Summary
Cortisol (CORT) hoopt zich op in de groeiende haarschacht van mensen en niet-humane primaten. We beschrijven methoden voor de extractie en analyse van haar CORT met hoge precisie en gevoeligheid. Meting van haar CORT is bijzonder geschikt voor het beoordelen van chronische spanning gedurende een periode van weken tot maanden.
Abstract
Het stresshormoon cortisol (CORT) wordt langzaam opgenomen in de groeiende haarschacht van mensen, niet-humane primaten en andere zoogdieren. We ontwikkeld en gevalideerd in een werkwijze voor CORT extractie en analyse van resusaap haar en vervolgens paste deze methode voor gebruik met menselijke hoofdhaar. In tegenstelling tot CORT "point samples" verkregen uit plasma of speeksel, haren CORT biedt een geïntegreerde meting van de hypothalamus-hypofyse-bijnierschors (HPA)-systeem activiteit, en dus fysiologische stress, tijdens de periode van hormoon oprichting. Omdat de menselijke hoofdhaar groeit met een gemiddelde snelheid van 1 cm / maand, CORT niveaus verkregen van haar segmenten enkele cm in lengte kan mogelijk dienen als een biomarker van stress ervaren gedurende een aantal maanden.
In onze methode wordt elke haar monster eerst tweemaal gewassen in isopropanol elk CORT van de buitenkant van de haarschacht, dat is afgegeven door zweet of talg verwijderen. Na droging bevatte demonster wordt gemalen tot een fijn poeder te breken van het haar eiwitmatrix en verhoging van de oppervlakte voor extractie. CORT uit het inwendige van de haarschacht wordt in methanol geëxtraheerd, wordt de methanol afgedampt en het extract wordt opgelost in assaybuffer. Gewonnen CORT, samen met standaarden en kwaliteitscontroles wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van een gevoelige en specifieke commercieel beschikbare enzym-immunoassay (EIA) kit. Uitlezing van de EIA wordt omgezet in pg CORT per mg gepoederd haar gewicht. Deze werkwijze is gebruikt in ons laboratorium haren CORT analyseren mensen verschillende soorten makaken, zijdeaapjes, honden en ijsberen. Veel studies zowel vanuit ons lab en van andere onderzoeksgroepen hebben de brede toepasbaarheid van haar CORT voor de beoordeling van chronische blootstelling aan stress in zowel natuurlijke als laboratorium instellingen aangetoond.
Introduction
Meting van CORT in plasma, speeksel, of nu in urine of ontlasting is gebruikt als een index van fysiologische stress sinds ontdekking van de functie van de HPA-as stress 1 Selye's. Hoewel talrijke artikelen gepubliceerd met betrekking HPA activiteit acuut stressvolle situaties, is het gebied belemmerd door het gebrek aan een eenvoudige en betrouwbare index van chronische fysiologische stress. Dit probleem doet zich voor omdat het plasma en speeksel zowel opbrengst "punt" schattingen van HPA activiteit die onderworpen zijn aan circadiane variatie zijn en kan worden verstoord door verstoringen van het milieu. Urine en fecale monsters leveren metingen van CORT en / of metabolietenuitscheiding dat een aantal uren tot een volledige dag in sommige gevallen overspannen. Verzamelen van meerdere monsters met een van deze matrices kunnen een ruwe samengestelde index van CORT niveau leveren; maar geen van deze benaderingen verschaft een werkelijk langdurige index HPA activiteit en de gevoeligheid van deze SYstengel tot chronische stressoren.
Meten CORT in het haar is begonnen om deze belangrijke behoefte te vullen in de stress literatuur. Aanvankelijke studies van verschillende laboratoria toonde de aanwezigheid van CORT in menselijk haar maar niet onderzocht of haar CORT niveaus veranderd als een functie van spanning 2. Aangezien ons laboratorium is geïnteresseerd voor vele jaren in de regulatie van de resusaap HPA-as door verschillende sociale en gedragsmatige factoren 3 hebben we besloten om methoden voor extractie en analyse van resusaap haar 4 vast te stellen en te valideren. Ervan uitgaande dat bloed overgedragen CORT langzaam en continu in groeiend haar wordt opgenomen, de toepassing van deze nieuwe methode was het niveau van haar afgeleide CORT als een geïntegreerde index van HPA activiteit gedurende een periode van weken tot maanden.
Verschillende methodologische problemen werden ondervonden bij het ontwikkelen van het huidige protocol. Eerste, had vorige studies dat kleine hoeveelheden o getoondf circulerende CORT worden uitgescheiden in het zweet en talg en dus kon de vacht van de buitenkant van de haarschacht 2. Om dit potentieel te verwarren elimineren, we een milde wasbeurt procedure die lijkt op externe CORT verwijderen terwijl het hebben van een minimaal effect op CORT aanwezig binnen de groeiende haarschacht ontwikkeld. Aldus aap haar onderworpen aan deze procedure (bijvoorbeeld twee 3-min wassen met isopropanol) verloor ongeveer 7-8% van het totaal haar CORT inhoud, en een derde was verwijderd minder dan 1% meer steroïde uit het monster 4. Er blijkt meer externe CORT in menselijk haar, aangezien dezelfde procedure verwijderd gemiddeld 27% totale CORT inhoud van de monsters (K. Rosenberg J. Meyer, ongepubliceerd). Zoals aap haar echter een aanvullend wassen die minder CORT (ongeveer 7%) dan de eerste twee wasbeurten. Daarom resultaten van beide aap en menselijk haar ondersteunen de stelling dat de meeste (zo niet alle) externe CORT verwijderd kan worden met behoud van een grote fractietie van CORT binnen de interne haarmatrix. Ten tweede, onze pilot-studies toonden ook aan dat het malen van het haar vóór de extractie aanzienlijk toegenomen CORT herstel van het monster, vermoedelijk door het openbreken van het complex eiwitachtige matrix van de haarschacht evenals het verhogen van de beschikbare oppervlakte voor penetratie oplosmiddel. Twee verschillende malen methoden ontwikkeld, elk met voor-en nadelen. Methode 1, die een kogelmolen gebruikt, heeft het voordeel van het produceren van de fijnste poeder. Echter, een kogelmolen is een relatief dure apparatuur item, indien gebruikt met standaard maalpotten en ballen, het kan slijpen slechts twee monsters tegelijk. Kleine monsters zijn ook moeilijk te verwerken met behulp van een kogelmolen met standaard slijpen potten. Methode 2, die een BeadBeater gebruikt, minder effectief in het malen vermogen. Hierdoor gemiddelde CORT herstel ongeveer 10% lager deze methode ten opzichte van de kogelmolen (ongepubliceerde gegevens). Anderzijds, een BeadBeateris aanzienlijk goedkoper dan een kogelmolen, kan 16-24 monsters worden gemalen in een keer, afhankelijk van het model en de methode is zeer geschikt voor kleine steekproeven. Vanwege de bovengenoemde differentiële herstel, is het raadzaam om dezelfde maalwerkwijze gebruiken voor alle monsters binnen een bepaalde studie.
Zodra het haar monsters zijn verwerkt, worden zij geëxtraheerd met methanol en CORT in extracten geanalyseerd door middel van een gevoelige en specifieke commerciële EIA-kit oorspronkelijk ontworpen om speeksel CORT meten. De extractie en analyse procedures zijn gedeeltelijk gevalideerd door aan te tonen dat seriële verdunningen van uittreksels uit de aap haar monsters leverde EIA lezingen die nauw parallel verkregen uit authentieke CORT normen lezingen. Vervolgens bleek dat haar CORT (naast plasma en speeksel CORT) was gevoelig voor grote levensduur stressor een administratief opdracht verplaatsing van de apen nieuwbouw wijken 4,5. De presentatiet papier zorgt voor een gedetailleerd verslag van de routinematig gebruikt in ons laboratorium voor mens en aap haar monsters te verwerken en te extraheren en te analyseren CORT van dergelijke monsters methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sample Collection en opslag
- Menselijk haar
- Zet de gehele lengte van het haar te bemonsteren (tot een potlood breedte diameter) met een rubberen band of clip. Geknipt haar zo dicht mogelijk bij de hoofdhuid mogelijk (maar zorg er voor nick de huid) met een schone schaar. Opmerking: De standaard sampling gebied is de achterste vertex van de schedel.
- Sommige onderzoekers hebben een afname in menselijk haar CORT niveaus gemeld afstand tussen de hoofdhuid 6, die het gevolg kan zijn afgespoeld herhaalde blootstelling aan water en shampoo 7 (maar zie Manenschijn et al.. 8 en Thomson et al.. 9 tegendraadse resultaten waarvoor geen gesegmenteerde daling werd waargenomen) Om de gevolgen van deze mogelijke "wash-out effect" zoveel mogelijk te beperken, raden we het verzamelen van haar segmenten dichtbij de hoofdhuid met een lengte van niet meer dan 3 cm (uitgaande van een gemiddelde groei van 1 cm / maand 10, een 3 cm segment bevat CORT dat is gedeponeerd gedurende ongeveer de laatste 3 maanden). Om dit te bereiken, gebruik een liniaal tot 3 cm van de eerste snede te meten en snijd opnieuw om de 3 cm monster opleveren. Let op: Zodra het haar is op lengte gesneden, is het niet langer nodig om de strengen op een lijn te houden, tenzij de studie omvat het snijden van het monster in afzonderlijke 1 cm lang segmenten een retrospectieve kalender van CORT depositie te vestigen over de periode vóór de bemonstering 6.
- Leg het haar monster in een zakje gemaakt van aluminium folie, een schone papieren envelop, of een 15 ml schroefdop van polypropyleen centrifugebuis van het type dat wordt gebruikt voor het monster wassen. Zoals CORT is zeer stabiel in haar 2 kunnen monsters onbeperkt worden bewaard bij -20 ° C en, indien nodig, verzonden overnacht bij omgevingstemperatuur.
- Het haar incassoprocedure moet worden beoefend op vrijwilligers en de praktijk monsters moeten worden afgewogen alvorens een volledige studie. Opmerking: Haar monsters als small zoals 5-10 mg worden geanalyseerd volgens de hieronder beschreven werkwijzen, hoewel het wenselijk om monsters> 10 mg verzamelen om de kans op het verkrijgen van de laagste CORT EIA metingen minimaliseren.
- Aap haar
- Scheren haar (100-250 mg) van de nek van de hals met een standaard dier klipper. Scheren zo dicht mogelijk bij de huid mogelijk, zorg dat u nick de huid en veroorzaken bloeden omdat het bloed CORT niveaus zijn zeer hoog in vergelijking met die gevonden in het haar. Opmerking: De hals gebied werd gekozen voor routinebemonstering omdat het over het algemeen een goede bron van haar en kan gemakkelijk worden waargenomen voor haargroei voorafgaand aan resampling.
- Leg het haar monster in een zakje gemaakt van aluminiumfolie of een 15 ml schroefdop polypropyleen centrifugebuis. Aap haar stalen worden en op dezelfde wijze als hierboven beschreven voor menselijk haarsteekproeven verzonden.
- Omdat aap haar tegenstelling menselijk hoofdhaar, groeit tot een bepaalde lengte en stops groeit 11, is het meestal niet mogelijk in dit geval om afstand te gebruiken uit de huid als een kalender voor CORT depositie. Indien een dier kan worden bemonsterd meerdere malen (bijvoorbeeld tijdens periodieke routine gezondheidsexamens), is het wenselijk om een eerste scheren uitvoeren om een basislijn tijdstip instellen en vervolgens reshave hetzelfde gebied na de gewenste tijd verstreken is. CORT in het tweede monster werd afgezet tijdens de scheerbeurt-reshave interval, die een nauwkeurige toerekening van CORT inhoud van het monster te HPA activiteit over dat interval 5 toelaat.
2. Monster Wassen en drogen
- Het wassen
- Plaats elke haar monster in een 15 ml schroefdop polypropyleen centrifugebuis.
- Voeg 5 ml van high performance vloeistofchromatografie (HPLC)-grade isopropanol aan elke buis gevolgd door herhaalde inversie gedurende 3 min met een rotator.
- Giet het isopropanol in een afvalcontainer, waarbij czijn geen van de monster verliezen.
- Herhaal de stappen 2.1.2 en 2.1.3 nog eens.
- Drogen
- Droog het haar gedurende ten minste 2-3 dagen om volledige verdamping te waarborgen isopropanol.
3. Monster Maal-en CORT Extraction - Methode 1 voor grote steekproeven
- Monster slijpen
- Plaats maximaal 250 mg gedroogd haar in een 10 ml roestvrij staal slijpen pot samen met een enkele 12 mm roestvrij staal slijpen bal.
- Wrijf gedurende 6 min bij een snelheid van 25 Hz met behulp van een kogelmolen.
- Wegen tot 50 mg gepoederd haar op een analytische balans en vervolgens overbrengen naar een schone 2,0 ml polypropyleen microcentrifugebuis voor volgende CORT extractie.
- CORT extractie
- Voeg 1,0 ml HPLC kwaliteit methanol aan de microcentrifugebuis met poedervormig monster.
- Cap de buis en incubeer het monster gedurende 18-24 uur bij kamertemperatuur met constant inversie met behulp van een rotator.
- Centrifugeer de buisjes bij 14.000 rpm gedurende 1 min bij kamertemperatuur om het poedervormige haar pellet.
- Breng 0,6 ml van de bovenstaande vloeistof om een schone 1,5 ml microcentrifugebuis, verzorgen de pellet poedervormig haar niet te verstoren.
4. Monster Maal-en CORT Extraction - Methode 2 voor kleine steekproeven
- Monster slijpen
- Plaats maximaal 60 mg van haar in een vooraf gewogen 2 ml microcentrifugebuis versterkt voor kraal pak slaag.
- Weeg het flesje om het monster gewicht te verkrijgen.
- Voeg drie 3,2 mm verchroomd staal kralen om elke flacon en vervolgens vermalen het monster gedurende ten minste 2 min in een kraal klopper. Als visuele inspectie blijkt dat het monster onvoldoende wordt verpulverd, dan voert de aanvullende slijpen voor 0,5 of 1 min. Opmerking: Overdrachten van de grond haar is in dit geval nodig omdat CORT extractie wordt uitgevoerd in hetzelfde flesje slijpen.
- CORT extractie
- Voeg 1,5 ml HPLC kwaliteit methanol aan de microcentrifugebuis met poedervormig monster.
- Cap de buis en incubeer het monster gedurende 18-24 uur bij kamertemperatuur onder constant inversie met een rotator.
- Centrifugeer de buisjes bij 10.000 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het poedervormige haar pellet. Opmerking: De chroomstaal kralen blijven in de buis met het haar tijdens de winning en centrifugeren stappen, die goed is voor de lagere centrifugeersnelheid vergelijking met methode 1.
- Breng 1,0 ml van de bovenstaande vloeistof om een schone 1,5 ml microcentrifugebuis, verzorgen de pellet poedervormig haar niet te verstoren.
5. Oplosmiddel Verdamping en Sample Reconstructie
- Droog vaststelling van methanol met behulp van een vacuüm verdamper of een stroom stikstofgas als een vacuüm verdamper is niet beschikbaar. Als een vacuüm verdamper wordt gebruikt, kan de methanoldamp worden gevangen door middelvan een koude val of chemische val uitgerust met een geactiveerde kool cartridge.
- Na verwijdering van de methanol, los het CORT extract in een geschikt volume van EIA testbuffer (verdunningsmiddel voor de test). Als relatief hoge CORT waarden worden verwacht, gebruik dan een buffer volume van 0,4 ml of meer. Als relatief lage waarden verwacht, dan kan het volume worden teruggebracht tot 0,2 ml of minder gevoeligheid te verhogen. Opmerking: 0.2 ml is voldoende volume om dubbele monsteroplossing minstens tweemaal uitgevoerd bij een herhaling van het monster nodig.
- Hetzij onmiddellijk assay het opgeloste monster of invriezen bij -20 ° C voor latere analyse. Opmerking: Als het opgeloste monster wordt bevroren, is het belangrijk om sublimatie tijdens het invriezen periode na een verandering in monstervolume voorkomen leidt tot een valse CORT waarde wanneer de definitieve berekeningen worden uitgevoerd.
6. CORT Assay en Data Conversion
- Analyseer het haar extractenCORT gebruik van een hoge gevoeligheid enzymimmunoassay (EIA) kit. Opmerking: Als u een commerciële speeksel CORT EIA kit, volg de aanbevelingen van de fabrikant, zoals gespecificeerd in de kit insert behalve dat de monsters zal duplo monsters van elke opgeloste haar extract in plaats van speeksel monsters.
- Bereid een kwaliteitscontrole (QC) haar extract voor gebruik in elke test.
- Verzamel een aantal extra haar monsters en ofwel verwerken hen individueel als in de stappen 4.1 en 4.2 of bundelen ze voor grote monster verwerking als in de stappen 3.1 en 3.2.
- Damp het oplosmiddel en reconstrueren de extracten als in de stappen 5.1 en 5.2, dan is het zwembad van het gereconstitueerde uittreksels uit een aantal enkele of samengevoegde monsters.
- Aliquot een geschikt volume van de gepoolde gereconstitueerde extract (bijv. 0,10 ml) in afzonderlijke microcentrifugebuizen en invriezen voor later gebruik.
- Ontdooien en voer een QC hoeveelheid wordt in tweevoud op elke immunoassay microplaat een refe biedenRence CORT waarde voor het controleren van de kwaliteit van elke run.
- Een intra-assay variatiecoëfficiënt (CV, gedefinieerd als de standaarddeviatie gedeeld door het gemiddelde van een verzameling van het monster waarden) kan worden berekend door het analyseren van 10-12 QC putten in dezelfde run, terwijl een inter-assay CV kan worden berekend met behulp van de QC-waarden over een groep loopt. Als je microplaatlezer software berekent een CV duplo die elke haar extract, wordt een alternatieve methode voor het bepalen intra-assay CV wordt het gemiddelde van deze individuele CV waarden over de gehele plaat te berekenen.
- Als een monster extract levert een lezing boven het hoogste CORT standaard in de EIA, toen nog een portie van het extract wordt met een geschikte hoeveelheid van de assay buffer verdund en de daaropvolgende EIA lezing wordt gecorrigeerd voor de verdunningsfactor. Monsters worden ook regelmatig opnieuw geanalyseerd als de CV voor duplo is> 10%.
- Omdat CORT EIA kits zijn ontworpen om te meten CORT values in vloeibare monsters zoals speeksel of plasma, de uitgang van de microplaat lezer software moet worden omgezet hoeveelheid CORT per gewichtseenheid poeder haar. De volgende formule omgezet assay output in ug / dl tot pg CORT per mg haar:
(A / B) * (C / D) * E * 10.000 = F
waarbij A = ug / dl vanaf assay uitgang, B = gewicht (in mg) haar onderworpen aan extractie, C = vol. (In ml) methanol toegevoegd aan de poedervormige haar, D = vol. (In ml) methanol hersteld van het extract en vervolgens gedroogd neer; E = vol. (In ml) assaybuffer gebruikt om de gedroogde extract reconstrueren, en F = eindwaarde van haar CORT concentratie in pg / mg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de afdruk van een representatieve set van menselijk haar monsters (volwassen mannelijke en vrouwelijke proefpersonen) verwerkt volgens methode 2 slijpen en extractie. Software gebruikt om de uitvoer van gegevens en een 4-parameter sigmoïdale curve op de CORT normen (figuur 2) past. De tussen-en CV's van deze plaat varieerde 0,01-5,73% met een gemiddelde intra-assay CV van 1,34%. De inter-assay CV bepaald met behulp van de QC-waarden uit negen recente menselijke haar assays werd 4,41%. De 37 monsters op deze plaat geanalyseerd leverde een waaier van haar CORT waarden 3,1-650 pg / mg (mediaan = 10,2 pg / mg; gemiddelde ± SD = 36,0 ± 110 pg / mg).
Methode 1 wordt gebruikt in ons laboratorium haren monsters van niet-menselijke primaten en andere grote dieren verwerken. Een vertegenwoordiger test van volwassen resusaap haar (voornamelijk uit vrouwtjes) leverde een scala aan CORT waarden 50,1-102 pg / mg (mediaan = 75,0; gemiddelde ± SD= 75,8 ± 14,0 pg / mg). De gemiddelde intra-assay CV voor deze test was 2,08%, en de inter-assay CV bepaald met behulp van de QC-waarden uit negen recente aap haar assays werd 4,63%.
Figuur 1. Software-uitgang voor een representatieve menselijke haar CORT assay. De duplo zijn: S1-S6 - CORT standaarden variërend van 0,012 ug / dl (S6) tot 3,0 ug / dl (S1), S7 - 0 CORT putten, B1 - niet-specifieke binding (NSB) putten die ontbreken anti-CORT antilichaam (de software trekt automatisch de gemiddelde NSB optische dichtheid [OD] waarde van alle andere OD), C1 en C2 - hoge en lage CORT calibrators verstrekt door de fabrikant; T1 - QC;
T2-T38 - monsters. Van C1 T38, de hoogste waarde in elke cel van de matrix is de gemeten OD waardevolle e van de overeenkomstige goed, en de lagere waarde in de linker cel van het paar is de CORT waarde in mg / dl berekend op basis van de gemiddelde OD-waarde. Merk op dat de monsters T9 en T31 leverde waarden boven de hoogste CORT standaard. Dientengevolge, werden beide monsters later verdund 4-voudig in verdunningsmiddel voor de test en opnieuw geanalyseerd. De reanalyzed waarden werden gebruikt na correctie voor de verdunningsfactor. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Standaard curve van de OD-waarden tegen log CORT concentratie voor dezelfde menselijke haar test. De R-kwadraat getoond in paneel A is de berekende goodness of fit van de curve aan de normen./ 50882/50882fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven haar CORT procedure is eenvoudig uit te voeren, is relatief goedkoop maakt gebruik van gemakkelijk verkrijgbare chemicaliën, reagentia en benodigdheden en vereist apparatuur die, met een uitzondering, waarschijnlijk aanwezig in een typische analytisch laboratorium zijn. De uitzondering is een knarsend apparaat zoals een kogelmolen of mini-BeadBeater. We merken dat sommige onderzoeksgroepen gehakt haar monsters in kleine fragmenten ongeveer 1 mm in lengte 12, maar op basis van onze observaties raden wij u aan het slijpen in plaats van hakken als dat mogelijk is. Een andere methodologische variatie in de literatuur gaat of om het haar te wassen vóór CORT extractie 13, en zo ja, welke wasomstandigheden te gebruiken. Indien wassen niet wordt uitgevoerd, dan riskeert men de mogelijkheid dat de methanolextract niet alleen CORT langzaam opgenomen via weken of maanden van haargroei, maar ook zweet-en / of talg afgeleide CORT afgezet laatst op bevathet oppervlak van het haar. Studies over ijsbeer monsters ondersteunen het bestaan van twee CORT fracties in het haar: een los-gebonden fractie verwijderbaar door korte isopropanol wassen van intacte haar dat vermoedelijk vertegenwoordigt voornamelijk verontreiniging oppervlak, en een meer strak-gebonden fractie die toegankelijk zijn met uitgebreide methanolextractie van is gepoederde haarsteekproeven 14. Dezelfde conclusie kan worden getrokken uit de afnemende hoeveelheden CORT door herhaalde isopropanol wassen (zie Inleiding) gewonnen uit aap en menselijk haar. Anderzijds, indien wassen wordt uitgevoerd, dan is de keuze van oplosmiddel en wasomstandigheden kunnen een significante invloed op de resulterende CORT waarden. De Society of Hair Testing heeft richtlijnen gepubliceerd voor het selecteren van een geschikt oplosmiddel te minimaliseren haar zwelling en eventuele opgeloste elutie uit het inwendige van de matrix haar tijdens het wassen 15. Hoewel deze aanbevelingen zijn ontwikkeld voor toepassing op drugstests in het haar, ze zijn relevant voor steroïde analyse ook.
Meten CORT in haar plaats van plasma of speeksel biedt een aantal voordelen 2. Belangrijker nog, deze aanpak biedt een biomarker van geïntegreerde CORT niveaus over periodes van weken tot maanden, dat wordt niet beïnvloed door het tijdstip van de dag waarop monsters worden genomen of door korte blootstelling aan stress vóór inzameling. Haar collectie is niet-invasieve, hoewel bemonstering van sommige diersoorten, zoals resusapen of beren verdoving van het onderwerp kan verlangen om veiligheidsredenen. Een ander voordeel is dat CORT bijzonder stabiel in vergelijking met haar andere matrices, die analyse van historische en archivering monsters zelfs als ze werden opgeslagen bij omgevingstemperatuur gedurende een lange periode mogelijk maakt. Tenslotte CORT niveaus in menselijk haar segmenten afgesneden op successievelijk grotere afstanden van de hoofdhuid soms gebruikt om een retrospectieve kalender HPA activiteit in de tijd te creëren. In dergelijke gevallen is het bijzonderly belangrijk om bewust te zijn van de eerder genoemde "wash-out" effect van herhaalde haren wassen. Hoewel sommige studies hebben niet hiertoe 8,9 repliceren, is het vermeldenswaard dat in deze studies werden de monsters niet voorafgaande aan extractie methanol gewassen. Deze belangrijke methodologische verschil kan helpen verklaren waarom haar CORT niveaus niet afnemen met de afstand van de hoofdhuid.
Een aantal beperkingen van het haar CORT aanpak moet ook worden vermeld. Ten eerste kan deze aanpak niet veranderingen in het circadiane ritme van HPA activiteit (zoals in sommige depressieve patiënten) of ontwaken CORT respons te detecteren. Haar CORT niveaus zou ook niet de invloed van relatief korte stressoren die tijdens de periode van hormoon opname detecteren. Daarom moet deze aanpak worden als aanvulling op de metingen van speeksel en / of plasma CORT, niet als vervanging voor dergelijke metingen. Ten tweede, dat het gebruik van haar CORT zalwaarschijnlijk met name van belang voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in psychosociale en milieu-invloeden, is het belangrijk om in gedachten dat verhoogde HPA activiteit kan plaatsvinden onder een aantal voorwaarden, met inbegrip van fysieke oefening, metabole afwijkingen, en infectieziekten te houden. Ten derde, terwijl gegevens beschikbaar over zowel mensen en apen ondersteunen de hypothese dat haar CORT voornamelijk afkomstig uit het bloed 2, deze hypothese nog niet bewezen. Inderdaad, Ito en medewerkers 16 het bestaan van een functionele HPA-achtig systeem gemicrodissecteerde menselijke haarfollikels behouden in orgaankweek aangetoond. De mate waarin haarzakjes bijdragen tot de CORT gemeten in de haarschacht nog onbekend op dit moment.
In slechts een paar jaar sinds haar oprichting als een nieuwe biomarker van as activiteit HPA, heeft haar CORT is gebruikt in een breed scala van toepassingen in tal van soorten. Binnen een aantal grote t veel van deze toepassingen vallenhemes gericht op het bepalen hoe langdurige HPA activiteit is gerelateerd aan chronische stress, endocriene stoornissen zoals de ziekte van Cushing of neuropsychiatrische aandoeningen zoals post-traumatische stressstoornis 2,17-19. Andere studies hebben gebruikt haar CORT tot HPA-as functie in relatie tot gedrags temperament, normale ontwikkeling, de invloed van ontwikkelingsstoornissen factoren zoals vroege jeugdervaringen bij mensen of verschillende kweekomstandigheden bij apen, milieu behoud van in het wild levende dieren, en retrospectief onderzoek onderzoeken van historische of archivering monsters. Bestudeerde soorten to-date met betrekking tot haar CORT omvatten mensen, verschillende soorten niet-menselijke primaten (makaken, vervet apen en bavianen), honden, katten, koeien, paarden, en verschillende soorten beren. Het is waarschijnlijk dat het gebruik van haar CORT langdurige HPA activiteit beoordelen of de fysiologische respons op chronische stress te onderzoeken of andere experimentele vragen te beantwoorden, blijft expand en worden toegepast op een nog grotere hoeveelheid soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Wij danken Kymberlee O'Brien, Celia Moore, en Edward Tronick (Departement Psychologie, Universiteit van Massachusetts, Boston) voor het verstrekken van de menselijke haar monsters geanalyseerd in deze studie, en Stephen Suomi en Amanda Dettmer (Laboratorium voor Vergelijkende Ethologie, NICHD) voor het verstrekken van de resusaap haarsteekproeven. Initiële ontwikkeling en het verdere gebruik van deze methode werd ondersteund door NIH RR11122 naar MAN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
