Økende nevrale stamceller fra konvensjonelle og ikke-konvensjonelle Regions of Adult Rodent Brain

Summary

Nevrale stamceller høstet fra den voksne hjernen øker benyttes i applikasjoner som spenner fra grunnleggende forskning av nervesystemet utvikling å utforske potensielle kliniske anvendelser innen regenerativ medisin. Dette gjør streng kontroll i isolasjon og dyrkningsforhold som brukes til å dyrke disse cellene kritisk å høres eksperimentelle resultater.

Abstract

Nyere arbeider viser at sentralnervesystemet (CNS) regenerering og tumorigenesis innebærer populasjoner av stamceller (SCS) bosatt i den voksne hjernen. Imidlertid er mekanismene disse normalt hvilende celler benytter for å sikre riktig funksjon av nevrale nettverk, i tillegg til sin rolle i utvinningen fra skade og reduksjon av neurodegenerative prosesser er lite forstått. Disse cellene befinner seg i regioner som refereres til som "nisjer" som gir et oppholdmiljø involverer regulerende signaler fra både vaskulære og immunsystemet. Isoleringen, vedlikehold og differensiering av CNS sentre under definerte dyrkningsbetingelser som utelukker ukjente faktorer, som gjør dem tilgjengelige for behandling av farmakologiske eller genetiske midler, og dermed gi innsikt i sin in vivo-oppførsel. Her tilbyr vi detaljert informasjon om metoder for generering av kulturer av CNS-sentre fra forskjellige regioner i den voksne hjernen og tilnærminger for å vurdere deres differentiation potensial i nevroner, astrocytter og oligodendrocytes in vitro. Denne teknikken gir en homogen cellepopulasjon som et monosjikt kultur som kan visualiseres for å studere enkelte sentre og deres avkom. Videre kan det påføres på tvers av forskjellige dyremodell-systemer og kliniske prøver, som tidligere er brukt til å forutsi regenerativ respons i den skadede person nervesystemet.

Introduction

Det sentrale dogmet om nevrobiologi, fastsatt av de grunnleggende observasjoner av hjernen cytoarchitecture laget av Ramón Y. Cajal over hundre år siden, mente at neurogenesis var usannsynlig etter ungdomstiden gitt kompleksiteten av de nevrale nettverk som finnes i CNS ^en. Til tross for arbeidet med Altman i 1960, og senere Kaplan, som viser at ^tre H-thymidin kunne finnes i modne nevroner som indikerer at faktisk nevronene ble generert på forskjellige områder av den voksne hjernen, fortsatte dogmet å holde ^{to, tre.} Bevis fortsatte å montere med Nottebohm forskning som beskriver den sesongmessige endringer i antall nerveceller til stede i songbird hjerner ^fire. Det var ikke før i 1999, da Gould et al. Publisert arbeid på generering av nerveceller i hippocampus øker med utførelsen av assosiative læringsoppgaver i rotte, samt observasjoner av Kornack og Rakic ​​demonstrasjonsTing fortsatte neurogenesis i den voksne macaque at konseptet med en mindre rigid, mer plast hjernen, ble anerkjent ^{5, 6.}

Jakten på den cellulære kilden for disse de novo generert nevroner fører til oppdagelsen av et avgrenset bestand av stamceller (SCS) som bor i områder av hjernen kalt nisjer ^7. Subventricular sone og sub granulær sone av hippocampus blir ansett for å være de to viktigste nevrogene regioner ^8,9. Celler isolert fra disse stedene viser den klassiske karakteristikk av embryonale eller foster avledet sentre, selvfornyelse og differensiering potensial. I tilfelle av nevrale stamceller (NSCs), kan de bli differensiert i neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. I tillegg er disse sentre flekke positive for føtale markører NSC slik som de mellomliggende filamentprotein nestin ^10.. Nyere arbeid streker at sentre kanskje ikke være begrenset til disse two områder, og er i virkeligheten lokalisert i hele hjernen som en stort sett stillestående populasjon av celler tett forbundet med vaskulære karet ^11..

