Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Summary

Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.

Abstract

Un trabajo reciente demuestra que el sistema nervioso central (SNC) la regeneración y la tumorigénesis involucra poblaciones de células madre (SCS) residentes en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos de estas células normalmente quiescentes emplean para garantizar el buen funcionamiento de las redes neuronales, así como su papel en la recuperación de la lesión y la mitigación de los procesos neurodegenerativos son poco comprendidos. Estas células residen en las regiones a que se refiere como "nichos" que ofrecen un ambiente sustentable que implica señales moduladoras tanto de la vascular y el sistema inmunológico. El aislamiento, el mantenimiento, y la diferenciación de las SC SNC bajo condiciones de cultivo empleadas que excluyen factores desconocidos, los hace accesibles a tratamiento por medios farmacológicos o genéticos, lo que proporciona una idea de su comportamiento in vivo. Aquí le ofrecemos información detallada sobre los métodos para la generación de culturas de las SC SNC desde distintas regiones del cerebro adulto y enfoques para evaluar su dpotencial ifferentiation en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in vitro. Esta técnica produce una población de células homogénea como un cultivo en monocapa que se puede visualizar para estudiar las SC individual y su progenie. Además, se puede aplicar a través de diferentes sistemas de modelos animales y muestras clínicas, siendo utilizado previamente para predecir respuestas regenerativas en el sistema nervioso adulto dañado.

Introduction

El dogma central de la neurobiología, establecido por las observaciones fundamentales de la citoarquitectura cerebral realizada por Ramón Y. Cajal hace más de un siglo, sostuvo que la neurogénesis es poco probable después de la adolescencia debido a la complejidad de las redes neuronales que se encuentran en el sistema nervioso central ^1. A pesar del trabajo de Altman en la década de 1960, y más tarde de Kaplan, lo que demuestra que ³ H-timidina se pudo encontrar en neuronas maduras que indican que, de hecho, las neuronas se generaban en distintas áreas del cerebro adulto, el dogma continuó manteniendo ^{2, 3.} Evidencia continuó creciendo con la investigación de Nottebohm describiendo los cambios estacionales en el número de neuronas presentes en los cerebros de pájaros cantores ^4. No fue sino hasta 1999, cuando Gould et al. Trabajo publicado en la generación de neuronas en el hipocampo aumenta con el desempeño de las tareas de aprendizaje asociativo, en la rata, así como las observaciones de Kornack y Rakic ​​demostraciónTing continuó la neurogénesis en el macaco adulto que el concepto de un cerebro menos rígida, más plástico, se reconoció ^{5, 6.}

La búsqueda de la fuente celular para estas neuronas generadas de novo condujo al descubrimiento de una discreta población de células madre (SCS) que residen en áreas del cerebro conocida como nichos ^7. La zona subventricular y la zona granular sub del hipocampo se considera que son las dos principales regiones neurogénicas ^8,9. Las células aisladas de estos lugares muestran la característica clásica de las SC derivados embrionarios o fetales, la auto-renovación y diferenciación potencial. En el caso de las células madre neurales (NSC), que pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Además, estos SC tinción positiva para los marcadores NSC fetales, tales como la proteína de los filamentos intermedia nestina ^10. Trabajos más recientes destaca que las SC no puede estar limitada a estos two áreas, y están, de hecho, localizada en el cerebro como una población en gran parte inactiva de células estrechamente asociadas con la vasculatura ^11.

Las observaciones de que las SC se movilizan en respuesta a la lesión sugiere la posibilidad de ser capaz de utilizar estas células con fines regenerativos para ayudar en la recuperación de los trastornos neurodegenerativos y los accidentes cerebrovasculares ^{12, 13.} Esto no es a diferencia de la función que las células madre mesenquimales (MSCs) juegan en la curación de los tejidos conectivos, que se encuentran como células perivasculares que tienen el potencial de convertirse en osteoblastos, condrocitos, y células de tejido adiposo ^14. Sin embargo, NSC no pueden ser cosechadas en la misma forma que las MSC de la médula ósea por aspiración de rutina y técnicas de centrifugación en gradiente de densidad y posteriormente utilizados en terapias basados ​​en células autólogas. Como consecuencia, otras fuentes de células, tales como el uso de NSC fetales o precursores neuronales derivadas de embcélulas madre ryonic han explorado extensivamente en enfermedades de los animales y modelos de lesión con diversos grados de éxito ^15. Tecnologías de células madre pluripotentes inducidas que utilizan fuentes de células somáticas ofrecen otra vía potencial para la producción de terapias basadas en células terapéuticamente útiles para una amplia gama de aplicaciones, la superación de la limitada disponibilidad y preocupaciones éticas con respecto al uso de células embrionarias y tejidos fetales ^16. Sin embargo, la traducción clínica de estos hallazgos ha demostrado ser una tarea difícil, como se demuestra en las luchas de el tratamiento de diversas enfermedades neurológicas con terapéutica basada en SC enfoques ^17,18, así como un camino tortuoso a la aprobación regulatoria. Como un enfoque alternativo, la introducción de los tratamientos farmacológicos específicos puede modular los números de NSC y facilitar la recuperación en los modelos de la enfermedad de Parkinson y accidente cerebrovascular ^19. Cualquiera que sea la estrategia podría ser, entendiendo cómo manipular eficazmente estas célulasrequiere un sistema accesible in vitro.

Culturas del NSC se pueden realizar ya sea como agregado culturas, también conocidos como neuroesferas, o como una monocapa ^8,20. Ambas técnicas se han utilizado ampliamente, lo que permite el establecimiento de condiciones de cultivo definidos, es decir, el uso de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) como una fuente de mitógeno, que proporcionan para la expansión de precursores multipotentes. Mientras que los cultivos de neuroesferas pueden ser más adecuados para el estudio de la capacidad de propagación clonal de un tipo de célula aislada, el sistema se ha demostrado que produce una población mixta de células durante la expansión ^21. Además, la estructura cerrada de neuroesferas hace que la manipulación farmacológica de las células poco práctico, y la interpretación de la influencia de estos factores pueden tener podría ser confundido por el microambiente establecido dentro de la propia neuroesfera. Los cultivos monocapa, por otro lado, pueden serempleado en las pantallas de alto rendimiento de bibliotecas de pequeñas moléculas, que proporciona una poderosa herramienta para explorar los mecanismos de transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación SC y se abre la oportunidad de descubrir nuevos compuestos que se dirigen específicamente a esta población celular.

Como consecuencia, la capacidad de generar de forma reproducible culturas de NSC adultos de diferentes regiones de interés en el cerebro se puede utilizar en un amplio espectro de aplicaciones de investigación, que van desde los estudios del desarrollo del sistema nervioso central (SNC) para explorar enfoques de medicina regenerativa nuevos . El protocolo presentado aquí muestra cómo diseccionar y evaluar el potencial de diferenciación de las SC SNC aislados del cerebro de roedores adultos.

Protocol

El trabajo se adhiere a la Declaración de Helsinski y la Declaración Animal ARVO. Los animales fueron utilizados para la recogida de tejido y se siguieron todos los procedimientos pertinentes de acuerdo con las instrucciones del Bioterio de la Universidad de Dresde. Los animales fueron tratados y acomodados de acuerdo con las pautas federales alemanes para el uso y cuidado de animales de laboratorio, y el estudio fue aprobado por el Landesdirektion Dresden. Por favor, consulte con la política veterinaria de su institución (IACUC o el otro tablero) con respecto a la metodología de la eutanasia apropiada.

Títulos concretos y las concentraciones de trabajo de los reactivos se pueden encontrar en las Tablas de reactivos que acompañan este protocolo.

1. Dish Cultura Preparación

1. Platos capa con un volumen suficiente de 75 mg / ml de poli-L-ornitina (es decir, 2 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos) durante la noche en la incubadora de cultivo celular 2 días antes de la fecha programada de disección.
2. Retire el lavado final, a continuación, agregar la fibronectina (diluido 1:250, 4 g / ml en PBS) a la placa y colocar los platos en la incubadora durante la noche.
3. Aspirar la fibronectina en el día de la disección y lavan los platos 2x con PBS. Vuelva a poner las placas todavía contienen la PBS de lavado final a la incubadora hasta que el tejido disociado está listo para el cultivo. En ese tiempo, retirar el PBS antes de la galjanoplastia del tejido.
4. Placas tienda recubiertos con poli-L-ornithinein la incubadora durante un máximo de 3 semanas. Las placas recubiertas con fibronectina pueden almacenarse hasta por 1 semana. Recubrimiento fibronectina se puede hacer en tan sólo 2 horas en caso de urgencia. La fibronectina es susceptible a la desnaturalización; no agitar la solución o permiten secado de la vajilla.

2. Disección / Revestimiento

1. Este protocolo se aplica a la utilización de 3 ratas adultas (3-6 meses de edad).
2. ChilL el cerebro de seccionamiento de bloques en hielo antes de la eutanasia de la rata.
3. Colocar un tubo Falcon de 15 ml que contiene 5 ml de medio N2 con adición de bFGF en hielo.
4. La eutanasia a las ratas de acuerdo con la política veterinaria de su institución.
5. Retire el cerebro contra el cráneo al hacer una incisión en la línea media de la cabeza. El uso de fórceps para despegar el hueso que permite al cerebro a extraer con cuidado.
6. Coloque el cerebro en un plato de Petri de 10 cm que contiene hielo frío PBS. Esto eliminará cualquier pelo residual y sangre. (Figura 1A)
7. Coloque el cerebro en el bloque de corte frío. (Figura 1B)
8. Inserte una nueva hoja de afeitar limpia en el bloque como se muestra en la Figura 1C.
9. Inserte una segunda mm caudal de afeitar limpia hoja 3 a la primera, como se ilustra en la Figura 1D.
10. Levante con cuidado las hojas de la manzana, llevando con ellos la sección de interés.
11. Flote el secCIÓN fuera de la hoja por inmersión en PBS. (Figura 1)
12. Tejido de cosecha de la zona de interés (en este ejemplo se utiliza la comisura anterior, (anterior) ACA, Figura 1F) usando # 5 pinzas y recoger en un tubo cónico de 15 ml que contiene 1 ml de medio N2 contiene bFGF.
13. Mueva el tubo en una campana de cultivo de células de flujo laminar, continua el resto del protocolo en condiciones estériles.
14. Mecánicamente disociar el tejido usando una punta de pipeta de 1 ml unido a una pipeta P1000. De pipeta arriba y abajo varias veces (aproximadamente 20x a una velocidad de 1 ciclo de pipeteado por segundo) mientras presiona la abertura de la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo cónico (Figuras 1G 1-3). Deja de trituración cuando la solución se vuelve homogénea.
15. Deje que la solución repose durante 2 min para permitir que cualquier tejido no disociada grandes se asienten en el fondo. (Figura 1G 4)
16. Recoger el homogeneous sobrenadante y colocar en un tubo cónico que contiene 8,5 ml de medio N2 más 20 ng ml bFGF /, 500 ng ml Dll4 /, 500 ng / ml Ang2 y 200 nMJAK inhibidor.
17. Placa de ellos en 3 pocillos de una placa de 6 pocillos usando 3 ml de solución diluida de células / pocillo.
18. Colocar la placa en un incubador de células humidificado a 37 ° C, 5% de CO _2, 5% de O _2.

3. Cuidado Diario

1. Sustituya el medio en las placas de cultivo con N2 medio que contiene bFGF, Ang2, Dll4 y JAK inhibidor de 24 horas después de la siembra.
2. Añadir un bolo de bFGF, Dll4, Ang2, y el inhibidor de JAK en el día siguiente.
3. Continúe con este proceso de alternancia de los cambios de medios y adiciones de los factores para un total de 10 a 14 días.

4. Inducción de la diferenciación

1. Retirar bFGF, Dll4, Ang2 y JAK inhibidor que contiene medio y sustituirlo por medio N2 que no contiene ningún factor adicional.
2. Cambie el medio cada dos días.
3. Fijar las células después de 10 días y realizar inmunocitoquímica.

5. La detección inmunocitoquímica

1. Aspirar el medio y fijar placas de cultivo de células con 2 ml de 4% de paraformaldehído durante 20 min.
2. Lavar 2x con 3 ml de PBS durante 5 min cada uno.
3. Aspirar PBS, a continuación, permeabilizar las células y bloquear mediante la adición de 2 ml de PBS que contenía 5% de suero normal de burro (NDS) y 0,1% de Triton X-100 durante 20 min.
4. Preparar la mezcla de anticuerpo primario en PBS que contenía 5% de NDS. El anticuerpo anti-nestina se puede utilizar para la identificación de los SC, mientras que TuJ1 (clase III β-tubulina), los anticuerpos GFAP, y CNPase se puede utilizar junto para un triple tinción de marcadores de diferenciación.
5. Aspirar la solución de bloqueo y añadir 1,5 ml de la mezcla de anticuerpo primario a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 90 min.
6. Eliminar los anticuerpos primarios y lavar 2 veces con 3 ml de PBS, y 1x con 3 ml de PBS que contenía 5% de NDS durante 5 min cada uno.
7. Prepare la secundaria de anticuerpos en PBS que contenía 5% de NDS.
8. Aspirar el lavado final y añadir 1,5 ml de solución de anticuerpo secundario a cada pocillo. Incubar en la oscuridad durante 40 min a temperatura ambiente.
9. Retire la solución de anticuerpo secundario y agregar 2 ml de una mancha DAPI recién preparada (500 ng / ml en PBS). Incubar durante 3 min.
10. Aspirar la solución DAPI luego lavar 3 veces con 3 ml de PBS durante 5 minutos cada uno. Las células pueden ahora ser visualizadas con un microscopio de fluorescencia.

Representative Results

Identificación de la región de interés de la que para cosechar las células madre neurales es el primer paso crítico y definirá la cantidad de tiempo que tarda en llegar una placa confluente de células. Por ejemplo, la SVZ es una zona neurogénica clásico y por lo tanto tiene una mayor proporción relativa de células madre neurales. Sin embargo, la técnica presentada aquí se puede utilizar con otras regiones no reconoce a menudo como teniendo un potencial neurogénica robusto durante la edad adulta. A los fines de este protocolo, se utilizó la comisura anterior (parte anterior). Mientras que algunas de las células y los residuos se instalará en placas, el medio permanecerá normalmente turbia como consecuencia de la cantidad de material celular que está presente siguiente trituración. El primer cambio de medio a las 24 horas eliminará la mayor parte de esto. Como visualizado por microscopía de luz, habrá parece haber una gran cantidad de material celular restante, junto con los vasos sanguíneos, incluso después de que el primer cambio de medio. En el transcurso delos próximos días, las colonias de una población de células proliferantes distinta se harán visibles bajo el microscopio (Figura 2A). Estas son las células madre neurales que han sido seleccionados para el crecimiento mediante el uso de medio N2 que contenía bFGF, Ang2, Dll4, y el inhibidor de JAK. Además, una población de células fusiformes-como más alargado también puede estar presente (Figuras 2B y   C). Estas no son las células madre neurales (glía radial probablemente basada en la morfología y tinción), que finalmente serán alcanzados por la población de células madre neuronales en proliferación más rápida. En el transcurso de una semana a 14 días, las células llegarán a ser más densa hasta que alcanzan la confluencia (Figura 2D). Estos cultivos se tiñen positivo para un número de marcadores de células madre, incluyendo nestina, Hes3, y Sox2. (Figuras 2E-H), proporcionando así la confianza de que las poblaciones de células que han sido seleccionadas y expandidas son de hecho las células madre neurales.La confirmación adicional proviene de la capacidad de FGF retirada del medio, permitiendo que las células se diferencien por 10 días para generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Figura 2I).

Figura 1: Aislamiento de secciones de cerebro de rata para las células madre neurales adultas cosecha. A) de cerebro de rata adulta después de lavar con PBS. B) del cerebro de la rata se coloca en un acero inoxidable refrigerados seccionar bloque. C) posicionamiento aproximado de las hojas de afeitar iniciales dentro del bloque para producir secciones coronales del cerebro. D) Colocación de 2 hojas de afeitar adicionales en el bloque de seccionamiento. Tenga en cuenta, se utilizaron hojas delgadas de doble filo para los propósitos de demostración para permitir una mejor visualización de los sexiones en el bloque. E) Coronal secciones del cerebro que contienen áreas para ser cosechado. F) Diagrama esquemático de los atlas del cerebro Paxinos destacando la zona subventricular como región neurogénica clásico, y la comisura anterior de la que se recogieron las células para este protocolo. G) imágenes secuenciales del proceso de disociación de tejidos utilizando una punta de pipeta de 1 ml unido a una micropipeta P1000. Haz click aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2: las células madre neurales adultas en vitro. A) el cultivo de células madre neurales adultas después de una semana. B) Ejemplos de unas más amplias células de morfología husillo (red flechas) ocasionalmente presentes en los cultivos que no son células madre neurales. C, D) en las condiciones de cultivo empleadas en este protocolo, las células madre neurales preferentemente expanden. EH) La expresión de marcadores de células madre neurales tras 14 días in vitro, Sox2 (verde) (E), Hes 3 (rojo) (F), y nestina (violeta) (G). I) Diferenciación de las células madre neurales en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Tras la retirada por mitógenos, las células se les permitió diferenciar por 10 días, luego immunostained para GFAP (verde), TuJ1 (rojo), y CNPase (azul). J) Hes3 inmunotinción en cerebro de rata adulta. Haz click aquí para ver la imagen más grande .

Discussion

Muchos de los pasos críticos de éxito en el aislamiento, expansión y diferenciación de las células madre neurales del cerebro adulto se comparten en común con las técnicas de cultivo de tejidos. El objetivo a tener en cuenta es que los comités directivos nacionales aisladas del cerebro adulto deben mantener la mayor cantidad de sus características in vivo como sea posible (Figura 2J). A menudo, un equilibrio entre la necesaria cautela y velocidad adecuada necesita ser golpeado. Cuidado con el aislamiento del cerebro del cráneo hará que la identificación de la región de interés significativamente más fácil. Extracción del tejido tan pronto como sea posible después de la eutanasia de los animales, y manteniendo el frío cerebro durante la recolección y el lavado mantiene más rígida y en gran medida ayuda en la manipulación del tejido cuando se coloca en el molde de acero inoxidable de seccionamiento. Esto también minimiza el potencial para la extracción del tejido durante el proceso de corte. El protocolo también se beneficia de ser able para obtener las células hasta el punto de chapado de forma rápida, ya que esto aumenta la viabilidad celular una vez que se colocan in vitro. Lavado de tejido correcta antes de seccionar también ayuda a reducir el potencial de contaminación de los cultivos. Durante el proceso de disociación, la trituración con una punta de pipeta de 1 ml debe ser vigorosa, pero hecho de una manera que no se genere exceso de burbujas o formación de espuma de la suspensión de células que repercute negativamente en la supervivencia celular. El primer cambio de medio también es crucial, ya que elimina la mayoría de las células no adjunta y un desecho celular que resulta del proceso de disociación del tejido que contiene factores que son perjudiciales para la supervivencia inicial de la población de células madre. Para una mejor visualización siguiente inmunotinción, las células recién aisladas se pueden sembraron en cubreobjetos de 25 mm de vidrio colocado en la parte inferior de las placas de 6 pocillos. Las concentraciones de poli-L-ornitina y fibronectina utilizado en el recubrimiento se debe aumentar a 500 mg / ml y 20 μg / ml, respectivamente. Como alternativa, múltiples cubreobjetos más pequeños (es decir, 12 mm) se pueden colocar en cada pocillo. Estos pueden ser procesadas para inmunoticción independientemente en pocillos separados de una placa de 24 pocillos, la disminución paulatina de las cantidades de reactivos de tinción utilizados para tener en cuenta los volúmenes más pequeños. Los cubreobjetos se montan en portaobjetos utilizando un medio de montaje acuoso estándar.

Definición de la presencia de los comités directivos nacionales en el cerebro adulto es de gran interés en el campo de la neurobiología. Hay dos enfoques generales para identificar una célula madre. En uno, un conjunto de biomarcadores en base a un perfil de expresión de genes de la población de células madre en cuestión se puede utilizar para ellos la imagen por inmunohistoquímica. Aunque experimentalmente simple, se da ningún dato funcionales, ni define si las células tienen las propiedades fundamentales de las células madre, la capacidad de auto renovación o diferenciarse en múltiples tipos de células diferentes. En el otro enfoque, las células se aíslan en either una población pura o heterogénea, situada en la cultura, y no de auto renovación y propiedades multipotenciales se evaluó a través de la población de células que viven. Este enfoque da datos funcionales, y se puede utilizar para demostrar de forma inequívoca "stemness" en estas condiciones particulares in vitro experimentales. Sin embargo, la dificultad con el mantenimiento de estas células en cultivo ha obstaculizado este segundo enfoque funcional. De hecho, la incapacidad de crecer NSCs de otras áreas del cerebro ha dejado la impresión de que sólo hay unos pocos nichos especializados donde residen.

El método que aquí se presenta permite el cultivo de NSCs de muchas áreas diferentes del sistema nervioso central. Esta técnica se basa en nuestro trabajo que elucidado una vía de transducción de señal de gran importancia para controlar el número de NSC tanto in vitro como in vivo. Los factores incluidos en este protocolo fueron seleccionados sobre la base de amplios estudios de transducción de señales, Lo que demuestra que promueven el crecimiento de NSC a través de un factor de transcripción común Hes3. Nuestros estudios previos muestran que esta combinación particular produjo un aumento aún mayor en los números de NSC, en comparación con el uso de ellos individualmente. La elección de la que se añade apoyo farmacológico a la cultura debe ser considerada en el contexto de la biología en estudio. Por ejemplo, mientras tanto Ang2 y Dll4 tienen un impacto positivo en el crecimiento NSC, tienen efectos opuestos sobre la formación de la vasculatura ^22,23. A través de más de optimización de las condiciones de cultivo, nuevos biomarcadores adicionales más allá Hes3 probablemente serán identificados y ampliar aún más el número reconocido de NSCs en el cerebro adulto. Esto se ejemplifica con nuestras observaciones de que las distinciones entre la población de células Hes3 + desde diferentes áreas del cerebro se pueden hacer. Por ejemplo Hes3 + células de la médula espinal, como los de la SVZ y ACA, muestran un aumento veces varios en su número cuando se cultivan con estosfactores. Además, Hes3 + células de todas estas regiones pueden generar de manera eficiente las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Sin embargo, la morfología y la expresión génica de los tipos de células diferenciadas no es idéntica. Biomarcadores adicionales que distinguen entre los distintos tipos de células Hes3 + será una adición bienvenida al campo. El método que aquí se presenta permite la generación eficiente de las culturas NSC se puede utilizar como una herramienta para alcanzar este objetivo.

Al igual que el marcadores nestina NSC y Sox2, el factor de transcripción Hes3 identifica una población de células que tras el aislamiento se puede propagar in vitro, así como diferenciarse en los tipos de células principales que constituyen el sistema nervioso, neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos ^11. Sin embargo, a diferencia de estos marcadores de uso más común, Hes3 también identifica NSCs reposo y, como consecuencia, muchas células Hes3 + no incorporan indicadores de la mitosis ⁽³ H-timidina o BrdU) en c homeostáticoondiciones (y así han evitado las técnicas de detección clásicos). Aplicación del protocolo descrito aquí fue fundamental en el descubrimiento de esta población NSC. El número de estas células aumenta en cultivo cuando son tratados con factores producidos a partir de el endotelio vascular, incluyendo la Delta4 Notch ligando, y Angiopoetin2, coherente con su localización perivascular in vivo ^24.

Tener acceso a estas células aisladas del cerebro adulto permite la experimentación para examinar cómo las células responden a nivel de la transducción de señales a diversos factores, y proporciona algunas indicaciones de predicción de cómo las células responden in vivo. Mirando más allá de la medicina regenerativa, hemos demostrado que las condiciones de cultivo descritas aquí tienen relevancia para la investigación del cáncer también. Ellos representan mejor el medio ambiente que las células madre de cáncer aislados de Glioblastoma Multiforme experiencia, mientras que en el paciente, lo que permite el estudio Of vías de señalización que se pueden manipular para oponerse a su ³⁰ crecimiento. La amplia aplicación de esta técnica podría tener importantes implicaciones para varios aspectos de la investigación y la medicina.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit