范围是在一个黑暗的房间或遮光窗帘包围。感应可能会比一个组成生产的FP那么激烈，需要更高的敏感拉了一检测。
   2. 等待一段时间以荧光灯为稳定和你的眼睛试图从你的共培养板（至少1-2分钟）荧光检测前适应黑暗。
5. 采用阳性对照（如果有的话），请确保您所使用的放大倍率，可以检测荧光。放大倍率通常是最好的，如果你的视野大约是30-50X典型的菌落直径（200-400X）。
6. 关闭亮光，打开快门为您的荧光。
7. 之后，你的眼睛已经适应了黑暗，慢慢移动板来回穿过你的视野，寻找亮点。
   1. 开始从板的顶部，并使用之字形图案移动板一侧到另一侧，你向板的底部移动。
   2. 实践移动板在明得到的感觉如何慢慢移动到板上，以确保您所覆盖整个河畔面对区域。
   3. 移动板慢慢就好了殖民地不变得模糊。这是更好地过采样表面，而不是错过的地方。
   4. 后一个完整的扫描，把板90°，重复。人类的眼睛是在通过这种方法检测，即使微弱的荧光非常好。
8. 如果检测荧光，停止移动板回去找荧光区。
9. 转动明上慢慢地，确定与细菌菌落（而不是自身荧光土壤碎屑或媒体组件）的荧光是否相关联。如果是这样，非荧光菌落近端向荧光菌落是推定诱导有机体。

9。隔离推定诱导有机体

1. 一旦诱发（荧光）的殖民地已经确定，隔离这些菌落分泌诱导化合物。
   1. 如果足够高的浓度记者菌落是长在板（> 0.5:1记者：土壤菌落形成单位），则推定诱导的菌落会由多个荧光菌落包围（再次参见图2）。
   2. 在情况下，共培养成长的复杂性使得它含糊其殖民地的诱导剂，隔离多个潜在诱导的菌落为随后的测试中次要屏幕。
2. 本地化您想选择在视场中心的殖民地。
   1. 如果它们是靠近所述板的边缘，旋转板，使该板的唇距离的优势手（ 即 ，如果你是右利手，把该板的唇在左侧）。这可以让你接近殖民地以低角度，从而提高您采摘的准确性。
3. 将新鲜的板，条痕假定诱导有机体到附近，以及废烧杯中所用的技巧丢弃到。
4. 离开荧光灯泡上，把明亮的灯光慢慢上，这样你就能够识别（通过形状和位置），荧光菌落和周围的假定诱导有机体。你可能需要去来回光几次能够确定你要挑的时候没有荧光，只有明亮的光线殖民地。
5. 用玻璃棒（200毫米直径的毫米（长）x 5）拿起无菌，圆200μL凝胶加载提示，并拿着它就像一支铅笔。这是采摘工具，你会用它来分离单个菌落。
6. 休息你的手掌外侧打击阶段，以稳定其工作表面上。将你的手的内侧，拇指侧另一只手来稳定你的采摘工具。
7. 如有必要，再次翻转荧光和明之间的意见，以确定你要挑菌落。
8. 保持板面以上枪头，把它移动到你的视野和居中的殖民地上面你想挑。针尖会失焦。
9. 用你的手的外缘（这是搁在显微镜载物台或工作表面），转动枪头慢慢下到殖民地被拾起。触摸它很轻，试图尽量减少多少其他殖民地的尖端接触。
10. 不旋转的拾取工具，条纹到新鲜平板的截面图。用柔软的触感蔓延到避免过切的琼脂。因为通过该方法转移细胞的数量是相当小的（菌落都远小于通常操作），一个单一的连续的条纹将导致隔离的菌落。
11. 与其他公认的诱导有机体重复此过程。
12. 孵育板在24°C（或您的检测的温度）。

10。数推定诱导有机体获得分离的单菌落

1. 使用立体镜，确定 - 基于群体结构或形态 - 是否有包含在你的每一个假定的挑IND不同的群体类型ucing生物。
   1. 看看使用阶段，你可以照亮从两个以上，以及从下面的殖民地，以发现潜在的群体差异的殖民地。
2. 重新划每个不同形态类型到一个新的板块和孵化，直到成长。
3. 重新划一次，让成长。如果不同的形态类型仍然存在，继续重新划到纯洁。

11。复试推定诱导有机体中学屏

1. 重新测试所有的二级屏幕的假定诱导有机体，以确定哪些正在激活荧光转录记者。第二屏幕由一个草坪荧光转录记者株菌落，随着控制盘，其上公认的诱导有机体修补或发现的。
2. 设置三个相同的板：1含有荧光转录报告菌株的菌落草坪（在相同浓度下一个S为在共培养筛选使用）;含有无荧光报道与野生型亲代菌株的菌落草坪1，和一个不包含草坪。
   1. 标记每个板的背面的顶部，以确定板的方向。
   2. 加为补丁/斑点的位置标记;高达10推定的诱导有机体可以在每个板组（ 图3）进行测试。
   3. 解冻草坪等分（记者和非荧光亲株）如步骤5.1。
   4. 用无菌小珠，如步骤6.4传播50μl的5×10 ⁵ CFU / ml的稀释液到草坪板（或其它优化的稀释液）。
   5. 让板干燥。
3. 修补或现货推测诱导有机体：
   1. 选择补丁如果一个更容易和更快的方法是需要的，并且它是可以接受的细胞沉积的不太精确的数目。修补：
      1. 触摸无菌牙签将菌落测试 - 不要拿起所有的细胞。
      2. 补丁（做一个小的条纹）到空白盘。
      3. 补丁重复用新鲜牙签到记者板上。
      4. 补丁重复用新鲜牙签到控制板。
   2. 选择点状出血，如果一个定量的和可重复的方法是需要的。斑点允许进行归一化沉积的细胞数量（参见附图5为完整的细节），并允许不同的诱导有机体进行比较的相对效力。被发现：
      1. 重悬推定诱导有机体的1毫升液体培养基的无菌塑料试管中。
      2. 就拿外径₆₀₀的再悬浮的。
      3. 用公式X = 250÷（外径₆₀₀ - 0.5），体积×各悬浮加入500微升液体介质得到一个解决方案，外径₆₀₀ 0.5。执行多个稀释时正常化外径的，因为你可以用相同体积（50此方法简化了所需的移液步骤0微升）为您的所有dilutants的。
      4. 现货1微升每个外径标准化悬浮到每个三大板块组成。
4. 让成长在24℃，24〜28小时（或适用于您的报告/分析）。
5. 使用荧光解剖显微镜来识别假定的诱导有机体激活荧光报告菌株，但不是你父母的对照菌株。这些菌株是你的正面命中 - 分泌诱导你感兴趣的表型化合物对环境的微生物。

Representative Results

这个屏幕被用来确定土壤生物体分泌，从而改变B的生理学化合物枯草芽孢杆菌 。此处描述的结果集中在B的基质产生细胞类型枯草芽孢杆菌 ，其产生所必需的强大的生物膜形成这种细菌的蛋白和胞外多糖。我们选择了TAPA-sipW-TASA操纵子的启动子为我们的荧光报告基因构建体（P _{TAPA-YFP）。}此操纵子编码矩阵的蛋白质结构部件和生物膜基质生产²³期间被上调。我们的记者矩阵（ 图1）是如前所述¹⁹构成。

以前的工作表明，B。枯草芽孢杆菌产生的矩阵响应于所述自产群体感应样分子枯草，以及由其它的土壤细菌²⁰产生的纯化的代谢物。我们有兴趣扩大本身的研究，以探讨更广泛的土壤中的微生物使代谢产物能诱导基质生产B的枯草芽孢杆菌 。我们选择采用稀LB的增长，因为这种媒介已经知道导致不良基质生产^20，为我们提供了生长条件，其中本报记者菌株无荧光。我们然后优化适合于在这些生长条件下筛选的菌落数。为了优化各个筛板，有必要确定多少菌落从冻土和记者等分生长和什么菌落和营养条件的适当浓度是。理想地，我们希望每一个共培养板含有土壤和记者菌落的等效数（ 即以1:1的比例记者：土），也可以紧密间隔的，单独的菌落。记者菌落如此高的比例增加的可能性，诱导剂会激活多个周围记者的殖民地。拥有多交流tivated诱导菌落周围的假定诱导剂菌落增加信心查明实际诱导有机体（ 图2）。营养成分控制的生长/集落形成的程度，而接种的稀释度确定是否将所得的菌落被适当地分散。在一个标准的10厘米直径的培养皿，低营养培养基中，我们发现，约25,000总菌落每板（50μL5×10 ⁵ CFU /毫升稀释）提供B的最佳分离于0.1倍的LB培养基中的MOPS（ 图4） 枯草杆菌菌落。

虽然从系列稀释的计算CFU / ml的细菌提供了在等分的近似浓度，有必要确保所得到的菌落的浓度是合适的，当整个盘被扩大与细胞。计算CFU /皿和实际CFU /皿并不总是相同（ 图4

准备记者和土壤等分后，我们把它们混合在共培养屏板和使用立体镜（ 图5）检查他们的荧光。我们还镀控件，只接种两种土壤或B。枯草 P _TAPA-YFP报告菌株。B.枯草芽孢杆菌产生生物膜基质（荧光）响应于从土壤大量微生物如在图5中的共存图像看到的荧光菌落。对于我们研究了土壤，我们有一个高的命中率在P _TAPA-YFP记者。作为参考5之间的菌株12-67％（从六个不同的土壤样品）中描述有能力INDUCE荧光在P _TAPA-YFP报告菌株。这与我们使用的产孢（P _SSPB-YFP）和能力（P _COMG-YFP）记者类似的屏幕未公布结果。经过广泛的筛选（> 200,000菌落每个记者），只有两种生物进行鉴定的​​诱导孢子形成，而没有被确定诱导能力。因此，命中率对不同细胞类型变化很大，可能很难提前预测。

然后我们选择个人推测诱导殖民地。在共培养筛板的殖民地是相当小的低营养培养基上，我们建议（亚毫米直径）。然而，也能够准确地从复杂的共存屏板内接，并用手分离非常小集落（ 图6）。我们使用手动的方法很简单，既不需要专门的工具，也不火焰消毒。这些假定诱导的菌落，然后restruck隔离。因为共培养板都挤满了殖民地，这是不寻常 - 即使是非常仔细的采摘技术 - 有一个以上的有机体从每个推定的诱导剂样品成长。仔细检查应允许形态不同的菌落隔离。所有推定的诱导有机体，然后在二次筛选测试。从双方的贴片和斑点法阳性和阴性结果示于图3。考虑到他们的密集增长，我们的能力，以物理方式收集诱发殖民地从共培养板还是挺不错的，与审查我们的中学屏是真阳性菌落约50％。从这个屏幕的其他结果，以及后续工作摆脱它先前已被描述^5。

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图1。荧光转录报道构建。蓝色椭圆表示细菌细胞和虚线表示其染色体中。这个例子显示了一个荧光转录记者对生产基质。天然轨迹保持不变（P _矩阵 - _矩阵 ，其中“P”和箭头指示的启动子区域），而报道构建（P _矩阵 -YFP）的别处插入染色体中的中性轨迹。

图2。环境微生物：用不同比例的记者共培养筛查结果理想化的例子。 A）使用一个低记者：环境微生物的比例会导致更多的歧义识别假定的诱导有机体比当 B）高记者：环境微生物的比例使用。棕色的圆圈代表土壤生物体，红色圆圈代表诱导土壤生物体，蓝色圆圈表示未诱导的记者菌落，而绿色菌落代表感应记者菌落。虚线的红色线表示诱导代谢产物的作用半径。星表明，无荧光的菌落 - 基于其接近荧光灯的殖民地 - 是公认的诱导有机体，应挑选并重新测试的二次筛选。

图3。二次筛选。如何分发修补或隔绝发现在二级筛板，分别为B。A和B）示意图枯草矩阵记者。更慷慨的间距可能需要其他记者或诱导菌株，DEP其活性代谢物。C和D）从修补土壤代表株结果是阴性和阳性，分别为诱导B的扩散结束枯草 P _TAPA-YFP-记者。顶面板的明场图像;下面板的荧光图像。比例尺为1毫米。E）阴性，从 ​​斑点土阳性结果株为同一记者。比例尺为2毫米。

图4。菌落浓度的测定。您的殖民地的分布和规模将养分和细胞浓度取决于无论是在B的成长A）的区别枯草芽孢杆菌对0.01X LB（上排）与0.08X LB（下排）。在0.01X LB细胞不形成成菌落，而T软管上0.08X LB做。 （请注意，我们的屏幕上我们增加了营养水平稍微与此处所示：从0.08X磅至0.1倍LB）这些图像是从连续的1:5稀释液在已知的CFU / ml的1微升的斑点。从这些浓度外推，得到菌落跨越10厘米的培养皿相似的分布，需要电镀（左起）：3,200,000，640,000，128,000及总菌落每盘。然而，点滴出血导致细胞分布不均匀（它们都集中在现场边）相比，在整个板块蔓延细胞。因此，一旦一个养分浓度被选择时，它检验平板上用各种浓度是重要的。比例尺为0.1mm B）这些面板显示左蔓延（）50,000结果; 25,000元;每片5,000 CFU总在0.08X LB平板。从这些图片中，我们选择了为25,000 CFU /皿我们的目标数量。比例尺为0.1毫米。

图5。 B的共培养枯草 P _TAPA-YFP 与土壤生物混合。叠加明和荧光图像从一个包含B。共培养屏板枯草 P _TAPA-YFP矩阵记者与土壤生物混合。箭头表示假定诱导荧光微菌落记者包围。比例尺为1毫米。

图6。演示从共存板隔离微小的细菌菌落的可行性。 A和B），这些面板显示的视图包含从土壤中复杂的微生物群落琼脂平板上的两个领域。菌落微小，只有0.1 mm们可以使用所描述的采摘技术分离在这里。顶面板的视野之前菌落采摘，和底板都是视图菌落采摘后的相同的字段。红色箭头指示的地方细胞已被删除。

Discussion

其中本协议的固有的局限性在于，它依赖于微生物有机体的培养力。由于已经有据可查^24，大多数微生物的生命在这个星球上不能（还）进行探讨，以当日的培养条件下生长。因此，一个巨大的正在发生在自然环境中的微生物物种之间的相互作用的数量会使用这种方法去未被发现。然而，由于我们的愿望是，不仅确定这种相互作用的存在，但后来也学习参与调解他们的机制和分子，培养这些微生物的能力是必要的。即使在耕种的物种，这方面已经探索不佳，使得此处描述的方法作出了宝贵贡献作为一种方法来识别微生物之间的化学相互作用介导的。此外，尽管该协议已经被优化以筛选基质诱导的枯草芽孢杆菌 ，其理论上可以应用到Ÿ转录荧光记者在任何其他的细菌种类。

这种方法的另一个相关的限制是，该屏幕（根据定义）需要共存。在自然环境中，微生物具有不同的增长率仍可能共存于空间上的接近，同时利用不同的环境利基。这样的微生物的相互作用会但是检测不到由我们的共同培养​​的屏幕，这将只允许环境微生物与营养需求和类似于那些记者物种的生长速率生长。修改，将分离出的潜在诱导有机体生长的报告菌株的生长是可能的。我们还预计，真菌的菌丝生长 - 在土壤中常见 - 可能导致困难的共培养画面。虽然我们与B屏的短时间尺度枯草意味着检测到少数真菌，加入抗真菌化合物的生长培养基可以米inimize这种担忧。

选择合适的表型和基因为荧光报道构建体的能力，不应该是困难的，考虑到大量测序和转录数据不是已经可用的，或容易获得的许多细菌种类。然而，一个困难此处所描述的方法是需要确定的生长条件，最大限度地减少您的报告菌株的背景荧光，使检测荧光诱导的。这些条件的识别通常必须凭经验来完成，虽然转录数据可以辅助这一搜索（例如可用于枯草芽孢杆菌的生长的平铺微阵列数据允许识别的，其中感兴趣的基因的表达¹⁰不良的情况下）。对于一些记者，经验性的搜索可能是具有挑战性的，部分原因是很多细菌的表型的表达是异类。换句话说，它是罕见的求conditions内的人口没有细胞表达表型X.因此，根据该亚群和基因表达的强度内细胞的数量，其中，它可能难以识别出提供足够低的背景荧光，以允许被检测诱导条件。对此的一种替换经验性搜索理想筛选条件可以是“调节”使用定向诱变记者的表达水平。通过改变启动子区和/或所述报道构建的核糖体结合位点，背景荧光水平可被降低。这可以通过让被检查的诱导，甚至基因与一些组成性激活扩展这个屏幕的用处。

一旦诱导有机体已被确定，并在二次筛选确认，可以将它们在系统发育上确定了测序的16S rRNA基因。另外，也可以对量化荧光的程度cence使用外径_600-现货归在第二屏^5。这可以提供有关哪些社区成员产生影响您的报告菌株，并在何种程度上的化合物。因此，这可能会导致假设微生物的相互作用可能在自然环境中，并探讨这些生产和应对生物的潜在协同进化的能力而发生哪些。其它未来方向包括阐明分泌的分子本身的结构，确定由该响应生物体检测该化合物的机制（次），并用它作为化学工具来调节细菌的表型。

即使在考虑以上所述，此处所描述的方法是一种显著作用。它避免了涉及装配环境微生物库的劳动，但允许其物理分离和离析通过使用固体培养基。该共培养屏幕的优势在于它提供了一个概念上和技术上简单的方法，通过数以千计的微生物物种筛选，以确定那些分泌感兴趣的生物活性物质而被应用到许多细菌种类和表现型。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.