Observasjonene som sentre blir mobilisert i respons til skade antyder muligheten av å kunne anvende disse celler for regenererende formål å hjelpe til med utvinning fra nevrodegenerativ lidelse og slag ^{12, 13..} Dette er ikke ulikt den rollen som mesenchymale stamceller (MSCS) spiller i helbredelsen av bindevev, som er funnet som perivaskulære celler som har potensial til å bli osteoblaster, chondrocytes, og adipose celler ^14. Imidlertid kan NSCs ikke bli høstet på samme måte som MSCS fra benmarg ved rutine aspirasjon og tetthetsgradient-sentrifugering teknikker og deretter benyttes i autologe celle-baserte terapier. Som en konsekvens av andre kilder til celler, for eksempel ved bruk av føtale NSCs eller neuronal forløpere avledet fra embryonic stamceller har blitt grundig undersøkt i dyresykdommer og skademodeller med varierende grad av suksess ^15. Induserte pluripotente stamceller teknologier utnytte somatiske celle kilder tilby en annen potensiell avenue for å produsere terapeutisk nyttig celle-basert terapi for et bredt spekter av applikasjoner, overvinne den begrensede tilgjengeligheten og etiske bekymringer angående bruk av embryonale celler og fostervev ^16. Imidlertid har klinisk oversettelse av disse funnene vist seg å være en vanskelig oppgave, som demonstrert i de kjemper for behandling av forskjellige neurologiske tilstander med SC-baserte terapeutiske tilnærminger ^17,18, så vel som en kroket bane til godkjennelser. Som en alternativ tilnærming, kan innføring av spesifikke farmakologiske behandlinger modulere NSC tall og lette utvinning i modeller av Parkinsons sykdom og hjerneslag ^19. Uansett strategi kan være, å forstå hvordan du effektivt manipulere disse cellenekrever en tilgjengelig in vitro-systemet.

Kulturer av NSCs kan utføres enten som de samlede kulturer, også kjent som neurospheres, eller som en monolayer ^8,20. Begge teknikker har vært mye brukt, slik at for å etablere definerte dyrkningsbetingelser, dvs. bruk av epidermal vekstfaktor (EGF) eller basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) som et mitogen kilde, som gir for utvidelse av multipotent forløpere. Mens neurosphere kulturer kan være bedre egnet for å studere evnen til klonal forplantning av en isolert celletype, har systemet blitt vist å produsere en blandet populasjon av celler under ekspansjon ^21.. I tillegg er den lukkede struktur av neurospheres gjør farmakologiske manipulering av cellene upraktisk, og tolkningen av påvirkning disse faktorene kan ha kunne vist på grunn av mikromiljøet som er etablert i neurosphere selv. Monolagskulturer, på den annen side, kan bliansatt i høy gjennomstrømning skjermer av små molekyl biblioteker, som gir et kraftig verktøy for å utforske de signaltransduksjonsbaner mekanismer som regulerer SC vekst og differensiering og åpner muligheten til å oppdage nye forbindelser som spesifikt retter denne cellen befolkningen.

Som en konsekvens, kan evnen til reproduserbart å generere kulturer av voksen NSCs fra forskjellige regioner av interesse i hjernen bli brukt i et bredt spekter av forskningsapplikasjoner, som strekker seg fra studier av sentralnervesystemet (CNS) utviklings å utforske nye regenerativ medisin tilnærminger . Protokollen presenteres her demonstrerer hvordan å dissekere og vurdere differensiering potensialet i CNS sentre isolert fra den voksne gnager hjernen.

Protocol

Arbeidet følger erklæringen Helsinski og Arvo Animal erklæringen. Dyrene ble brukt for vev innsamling og alle relevante metoder ble fulgt i henhold til instruksjonene fra dyret anlegget ved Universitetet i Dresden. Dyrene ble behandlet og plassert i henhold til de tyske føderale retningslinjer for bruk og stell av forsøksdyr, og studien ble godkjent av Landesdirektion Dresden. Vennligst ta kontakt med institusjonens veterinær politikk (IACUC eller annet bord) når det gjelder passende dødshjelp metodikk.

Spesifikk lager og arbeids konsentrasjoner av reagenser kan bli funnet i de Reagensbeholdere Tabeller som følger denne protokollen.

En. Kultur Dish Forberedelse

1. Coat retter med et tilstrekkelig volum av 75 ug / ml poly-L-ornitin (dvs. 2 ml / brønn i en 6-brønn plate) over natten i cellekulturinkubator 2 dager før den planlagte disseksjon tidspunktet.
2. Fjern den siste vask, deretter legge fibronek (fortynnet 1:250, 4 mikrogram / ml i PBS) til plate og plassere retter i inkubatoren over natten.
3. Aspirer fibronek på dagen for disseksjon og ta oppvasken 2x med PBS. Retur platene fremdeles inneholdende det endelige PBS vaskes til inkubatoren inntil dissosiert vev er klar for dyrking. På den tiden, fjerne PBS før plating vevet.
4. Oppbevar plater belagt med poly-L-ornithinein inkubatoren i opptil tre uker. Plater belagt med fibronektin kan lagres i opp til en uke. Fibronectin belegg kan gjøres i så lite som 2 timers om haster. Fibronektin er utsatt for denaturering, ikke agitere løsningen eller lar retter tørke.

2. Disseksjon / plating

1. Denne protokollen gjelder bruken av tre voksne rotter (3-6 måneder gamle).
2. Chill hjernen snittblokken på is før euthanizing rotte.
3. Plasser et 15 ml Falcon rør som inneholder 5 ml av N2 medium med tilsatt bFGF på is.
4. Avlive rottene i henhold til institusjonens veterinær politikk.
5. Fjern hjernen fra skallen ved å gjøre et snitt ned midtlinjen av hodet. Bruk pinsett til å skrelle bort benet slik at for hjernen å være nøye pakket ut.
6. Sett i hjernen i en 10 cm petriskål inneholdende iskald PBS. Dette vil fjerne alle rester av hår og blod. (Fig. 1A)
7. Sett hjernen i den kjølt seksjonering blokken. (Figur 1B)
8. Sett en ny ren barberblad inn i blokken som er avbildet i figur 1C.
9. Sett en andre ren barberblad 3 mm caudal til den første, som vist i figur 1D.
10. Løft forsiktig bladene fra blokken, og tok med seg den delen av interesse.
11. Flyte sekning av bladet ved å dyppe den i PBS. (Figur 1E)
12. Innhøsting vev fra området av interesse (i dette eksempelet brukte vi fremre commissure, (anterior) ACA, figur 1F) bruker # 5 pinsett og samle inn en 15 ml konisk rør som inneholder en ml N2 medium som inneholder bFGF.
13. Beveg røret i en laminær strømningshette cellekultur, å fortsette resten av den protokoll under sterile betingelser.
14. Mekanisk dissosiere den vev ved hjelp av en 1 ml pipette festet til en P1000 pipette. Pipette opp og ned flere ganger (ca. 20 ganger med en hastighet på 1 pipettering syklus per sekund), mens trykk ved åpningen av pipettespissen mot bunnen av det koniske røret (fig. 1G 1-3). Stopp triturering når oppløsningen blir homogen.
15. La løsningen stå i 2 min for å tillate en større nondissociated vevet fikk sette seg på bunnen. (Figur 1G 4)
16. Samle homogeneous supernatanten og plasser i en konisk rør som inneholder 8,5 ml av N2 media pluss 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2, og 200 nMJAK Inhibitor.
17. Plate dem inn i 3 brønner på en 6-brønners plate ved anvendelse av 3 ml fortynnet celleløsning / brønn.
18. Sett platen inn i en fuktet inkubator celle ved 37 ° C, 5% _CO2, 5% O _2.

Tre. Daily Care

1. Sett på medium på kultur retter med N2 Medium inneholder bFGF, Ang2, Dll4, og JAK-hemmer 24 timer etter plating.
2. Legg en bolusdose av bFGF, Dll4, Ang2, og JAK inhibitor på neste dag.
3. Fortsett denne vekslende prosessen med medie endringer og faktor tillegg for en total på 10-14 dager.

4. Induksjon av Differensiering

1. Uttak bFGF, Dll4, Ang2, og JAK hemmer holdig medium og erstatte den med N2 medium som ikke inneholder noen ekstra faktorer.
2. Endre medium annenhver dag.
3. Fikser cellene etter 10 dager og utføre immunocytochemistry.

5. Immunocytochemical Detection

1. Aspirer medium og fikse cellekultur plater med 2 ml 4% paraformaldehyde for 20 min.
2. Vask med 2 x 3 ml PBS i 5 min hver.
3. Aspirer PBS, deretter permeabilize og blokkere cellene ved tilsetning av 2 ml PBS inneholdende 5% normalt esel serum (NDS) og 0,1% Triton X-100 i 20 min.
4. Forbered den primære antistoff mix i PBS som inneholder 5% NDS. Anti-nestin antistoff kan brukes for å identifisere sentre, mens TuJ1 (klasse III β-tubulin), kan GFAP og CNPase antistoffer anvendes sammen i en trippel farging av differensieringsmarkører.
5. Aspirer blokkering løsningen og tilsett 1,5 ml av den primære antistoffblandingen i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i 90 min.
6. Fjern de primære antistoffer, og vaskes 2x med 3 ml PBS, og 1x med 3 ml PBS inneholdende 5% NDS i 5 min hver.
7. Prepare de sekundære antistoffer i PBS inneholdende 5% NDS.
8. Aspirer siste vask og tilsett 1,5 ml av sekundært antistoff-løsning til hver brønn. Inkuber i mørke i 40 min ved romtemperatur.
9. Ta ut den sekundære antistoff løsning og tilsett 2 ml av en nylaget DAPI flekken (500 ng / ml i PBS). Inkuber i 3 min.
10. Aspirer DAPI-løsning og deretter vaskes 3 ganger med 3 ml PBS i 5 min hver. Cellene kan nå bli visualisert med et fluorescens-mikroskop.

Representative Results

Identifisere regionen av interesse for å høste nevrale stamceller er den kritiske første trinnet og vil definere hvor lang tid det tar å få en konfluent plate av celler. For eksempel er SVZ en klassisk nevrogen området og derfor har en høyere relativ andel av nevrale stamceller. Imidlertid kan den teknikken som presenteres her brukes med andre regioner ikke ofte anerkjent som å ha en robust nevrogen potensial i voksen alder. Ved anvendelsen av denne protokollen, brukte vi den fremre commissure (fremre del). Mens noen av cellene og rusk vil slå seg ned på platekledning, vil det medium som normalt forblir uklar som følge av mengden av cellemateriale som er tilstede følgende triturering. Det første medium endring etter 24 timer vil fjerne mesteparten av dette. Som visualisert ved lysmikroskopi, vil det synes å være en stor mengde gjenværende cellemateriale, sammen med blodkar, selv etter at det første medium forandring. I løpet avde neste dagene, vil kolonier av en distinkt proliferating cellepopulasjon bli synlig under mikroskop (Figur 2A). Disse er de neurale stamceller som er selektert for vekst ved bruk av N2-medium innehold bFGF, Ang2, Dll4 og JAK inhibitor. I tillegg kan en mer langstrakt spindel-lignende cellepopulasjon også være til stede (figurene 2B og   C). Disse er ikke nevrale stamceller (sannsynlig radial gliaceller basert på morfologi og flekker), vil de til slutt bli overkjørt av den raskere voksende nevrale stamcelle befolkningen. I løpet av en uke til 14 døgn, vil cellene bli mer tett inntil de når løpet (figur 2D). Disse kulturene flekken positivt for en rekke av stamcellemarkører, inkludert Nestin, Hes3, og Sox2. (Tall 2E-H), og dermed gi tillit til at cellepopulasjoner som har blitt valgt og utvidet er faktisk nevrale stamceller.Ytterligere bekreftelse kommer fra muligheten til å tilbaketrekning FGF fra det medium, slik at cellene til å differensiere i 10 dager for å generere neuroner, astrocytter og oligodendrocytter (figur 2i).

