Summary
תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.
Abstract
מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי מערכת עצבים מרכזית התחדשות (CNS) וtumorigenesis כרוך אוכלוסיות של תאי גזע (SCS) תושב בתוך המוח הבוגר. עם זאת, מנגנוני תאים בדרך כלל שקטים אלה מעסיקים על מנת להבטיח תפקוד תקין של רשתות עצביות, כמו גם את תפקידם בהחלמה מפציעה וההפחתה של תהליכי ניוון עצבי הם הבינו מעט. תאים אלה מתגוררים באזורים המכונים "נישות" המספקות סביבה תומכת מעורבת אותות ויסות משני כלי הדם ומערכת חיסונית. הבידוד, התחזוקה, והבידול של SCS במערכת העצבים המרכזית בתנאי תרבות מוגדרים שלא לכלול גורמים לא ידועים, הופכים אותם נגיש לטיפול באמצעים תרופתיים או גנטיים, ובכך לספק תובנות על התנהגות in vivo שלהם. כאן אנו מציעים מידע מפורט על השיטות להפקת תרבויות של SCS מערכת העצבים המרכזית מאזורים שונים של המוח המבוגר וגישות להערכת דפוטנציאל ifferentiation לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes במבחנה. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תאים הומוגנית כתרבות monolayer שיכול להיות דמיינו ללמוד SCs פרט וצאצאיהם. יתר על כן, ניתן להחיל אותו על פני מערכות מודל של בעלי החיים שונות ודגימות קליניות, שהשתמש בעבר כדי לחזות את תגובות משובי במערכת העצבים למבוגרים הפגועה.
Introduction
הדוגמה המרכזית לנוירוביולוגיה, שנקבעה על ידי התצפיות הבסיסיות של cytoarchitecture המוח שנעשה על ידי רמון קחל י 'לפני למעלה ממאה שנים, קבעה כי נוירוגנזה הייתה סבירה לאחר גיל ההתבגרות בהתחשב במורכבות של הרשתות עצביות שנמצאו במערכת העצבים המרכזית 1. למרות עבודתו של אלטמן ב1960s, ומאוחר יותר קפלן, הוכחת כי 3 H-תימידין אפשר היה לציין בתאים בוגרים מצביעים על כך שלמעשה היו נוירונים שנוצרו באזורים שונים של המוח הבוגר, הדוגמה המשיכה להחזיק 2, 3. ראיות המשיכו לעלות עם המחקר של Nottebohm המתאר את השינויים העונתיים במספר הנוירונים במוח של ציפור השיר נוכחי 4. זה לא היה עד 1999, כאשר גולד ואח' עבודה. פורסם על הדור של נוירונים בהיפוקמפוס העליות עם הביצועים של משימות למידה אסוציאטיביות בחולדה, כמו גם התצפיות של הפגנות Kornack וRakicטינג המשיך נוירוגנזה במקוק המבוגר שהקונספט של מוח פחות נוקשה, פלסטיק יותר, הוכר 5, 6.
החיפוש אחר המקור הסלולרי לדה נובו הנוירונים שנוצרו אלה להוביל לגילוי של אוכלוסייה נפרדת של תאי גזע (SCS) שמתגוררות באזורים במוח המכונה נישות 7. אזור subventricular והאזור גרעיני תת של ההיפוקמפוס נחשבים לשני האזורים העיקריים נוירוגנית 8,9. תאים מבודדים ממקומות אלה להציג את המאפיין הקלאסי של SCS נגזר עוברי או עוברי, התחדשות עצמית ואת פוטנציאל התמיינות. במקרה של תאי גזע עצביים (NSCs), הם יכולים להיות מובחנים לנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. בנוסף, SCS אלה להכתים חיוביים לסמני NSC עובריים כגון nestin חלבון נימה ביניים 10. עבודה מאוחרת יותר מדגישה כי SCs לא יכול להיות מוגבלת לאלה לאוו האזורים, והם למעשה מקומיים בכל רחבי המוח כאוכלוסייה במידה רבה שקטה של תאים בחוזקה הקשורים לכלי הדם 11.
התצפיות שSCs מגויסים בתגובה לפציעה מציעה את האפשרות של להיות מסוגלים לנצל את התאים האלה למטרות משובי כדי לסייע בהחלמה מההפרעה ושבץ 12, 13 ניווניות. זה לא בניגוד לתפקיד שתאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק בריפוי של רקמות חיבור, אשר נמצא כתאי perivascular שיש לו את הפוטנציאל להפוך לosteoblasts, כונדרוציטים, ותאי שומן 14. עם זאת, לא יכול להיות שנקטפו NSCs באותו אופן כמו MSCs ממח עצם על ידי שאיפה שגרתית וטכניקות צנטריפוגה שיפוע צפיפות ומנוצל לאחר מכן בטיפולים בתאים מבוססים עצמיים. כתוצאה מכך, מקורות אחרים של תאים, כגון השימוש בNSCs העוברי או מבשרים עצביים הנגזר מEMBתאי גזע ryonic נחקרו בהרחבה במחלות בעלי חיים ומודלי פציעה בדרגות שונות של הצלחה 15 של. טכנולוגיות תא גזע pluripotent מושרה ניצול מקורות תא סומטי להציע עוד שדרת פוטנציאל לייצור טיפולים מבוססי תאים שימושיים טיפולית למגוון רחב של יישומים, להתגבר על הזמינות המוגבלת ודאגות אתיות בנוגע לשימוש בתאים עובריים וברקמות עובריות 16. עם זאת, תרגום קליני של ממצאים אלה הוכיח להיות משימה קשה, כפי שמודגם במאבקים של טיפול במצבים נוירולוגיים שונים עם טיפול מבוסס-SC גישות 17,18, כמו גם במסלול מפותל לאישור רגולטורים. כגישה חלופית, הקדמה של טיפולים תרופתיים ספציפיים יכולה לווסת את מספרי המל"ל ולהקל על התאוששות במודלים של המחלה ושבץ 19 פרקינסון. לא משנה מה האסטרטגיה יכולה להיות, הבנה כיצד לתפעל ביעילות את התאים האלהדורש מערכת נגישה במבחנה.
תרבויות של NSCs יכולות להתבצע גם כתרבויות כוללת, הידוע גם neurospheres, או כmonolayer 8,20. שני הטכניקות היו בשימוש נרחב, המאפשרות את הקמתה של תנאים מוגדרים תרבות, כלומר שימוש בעוריות Growth Factor (EGF) או בסיסי פיברובלסטים Growth Factor (bFGF) כמקור mitogen, המספקים להרחבה של מבשרי multipotent. בעוד תרבויות neurosphere עשויות להיות מתאימות יותר ללימוד יכולת התפשטות משובט של סוג תא מבודד, המערכת הוכח לייצר אוכלוסייה מעורבת של תאים במהלך התרחבות 21. בנוסף, המבנה הסגור של neurospheres עושה מניפולציה תרופתית של התאים לא מעשית, ואת הפרשנות של ההשפעה עשויים להיות גורמים אלה יכול להיות מבולבל בשל microenvironment הוקם בתוך neurosphere עצמו. תרבויות חד שכבתי, לעומת זאת, יכולות להיותמועסק במסכי תפוקה גבוהה של ספריות מולקולה קטנות, המספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את מנגנוני העברת אותות המווסתים את הגדילה והתמיינות SC ופותח את ההזדמנות לגלות תרכובות רומן שמתמקדים אוכלוסיית תא זה.
כתוצאה מכך, את היכולת ליצור reproducibly תרבויות של NSCs המבוגר מאזורים השונים של עניין במוח יכולה לשמש במגוון רחב של יישומי מחקר, החל ממחקרים התפתחותיים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) לחקר גישות רפואת רגנרטיבית רומן . הפרוטוקול המובא כאן ממחיש כיצד לנתח ולהעריך את פוטנציאל ההתמיינות של SCS CNS מבודד מהמוח המכרסם המבוגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
העבודה שומרת על מגילת Helsinski והצהרת בעלי החיים ארוו. בעלי חיים המשמשים לאיסוף רקמות וכל השיטות הרלוונטיות היו במעקב על פי ההנחיות של מתקן בעלי החיים באוניברסיטת דרזדן. בעלי חיים טופלו ושוכנו על פי ההנחיות פדרלי הגרמנית לשימוש וטיפול בבעלי חיים במעבדה, והמחקר אושר על ידי דרזדן Landesdirektion. נא להתייעץ עם המדיניות של המוסד שלך וטרינרים (IACUC או לוח אחר) אודות המתודולוגיה המתת חסד מתאימה.
ניתן למצוא מניות ספציפיות וריכוזים של חומרים כימיים עבודה בלוחות מגיב מלווים בפרוטוקול זה.
1. הכנת צלחת תרבות
- מנות מעילים עם נפח מספיק של 75 מיקרוגרם / מיליליטר פולי-L-ornithine (כלומר 2 / טוב מיליליטר של צלחת 6 היטב) לילה בחממת תרבות תא 2 ימים לפני המועד המתוכנן לנתיחה.
- הסר את לשטוף הסופי, ולאחר מכן להוסיף פיברונקטין (בדילול 1:250, 4 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לצלחת ומניח את הכלים באינקובטור במשך לילה.
- לשאוב פיברונקטין ביום לנתיחה ולשטוף את הכלים 2X עם PBS. החזר את הצלחות עדיין מכילות PBS הסופי לשטוף לחממה עד הרקמה ניתק מוכנה לculturing. באותו זמן, להסיר את PBS לפני ציפוי הרקמה.
- צלחות חנות מצופות פולי-L-ornithinein החממה לתקופה של עד 3 שבועות. צלחות מצופים פיברונקטין יכולות להיות מאוחסנות במשך שבוע עד 1. ציפוי פיברונקטין יכול להיעשות קטן כמו 2 שעות אם דחוף. פיברונקטין הוא רגיש denaturation; לא להתסיס את הפתרון, או שמנות להתייבש.
2. נתיחה / ציפוי
- פרוטוקול זה חל על השימוש של 3 חולדות מבוגרים (3-6 חודשים של גיל).
- צ'ילl מוח חתך בלוק על קרח לפני והרדמת חסד החולדה.
- הנח צינור פלקון 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של מדיום N2 עם bFGF הוסיף על קרח.
- להרדים את החולדות על פי מדיניות וטרינרי המוסד שלך.
- הסר את המוח מהגולגולת על ידי ביצוע חתך את קו האמצע של הראש. שימוש במלקחיים כדי לקלף את העצם ומאפשר למוח להיות מופק בזהירות.
- מניחים את המוח לתוך צלחת פטרי המכילה 10 סנטימטר קר כקרח PBS. זו תסיר את כל שיער ודם שיורית. (איור 1 א)
- מניחים את המוח לבלוק חתך הצונן. (איור 1)
- הכנס סכין גילוח הנקי חדש אחד לבלוק כמו בתמונה באיור 1 ג.
- הכנס הזנב מ"מ שני גילוח נקי להב 3 לראשון כפי שמודגם באיור 1D.
- רם בזהירות את הלהבים מהבלוק, לוקח איתם את החלק של ריבית.
- תהלוכה שניותtion את הלהב על ידי טבילתו בPBS. (איור 1E)
- רקמת קציר מהאזור של עניין (בדוגמא זו השתמשנו בהשליך קדמי, (ACA הקדמי), איור 1F) באמצעות # 5 מלקחיים ולאסוף לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל בינוני N2 1 מיליליטר המכיל bFGF.
- העבר את הצינור לתוך מכסה המנוע הזרימה למינרית תרבות תא, בהמשך לשאר הפרוטוקול בתנאים סטריליים.
- מכאני לנתק את הרקמות באמצעות פיפטה קצה מיליליטר 1 המצורף לpipettor P1000. כמה פעמים פיפטה מעלה ומטה (כ 20x בשיעור של מחזור pipetting 1 לשנייה) תוך כדי לחיצה על הפתיחה של קצה פיפטה נגד החלק התחתון של צינור חרוטי (איורים 1G 1-3). תפסיק טחינה דקה כאשר הפתרון הופך להיות הומוגנית.
- אפשר הפתרון לשבת במשך 2 דקות, כדי לאפשר את כל רקמת nondissociated גדולה יותר כדי ליישב לתחתית. (איור 1G 4)
- לאסוף homogensupernatant eous ומקום לתוך צינור חרוטי המכיל 8.5 מיליליטר של תקשורת N2 תוספת 20 bFGF ng / ml, 500 Dll4 מיליליטר / ng, 500 ng / ml Ang2, ו200 nMJAK מונעי.
- צלחת אותם ל 3 בארות של צלחת 6 היטב באמצעות 3 מיליליטר של תמיסה מדוללת תא / כן.
- מניחים את הצלחת לתוך תא חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 5% O 2.
3. טיפול יומי
- החלף את המדיום על מנות התרבות עם N2 בינוני מכילות bFGF, Ang2, Dll4, וJAK מעכב 24 שעות לאחר ציפוי.
- להוסיף בולוס של bFGF, Dll4, Ang2, ומעכב JAK ביום שלמחרת.
- המשך בתהליך מתחלף זה של שינויים בתקשורת ותוספות גורם עבור סכום כולל של 10-14 ימים.
4. אינדוקציה של בידול
- לסגת bFGF, Dll4, Ang2, ומעכב JAK מכיל בינוני ולהחליף אותו עם מדיום N2 שאינו מכיל גורמים נוספים בכל.
- לשנות את המדיום כל יום שני.
- תקן את התאים לאחר 10 ימים ולבצע immunocytochemistry.
5. איתור Immunocytochemical
- לשאוב את המדיום ולתקן צלחות תרבית תאים עם 2 מיליליטר של paraformaldehyde 4% עבור 20 דקות.
- לשטוף 2x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- לשאוב PBS, אז permeabilize ולחסום את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS המכיל 5% בסרום נורמלי חמור (NDS) ו0.1% טריטון X-100 עבור 20 דקות.
- מכין את תערובת הנוגדן העיקרית PBS המכילה 5% של NDS. נוגדן אנטי nestin יכול לשמש לזיהוי SCS, תוך Tuj1 (כיתה השלישית β-טובולין), ניתן להשתמש בם נוגדני GFAP, וCNPase יחד לצביעה משולשת של סמני בידול.
- לשאוב את פתרון החסימה ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תערובת הנוגדן הראשונית היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 90 דקות.
- הסר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 2x עם 3 מיליליטר של PBS, ו1X עם 3 מיליליטר של PBS המכיל 5% NDS במשך 5 דקות כל אחד.
- Preparדואר הנוגדנים משני בPBS המכילים 5% של NDS.
- לשאוב את לשטוף הסופי ולהוסיף 1.5 מיליליטר של פתרון נוגדנים משני היטב כל אחד. דגירה בחושך במשך 40 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר את פתרון נוגדנים משני ולהוסיף 2 מיליליטר של כתם DAPI מוכן טרי (500 / מיליליטר ng PBS). דגירה במשך 3 דקות.
- לשאוב את פתרון DAPI לאחר מכן לשטוף 3x עם 3 מיליליטר של PBS במשך 5 דקות כל אחד. כעת ניתן דמיינו התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי האזור של עניין שממנו לקצור תאי גזע עצביים הוא הצעד הראשון הקריטי ויגדיר את משך זמן שנדרש כדי לקבל צלחת ומחוברות של תאים. לדוגמא, SVZ הוא אזור נוירוגנית קלאסי ולכן יש חלקם יחסי גבוה יותר של תאי גזע עצביים. עם זאת, הטכניקה שהוצגה כאן ניתן להשתמש באזורים אחרים לא לעתים קרובות מוכרים כבעל פוטנציאל עצבי חזק במהלך הבגרות. למטרות פרוטוקול זה, אנו משמשים השלכנו הקדמי (חלק קדמי). בעוד שחלק מהתאים והפסולת יישבו על ציפוי, הבינוני יהיה בדרך כלל להישאר עכור כתוצאה מכמות החומר תאי שהיא טחינה דקה הבאה הווה. השינוי הבינוני הראשון ב24 שעות יסיר את רוב זה. כמו דמיינו ידי מיקרוסקופ אור, שם יופיע להיות כמות גדולה של חומר תאי שנותר, יחד עם כלי דם, גם לאחר השינוי הבינוני הראשון. במהלךבימים הקרובים, מושבות של אוכלוסיית תאים מתרבים שונה יהיו גלויות מתחת למיקרוסקופ (איור 2 א). אלה הם תאי הגזע העצביים שנבחרו לצמיחה על ידי השימוש במדיום N2 המכיל bFGF, Ang2, Dll4, ומעכב JAK. בנוסף, אוכלוסיית תאים דמוית כישור מוארך יותר עשויה גם להיות נוכחת (2B ומספרים ג). אלה לא תאי גזע עצביים (גליה סבירה רדיאליים המבוססת על מורפולוגיה וצביעה), הם סופו של דבר השתלטו על ידי אוכלוסיית תאי גזע העצבית מתרבות מהירה יותר. במהלך שבוע 14 ימים, התאים יהפכו לצפופים יותר, עד שהם מגיעים למפגש (איור 2 ד). תרבויות אלה להכתים חיוביות עבור מספר הסמנים בתאי גזע, כולל Nestin, Hes3, וSox2. (איורים 2E-H), ובכך לספק ביטחון כי אוכלוסיות התאים שנבחרו והרחיבו הן אכן עצבי תאי גזע.אישור נוסף מגיע מיכולת FGF נסיגה מהבינונית, מאפשר לתאים להתמיין ל10 ימים כדי לייצר נוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes (איור 2 ט).
איור 1: בידוד של חלקים במוח חולדה לתאי גזע עצביים למבוגרים קציר. מוח חולדה) במוח חולדה למבוגרים בלבד לאחר שטיפה עם PBS. B) ממוקם לתוך נירוסטה מקוררת חתך בלוק. C) מיקום משוער של סכיני גילוח הראשוניים בתוך הבלוק כדי לייצר סעיפי העטרה המוח. D) מיקום 2 סכיני גילוח נוספים לבלוק חתך. שים לב, להבי פיפיות רזים שימשו למטרות הפגנה, כדי לאפשר להדמיה קלה יותר של יםחלקים במוח עטרה ections בבלוק. E) המכילים אזורים להיות שנקטפו. F) תרשים סכמטי מאטלס מוח Paxinos המדגיש את אזור subventricular כאזור נוירוגנית קלאסי, והשליך הקדמי שממנו התאים נקצרו לפרוטוקול זה. G) תמונות רציפים של תהליך ניתוק הרקמות באמצעות פיפטה קצה מיליליטר 1 המצורף לmicropipettor P1000. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2: תאי גזע עצביים למבוגרים במבחנה. א) תרבית תאי גזע עצבי למבוגרים אחרי שבוע אחד. ב ') דוגמאות לתאי מורפולוגיה ציר רחבים יותר (מחדשחיצי ד) לעתים קיימים בתרבויות שאינן תאי גזע עצביים. C, D) תחת תנאי התרבות הוגדרו בפרוטוקול זה, תאי הגזע העצביים להרחיב את מעדיפים. EH) ביטוי של סמנים בתאי גזע עצביים הבאים 14 ימים במבחנה, Sox2 בידול (ירוק) (E), הס 3 (אדום) (F), וNestin (סגול) (G). אני) של תאי גזע עצביים לתוך הנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. בעקבות נסיגת mitogen, תאים הורשו להבדיל 10 ימים, ולאחר מכן immunostained לGFAP (ירוק), Tuj1 (אדום), וCNPase. Immunostaining J) Hes3 במוח חולדה הבוגר (כחול). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רבים מהשלבים קריטיים לבידוד מוצלח, הרחבה, והתמיינות של תאי גזע עצביים מהמוח הבוגר משותפים במשותף עם טכניקות תרבות תקן רקמות. המטרה לזכור היא שNSCs מבודד מהמוח המבוגר צריך לשמור על כמה שיותר מin vivo המאפיינים שלהם ככל האפשר (איור 2J). לעתים קרובות איזון בין זהירות ראויה ומהירות מתאימה צריך להיות פגע. אכפת לי עם הבידוד של המוח מהגולגולת יעשה זיהוי של האזור של עניין קל יותר באופן משמעותי. הסרת הרקמה במהירות אפשרית הבאים euthanization בעלי החיים, ושמירה על קור המוח במהלך קצירה ושטיפה שומרת אותו יותר נוקשה ומאוד מסייע בטיפול ברקמות כאשר הוא ממוקם לתוך הנירוסטה חתך עובש. זה גם מקטין את הפוטנציאל לקריעה של הרקמה במהלך תהליך חתך. הפרוטוקול גם יתרונות מלהיות ABLדואר כדי לקבל את התאים עד לנקודה של ציפוי במהירות, שכן הדבר מגדיל את כדאיות תא ברגע שהם הניחו במבחנה. שטיפת רקמה תקינה לפני חתך גם עוזרת להפחית את הפוטנציאל לזיהום בתרבויות. במהלך תהליך הניתוק, טחינה דקה עם קצה פיפטה מיליליטר 1 צריכה להיות נמרצת, אך לעשות זאת באופן שלא ליצור בועות או קוצף עודפות של ההשעיה התא שבו באופן שלילי על הישרדות תא משפיע. השינוי הבינוני הראשון הוא קריטי גם כפי שהוא מסיר את רוב תאי nonattached ופסולת תאית, הנובעת מתהליך ניתוק הרקמות המכיל גורמים המשפיעים לרעה על ההישרדות הראשונית של אוכלוסיית תאי גזע. להדמיה משופרת הבא immunostaining, יכולים להיות מצופים בתאים מבודדים הטרי ביום 25 בcoverslips זכוכית מ"מ ממוקם בחלק התחתון של 6 צלחות היטב. הריכוזים של פולי-L-ornithine ופיברונקטין המשמש לציפוי צריכים להיות מוגברים לμ 500 מיקרוגרם / מיליליטר ו20גר '/ מיליליטר, בהתאמה. כחלופה, coverslips הקטן מרובה (כלומר 12 מ"מ) יכול להיות ממוקם היטב לתוך כל אחד. אלה אז יכולים להיות מעובד לimmunostaining באופן עצמאי בבארות נפרדות מצלחת 24 גם, קנה מידה במורד הכמויות של חומרים כימיים המשמשות לצביעה לקחת בחשבון את הכמויות הקטנות יותר. אז coverslips הם רכובים על שקופיות באמצעות מדיום מימיים סטנדרטי גובר.
הגדרת נוכחותו של NSCs במוח הבוגר היא עניין מרכזי בתחום של נוירוביולוגיה. ישנן שתי גישות כלליות לזיהוי תאי גזע. באחד, קבוצה של סמנים ביולוגיים המבוססים על פרופיל ביטוי גנים של אוכלוסיית תאי גזע בשאלה יכולה לשמש להם תמונה על ידי אימונוהיסטוכימיה. אמנם בניסוי פשוט, זה נותן לי אין נתונים פונקציונליים, ולא מגדיר אם יש תאי תכונות הבסיסיות של תאי גזע, את היכולת עצמית לחדש או להתמיין לסוגי תאים שונים מרובים. בגישה אחרת, תאים מבודדים בדוארither אוכלוסייה טהורה או הטרוגנית, הניחה בתרבות, ויש התחדשות עצמית ומאפייני multipotential נבחנים באמצעות אוכלוסיית התא החי. גישה זו נותנת נתונים תפקודיים, והוא יכול לשמש כדי להוכיח "stemness" במבחנת תנאי ניסוי המסוים הללו באופן חד משמעי. עם זאת, הקושי בשמירה על התאים אלה בתרבות הפריע גישה פונקציונלית שנייה. למעשה, חוסר היכולת לגדול NSCs מאזורים אחרים של המוח הותירה את הרושם שיש רק כמה נישות מיוחדות שבו הם מתגוררים.
השיטה שהוצגה כאן מאפשרת לתרבית של NSCs מתחומים רבים ושונים של מערכת העצבים המרכזית. טכניקה זו מבוססת על העבודה שלנו, כי הובהרה מסלול העברת אותות של חשיבות רבה לשליטה על מספר NSCs הן במבחנה in vivo. הגורמים הנכללים בפרוטוקול זה נבחרו מבוסס על מחקרים הולכים אותות נרחבים, הוכחת כי הם מקדמים צמיחת המל"ל באמצעות גורם שעתוק נפוץ Hes3. המחקרים הקודמים שלנו מראים כי שילוב מסוים זה הניב עלייה גדולה עוד יותר במספרי המל"ל בהשוואה לשימוש בהם בנפרד. הבחירה בתמיכה תרופתית נוספת לתרבות יש לשקול בהקשר של הנלמד הביולוגיה. לדוגמא, בזמן ששניהם Ang2 וDll4 יש לו השפעה חיובית על צמיחת המל"ל, יש להם השפעות מנוגדות על היווצרות כלי דם 22,23. באמצעות אופטימיזציה נוספת של תנאי התרבות, סמנים ביולוגיים חדשניים נוספים מעבר Hes3 צפוי להיות מזוהים ולהרחיב את המספר המוכר של NSCs במוח הבוגר עוד יותר. זה בא לידי ביטוי על ידי התצפיות שלנו, כי הבדלים בין אוכלוסיית תאי Hes3 + מאזורים שונים במוח יכולים להתבצע. לדוגמא Hes3 + תאים מחוט השדרה, כמו אלה מSVZ וACA, מצביעים על עלייה של פי כמה במספרם כאשר בתרבית עם אלהגורמים. בנוסף, Hes3 + תאים מכל האזורים האלה יכולים ביעילות לייצר נוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. עם זאת, ביטוי המורפולוגיה והגן של הסוגים המובחנים התא אינו זהה. סמנים ביולוגיים נוספים המבדילים בין סוגי תאי Hes3 + שונים יהיו תוספת מבורכת לשדה. השיטה שהוצגה כאן מאפשר לדור יעיל של תרבויות המל"ל יכולה לשמש ככלי להשגת מטרה זו.
כמו nestin וSox2 סמני המל"ל, גורם שעתוק Hes3 מזהה אוכלוסיית תא שעל בידוד יכול להיות מופצות במבחנה, כמו גם מובחנת לסוגי התאים העיקריים המרכיבים את מערכת העצבים, תאי עצב, האסטרוציטים, וoligodendrocytes 11. עם זאת, בניגוד לסמנים יותר נפוצים אלה, Hes3 גם מזהה NSCs שקט; כתוצאה מכך, רבים + תאי Hes3 לא לשלב אינדיקטורים של מיטוזה (3 H-תימידין או BrdU) תחת ג homeostaticonditions (ובכך נמנע זיהוי טכניקות קלאסיות). היישום של הפרוטוקול המתואר כאן היה יסוד בגילוי של אוכלוסיית המועצה לביטחון לאומי הזה. מספר התאים אלה מגדיל בתרבות כאשר מטופלים עם גורמים המופקים מהאנדותל של כלי הדם, כולל Delta4 Notch יגנד, וAngiopoetin2, עולה בקנה אחד עם לוקליזציה perivascular in vivo 24.
יש גישה נוחה לתאים אלה בודדו מהמוח הבוגר מאפשר לניסויים כדי לבחון כיצד התאים מגיבים ברמה הולך אותות לגורמים שונים, ומספק כמה אינדיקציות חזויה של כמה התאים יגיבו in vivo. במבט מעבר לרפואת רגנרטיבית, שהוכחנו כי יש להם את תנאי התרבות המתוארים כאן רלוונטי למחקר סרטן, כמו גם. הם טובים יותר לייצג את הסביבה כי תאי גזע סרטני שבודדו Glioblastoma multiforme ניסיון ואילו במטופל, ומאפשר לo המחקרו איתות מסלולים שניתן להשפיע להתנגד 30 הצמיחה שלהם. היישום הרחב של טכניקה זו עשויה להיות השלכות משמעותיות על היבטים רבים של מחקר ורפואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה (בחלקו) על ידי הלמהולץ ברית ICEMED - ההדמיה וריפוי מחלות מטבוליות הסביבה, באמצעות קרן היוזמה והרשת של הלמהולץ האיגוד, מענק מKroener-Fresenius הקרן אחרת, ומענק מForschungsgemeinschaft דויטשה ( SFB 655: תאים לרקמות).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 | 5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution |
| Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | |
| DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation |
| Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml |
| Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml |
| Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml |
| JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | |
| 15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | |
| Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | |||
| Immunofluorescence Reagents Table | |||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol |
| Primary Antibody Table | |||
| Nestin | Chemicon | MAB353 | Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
| Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 | Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
| CNPase | Chemicon | MAB326 | Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
| β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 | Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 | Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
| Secondary Antibody Table | |||
| Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 | Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
| Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 | Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
| Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 | Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |
References
- Cajal, R. Y. Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , Harvard University. (1899).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).
- Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197, 1092-1094 (1977).
- Nottebohm, F.
- Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G.
- Kornack, D. R., Rakic, P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Luskin, M. B. Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone. Neuron. 11, 173-189 (1993).
- Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 60, 585-595 (1990).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).
- Jin, K., et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).
- Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone. Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).
- Caplan, A. I. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. J. Pathol. 217, 318-324 (2009).
- Goldman, S. Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system. Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).
- Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications. Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, e1000029 (2009).
- Lindvall, O., Bjorklund, A.
- Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease. Mo.l Neurobiol. , (2012).
- Cattaneo, E., McKay, R. Identifying and manipulating neuronal stem cells. Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
- Duarte, A., et al. Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development. Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).
- Maisonpierre, P. C., et al. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science. 277, 55-60 (1997).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
- Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture. Neuron. 5, 297-306 (1990).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons. Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).
- Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain. J. Neuroinflammation. 6, 39 (2009).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells. PLoS One. 5, e9414 (2010).
- Park, D. M., et al. Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics. Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).
- Poser, S. W., et al. Ch. 5. Cancer Stem Cells - The Cutting. Shostak, S. , InTech. Europe, Rijeka, Croatia. 89-110 (2011).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).