Figur 1: Isolering av rotte-hjerneseksjoner for høsting voksen neurale stamceller. A) Voksen rottehjernen etter vask med PBS. B) Rat hjernen plassert i et avkjølt rustfritt stål seksjonering blokk. C) Omtrentlig plassering av de første barberblad innenfor blokken å produsere koronale deler av hjernen. D) Plassering av 2 ekstra barberblad inn i seksjonering blokken. Notat, ble tynnere dobbel edged blad brukes til demonstrasjonsformål for å tillate enklere visualisering av de sections i blokken. E) Coronal hjerne seksjoner som inneholder områder som skal høstes. F) Prinsippskisse fra Paxinos hjerneatlas utheving subventricular sonen som en klassisk nevrogen regionen, og den fremre commissure fra hvilke celler som ble høstet for denne protokollen. G) sekvensielle bilder av vev dissosiasjon prosessen ved hjelp av en 1 ml pipette tips knyttet til en P1000 mikropipette. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2: Voksen neurale stamceller in vitro. A) Voksen neurale stamcellekultur etter en uke. B) Eksempler på et mer fleksibelt spindel morfologi celler (red pilene) og til stede i kulturene som ikke er neurale stamceller. C, D) under de betingelser som er definert kultur i denne protokollen, neural stamceller fortrinnsvis ekspandere. EH) Expression of neural stamcelle markører etter 14 dager in vitro, Sox2 (grønn) (E), Hes 3 (rødt) (F), og Nestin (fiolett) (G). I) differensiering av nevrale stamceller til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Etter mitogen tilbaketrekning, ble cellene lov til å differensiere i 10 dager, deretter immunostained for GFAP (grønn), TuJ1 (rød), og CNPase (blå). J) Hes3 farging i voksen rottehjernen. Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Mange av trinnene er kritiske for vellykket isolering, ekspansjon, og differensiering av nevrale stamceller fra den voksne hjernen deles felles med standard-vevskultur-teknikker. Målet å huske på er at NSCs isolert fra den voksne hjernen bør opprettholde så mange av sine in vivo egenskaper som mulig (2j). Ofte en balanse mellom nødvendig forsiktighet og riktig hastighet må rammet. Care med isolering av hjernen fra skallen vil gjøre identifikasjonen av regionen av interesse betydelig enklere. Fjerning av vev så raskt som mulig etter at dyret euthanization og opprettholdelse av hjernen kaldt under høsting og vasking holder den stivere og i stor grad hjelper til med håndtering av vevet når det er plassert i den rustfrie snittformen. Dette reduserer også muligheten for ripping av vevet under snitteprosessen. Protokollen har også fordelen av å være ABLe for å få cellene til punkt Plating hurtig, da dette øker cellelevedyktighet når de er plassert in vitro. Riktig vev vasking før seksjonering hjelper også redusere potensialet for forurensning i kulturer. Under dissosiasjon prosessen, bør triturering med en 1 ml pipette være kraftig, men gjøres på en måte som ikke er til å generere overflødig bobler eller skumming av cellesuspensjonen, som negativt påvirker cellers overlevelse. Det første medium forandring er også viktig ettersom det fjerner mesteparten av de nonattached celler og cellulært avfall som resulterer fra vevet dissosiasjon prosess som inneholder faktorer som er skadelig for den innledende overlevelse av stammen cellepopulasjon. For forbedret visualisering etter farging, kan de nylig isolerte celler bli sådd ut på 25 mm glass-dekkglass som er plassert i bunnen av de seks-brønns plater. Konsentrasjonen av poly-L-ornitin og fibronektin som brukes i belegget bør økes til 500 pg / ml og 20 μg / ml, respektivt. Som et alternativ kan flere mindre dekkglass (dvs. 12 mm) være plassert i hver brønn. Disse kan deretter behandles for farging uavhengig av hverandre i separate brønner i en 24-brønns plate, nedskalering av mengdene av fargings reagenser som brukes for å ta hensyn til mindre volum. Dekkglass blir deretter montert på objektglass ved bruk av en standard vandig monteringsmedium.

Definere tilstedeværelse av NSCs i den voksne hjernen er av stor interesse innen nevrobiologi. Det er to generelle metoder for å identifisere en stamcelle. I den ene, kan et sett av biomarkører basert på en genekspresjon profil av stamcelle populasjonen brukes til bilde dem ved immunohistokjemi. Selv eksperimentelt enkel, gir den ikke noen funksjonelle data, og heller ikke definerer om cellene har de grunnleggende egenskaper av stamceller, evnen til selv fornye eller skille ut flere forskjellige celletyper. I den andre tilnærming, blir cellene isolert i either en ren eller heterogen befolkning, plassert i kultur, og det selvfornyelse og multipotential egenskaper er vurdert ved hjelp av levende celle befolkningen. Denne fremgangsmåten gir funksjonelle data, og kan brukes til å utvetydig beviser "stemness" i disse spesielle in vitro forsøksbetingelser. Imidlertid har vanskeligheter med å opprettholde disse celler i kultur hindret denne andre funksjonelle tilnærming. Faktisk, har manglende evne til å vokse NSCs fra andre områder av hjernen igjen inntrykk av at det er bare noen få spesialiserte nisjer der de bor.

Metoden som presenteres her muliggjør dyrking av NSCs fra mange forskjellige områder i CNS. Denne teknikken er basert på vårt arbeid som belyses en signaltransduksjon vei av stor betydning for å kontrollere antallet NSCs både in vitro og in vivo. De faktorene som inngår i denne protokollen ble valgt basert på omfattende signaltransduksjon studier, Som viser at de fremmer NSC vekst via en felles transkripsjonsfaktor Hes3. Våre tidligere studier viser at denne kombinasjonen ga en enda større økning i NSC tall i forhold til å bruke dem individuelt. Valget av hvilke farmakologisk støtte er lagt til kulturen bør vurderes i sammenheng med biologi blir studert. For eksempel, mens både Ang2 og Dll4 ha en positiv innvirkning på NSC vekst, de har motstridende effekter på blodkar formasjon ^22,23. Gjennom ytterligere optimalisering av forholdene kultur, vil flere nye biomarkører utover Hes3 trolig bli identifisert og utvide den anerkjente antall NSCs i den voksne hjernen ytterligere. Dette er eksemplifisert ved våre observasjoner at avgrensninger mellom den Hes3 + cellepopulasjon fra ulike hjerneområder kan gjøres. For eksempel Hes3 + celler fra ryggmargen, som de fra SVZ og ACA, viser en flerfoldig økning i antall deres når kultivert med dissefaktorer. I tillegg kan Hes3 +-celler fra alle disse regionene effektivt genererer neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Imidlertid er morfologi og genekspresjon av de differensierte celletyper ikke er identiske. Tilleggs biomarkører som skiller mellom ulike Hes3 + celletyper vil være et kjærkomment tilskudd til feltet. Metoden som presenteres her muliggjør den effektiv generering av NSC kulturer kan brukes som et verktøy mot dette målet.

Som NSC markører nestin og Sox2, transkripsjonsfaktor Hes3 identifiserer en cellepopulasjon som ved isolering kan formeres in vitro, så vel som differensiert i de primære celletyper som utgjør nervesystemet, neuroner, astrocytter og oligodendrocytter ^11. Men i motsetning til disse mer brukte markører, identifiserer Hes3 også hvil NSCs, som en konsekvens, er det mange Hes3 + celler ikke innlemme indikatorer på mitose ⁽³ H-thymidinrestene eller BrdU) i henhold homeostatic conditions (og dermed ha unngått klassiske deteksjonsteknikker). Anvendelse av protokollen som beskrives her er grunnleggende i oppdagelsen av denne NSC populasjonen. Antallet av disse celler øker i kulturen når de ble behandlet med faktorer produsert fra det vaskulære endotel, herunder Notch ligand Delta4 og Angiopoetin2, i samsvar med deres perivaskulær lokalisering in vivo ^24.

Etter å ha lett tilgang til disse celler isolert fra den voksne hjernen tillater eksperimentering for å undersøke hvordan cellene reagere på signaltransduksjon nivået til forskjellige faktorer, og gir noen prediktive indikasjoner på hvordan cellene vil reagere in vivo. Ser utover regenerativ medisin, viste vi at kulturen forholdene beskrevet her har relevans til kreftforskning også. De representerer bedre miljøet som kreft stamceller isolert fra glioblastoma multiforme erfaring mens i pasienten, slik at for studien of signalveier som kan bli manipulert til å motsette seg deres vekst ^30. Den brede anvendelsen av denne teknikken kunne ha betydelige konsekvenser for flere aspekter av forskning og medisin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit