Summary
Cortisol (CORT) akkumuleres i voksende hår akslen af mennesker og ikke-menneskelige primater. Vi beskriver fremgangsmåder til ekstraktion og analyse af hår CORT med høj præcision og følsomhed. Måling af hår CORT er særligt velegnet til vurdering af kronisk stress over perioder på uger til måneder.
Abstract
Stresshormonet cortisol (CORT) langsomt indarbejdet i voksende hår akslen af mennesker, ikke-humane primater, og andre pattedyr. Vi udviklet og valideret en metode til CORT ekstraktion og analyser fra rhesusabe hår og derefter tilpasset denne metode til brug med human hovedbund hår. I modsætning til CORT "punktprøver" opnået fra plasma eller spyt, hår CORT giver en integreret måling af hypothalamus-hypofyse-binyrebark-system (HPA)-aktivitet, og dermed fysiologisk stress, i løbet af hormonet inkorporering. Da humant hovedbund hår vokser med en gennemsnitlig hastighed på 1 cm / måned, CORT niveauer opnået fra hår segmenter flere cm i længden potentielt kan tjene som en biomarkør for stress opleves over flere måneder.
I vores fremgangsmåde hver hårprøve først vasket to gange i isopropanol for at fjerne enhver CORT fra kanten af håret, der er blevet deponeret fra sved eller sebum. Efter tørringPrøven formales til et fint pulver til at bryde op hårets proteinmatrix og øge overfladearealet til ekstraktion. CORT fra det indre af håret ekstraheres med methanol, methanolen afdampes, og ekstrakten rekonstitueres i assaypuffer. Ekstraheret CORT sammen med standarder og kvalitetskontrol, analyseres derefter ved hjælp af en følsom og specifik kommercielt tilgængeligt enzymimmunoassay (EIA) kit. Udlæsning fra VVM omdannes til pg CORT per mg pulveriseret hår vægt. Denne metode er blevet anvendt i vores laboratorium til analyse hår CORT i mennesker, flere arter af makakaber, silkeaber, hunde og isbjørne. Mange undersøgelser både fra vores laboratorium og fra andre forskergrupper har vist den brede anvendelighed af hår CORT til vurdering af kronisk stress eksponering i naturlige såvel som laboratorie-indstillinger.
Introduction
Måling af CORT i plasma, spyt eller lejlighedsvis i urin eller afføring er blevet brugt som et indeks for fysiologisk stress siden Selye opdagelse af den rolle, HPA akse i stress 1. Selvom mange papirer er blevet offentliggjort vedrørende HPA aktivitet akut stressende situationer, har inden været hæmmet af manglen på en enkel og pålidelig indeks af kronisk fysiologisk stress. Dette problem opstår, fordi plasma og spyt både yield "Point" estimater af HPA aktivitet, der er genstand for døgnrytmen variation og kan forstyrret af miljømæssige forstyrrelser. Urinveje og fækale prøver gav målinger af CORT og / eller metabolitudskillelse der spænder et antal timer op til en hel dag i nogle tilfælde. Indsamling af flere prøver ved hjælp af nogen af disse matricer kan give et groft sammensat indeks for CORT niveauer over tid, men ingen af disse tilgange giver en virkelig langsigtet indeks HPA aktivitet og reaktionsevne denne SYstamceller til kroniske stressfaktorer.
Måling CORT i håret er begyndt at udfylde dette vigtige behov i stress litteratur. Indledende undersøgelser af flere laboratorier viste tilstedeværelsen af CORT i menneskehår, men ikke undersøge, om hår CORT niveauer ændres som en funktion af stress 2. Som vores laboratorium har været interesseret i mange år i reguleringen af rhesusaben HPA aksen ved forskellige sociale og adfærdsmæssige faktorer 3, vi satte sig for at etablere og validere metoder til ekstraktion og analyse af rhesusabe hår 4. Baseret på den forudsætning, at CORT blodbårne langsomt og kontinuerligt er indarbejdet i voksende hår, med henblik på denne nye metode var at anvende niveauer af hår afledt CORT som en integreret indeks for HPA aktivitet i perioder på uger til måneder.
Række metodologiske udfordringer opstod i udviklingen af den nuværende protokol. For det første havde de tidligere undersøgelser vist, at små mængder of cirkulerende CORT udskilles i sved og talg, og derfor kunne belægge ydersiden af hårstrået 2. For at fjerne denne potentielle forvirre, har vi udviklet en mild vask procedure, der synes at fjerne ekstern CORT samtidig have en minimal effekt på CORT til stede inden for det voksende hårstrået. Således abe hår underkastes denne fremgangsmåde (dvs. to 3-minutters vaske med isopropanol) mistede ca 7-8% af den samlede hår CORT indhold, og en tredje vask fjernes mindre end 1% mere steroid fra prøven 4. Der synes at være mere ekstern CORT i menneskehår, da den samme procedure fjernet i gennemsnit 27% samlede CORT indhold fra prøverne (K. Rosenberg og J. Meyer, upublicerede). Ligesom abe hår imidlertid en yderligere vask indeholdt meget mindre CORT (ca. 7%) end de første to vaske. Derfor resultaterne fra både abe og menneskehår understøtte den påstand, at de fleste (hvis ikke alle) ekstern CORT kan fjernes, samtidig med at en stor brøkdelning af CORT i det indre hår matrix. For det andet, vores pilotundersøgelser viste også, at formaling håret inden ekstraktionen væsentligt forøget CORT opsving fra prøven, formentlig ved at bryde åbne den komplekse proteinholdige matrix af håret samt øge det areal til rådighed for opløsningsmiddel penetration. To forskellige slibe metoder blev udviklet, hver med fordele og ulemper. Metode 1, som anvender en kuglemølle har den fordel, at producere de fineste pulver. Men en kuglemølle er et relativt dyrt udstyr element, og hvis de anvendes med standard formaling krukker og kugler, er det i stand til at slibe kun to prøver ad gangen. Små prøver er også vanskelige at bearbejde ved hjælp af en kuglemølle med standard slibning krukker. Metode 2, som anvender en beadbeater, er mindre effektiv i dens slibning evne. Som et resultat, gennemsnitlig CORT recovery er cirka 10% lavere ved hjælp af denne metode i forhold til kuglemølle (upublicerede data). På den anden side, en beadbeaterer betydeligt billigere end en kuglemølle, kan 16-24 prøver slibes på en gang afhængigt af modellen, og metoden er velegnet til små prøver. På grund af ovennævnte forskellen genvinding, er det tilrådeligt at bruge den samme slibning metode for alle prøver i en særlig undersøgelse.
Når hårprøver er blevet behandlet, er de ekstraheres med methanol og CORT i ekstrakterne analyseres ved hjælp af en følsom og specifik kommerciel EIA-kit oprindeligt designet til at måle spyt CORT. Udtræk og assayprocedurer blev valideret i en del ved at påvise, serielle fortyndinger af uddrag fra abe hårprøver gav VVM aflæsninger, der nøje sidestykke måleresultaterne fra autentiske CORT standarder. Vi derefter viste, at hår CORT (foruden plasma og spyt CORT) var følsomme over for den store liv stressor af en administrativt mandat flytning af aberne til nye boliger kvartaler 4,5. Den præsentationt papir giver en detaljeret redegørelse for de metoder, der anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium til at behandle menneskelige og abe hårprøver og at uddrage og analysere CORT fra sådanne prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Prøvetagning og opbevaring
- Menneskehår
- Fastgør hele længden af håret der skal udtages prøver (op til en blyant-bredde i diameter) med en elastik eller klip. Klip håret så tæt på hovedbunden som muligt (pas på ikke at nick huden) med en ren saks. Bemærk: Den standard prøveudtagning område er den bageste toppunkt af kraniet.
- Nogle forskere har rapporteret et fald i menneskehår CORT niveauer med afstanden fra hovedbunden 6, som kan skyldes udvaskning ved gentagen udsættelse for vand og shampoo 7 (selvom se Manenschijn et al. 8 og Thomson et al. 9 for strid resulterer i som ingen segmental nedgang blev observeret) For at minimere konsekvenserne af dette potentiale "udvaskning effekt", anbefaler vi at indsamle hår segmenter proksimalt til hovedbunden med en længde ikke er større end 3 cm (forudsat en gennemsnitlig vækstrate på 1 cm / måned 10, en 3 cm segment indeholder CORT, der er blevet aflejret over de sidste ca 3 måneder). For at opnå dette, skal du bruge en lineal til at måle 3 cm fra den første klippe og skære igen at give prøve 3 cm. Bemærk: Når håret er blevet skåret til i længden, er det ikke længere nødvendigt at holde strengene i tilpasningen medmindre undersøgelsen indebærer skære prøven i separate 1 cm lange segmenter til at etablere en retrospektiv kalender over CORT aflejring for den periode forud for prøvetagning 6..
- Hår prøve anbringes i en pose lavet af aluminium folie, et rent papir kuvert, eller en 15 ml skruelåg af polypropylen centrifugerør af den type, der anvendes til prøven vask. Som CORT er ekstremt stabil i håret 2, kan prøverne opbevares på ubestemt tid ved -20 ° C, og om nødvendigt, afsendt natten over ved omgivelsestemperatur.
- Proceduren hår samling bør praktiseres på frivillige og den praksis prøver skal vejes før der iværksættes en fuld undersøgelse. Bemærk: Hår prøver som small som 5-10 mg kan analyseres under anvendelse af de her beskrevne metoder, selv om det er ønskeligt at indsamle prøver> 10 mg for at minimere sandsynligheden for at opnå VVM aflæsninger under den laveste CORT standard.
- Monkey hår
- Shave hår (100-250 mg) fra nakken ved hjælp af en standard dyr Clipper. Barbere så tæt på huden som muligt, og pas på ikke at nick huden og forårsage blødninger, fordi blodet CORT ekstremt høje i forhold til dem, der findes i håret. Bemærk: Den halsområdet blev valgt til rutinemæssig prøveudtagning, fordi det generelt er en god kilde af hår og kan let observeres for hårvækst før resampling.
- Hår prøve anbringes i et etui lavet af aluminiumsfolie eller en 15 ml skruelåg af polypropylen centrifugerør. Monkey hårprøver skal opbevares og sendes på samme måde som beskrevet ovenfor for menneskelige hårprøver.
- Fordi abe hår, i modsætning til den menneskelige hovedbund hår vokser til en vis længde og derefter stops vokser 11, er det generelt ikke muligt i dette tilfælde afstanden brug fra huden som en kalender for CORT deposition. , Hvis der kan udtages prøver et dyr mere end én gang (for eksempel under periodiske rutinemæssige sundhed eksamener), er det imidlertid ønskeligt at udføre en indledende barbering at indstille en baseline tidspunkt og derefter reshave det samme område efter den ønskede tid er udløbet. CORT i den anden prøve blev deponeret under barbering-reshave interval, som tillader en præcis fordeling af prøvens CORT indhold til HPA aktivitet over dette interval 5..
2. Prøve vask og tørring
- Vask
- Placer hvert hår prøven i en 15 ml skruelåg af polypropylen centrifugerør.
- Der tilsættes 5 ml højtydende væskekromatografi (HPLC)-kvalitet isopropanol til hvert rør efterfulgt af gentagen inversion i 3 minutter ved hjælp af en rotator.
- Dekanteres isopropanol i en affaldscontainer, der tager cer ikke at miste nogen af prøven.
- Gentag trin 2.1.2 og 2.1.3 en gang mere.
- Tørring
- Tør håret i mindst 2-3 dage for at sikre fuldstændig isopropanol fordampning.
3. Prøve slibning og CORT Extraction - Metode 1 for store prøver
- Prøve slibning
- Anbring op til 250 mg tørret hår i en 10 ml rustfrit stål slibning krukke sammen med en enkelt 12 mm rustfrit stål slibning bolden.
- Grind prøven i 6 minutter ved en hastighed på 25 Hz ved hjælp af en kuglemølle.
- Veje op til 50 mg pulveriseret hår på en analytisk balance og derefter overføre det til en ren 2,0 ml polypropylen mikrocentrifugerør til efterfølgende CORT ekstraktion.
- CORT udvinding
- Tilsæt 1,0 ml HPLC-kvalitet methanol til mikrocentrifugerør indeholdende den pulveriserede prøve.
- Sæt låg på glasset og inkuberes prøven i 18-24 timer ved stuetemperatur med constant inversion ved hjælp af en rotator.
- Centrifuger rørene ved 14.000 rpm i 1 min ved stuetemperatur for at pelletere den pulveriserede hår.
- Overfør 0,6 ml af supernatanten til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør, pas på ikke at forstyrre pellet af pulveriseret hår.
4.. Prøve slibning og CORT Extraction - Metode 2 for små prøver
- Prøve slibning
- Anbring op til 60 mg hår i en i forvejen vejet 2 ml mikrocentrifugerør forstærket for perle slå.
- Vejes hætteglasset for at opnå prøvens vægt.
- Tilføj tre 3,2 mm kromstål perler til hvert hætteglas og derefter slibe prøven i mindst 2 min i en perle tæppebanker. Hvis besigtigelse viser, at prøven er utilstrækkeligt pulveriseret, derefter udføre ekstra slibning til 0,5 eller 1 min. Bemærk: Ingen overdragelse af jorden hår er nødvendig i dette tilfælde, fordi CORT ekstraktion foretages i samme hætteglas slibning.
- CORT udvinding
- Tilføj 1,5 ml HPLC-kvalitet methanol til mikrocentrifugerør indeholdende den pulveriserede prøve.
- Sæt låg på glasset og inkuberes prøven i 18-24 timer ved stuetemperatur med konstant inversion ved hjælp af en rotator.
- Centrifuger rørene ved 10.000 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere den pulveriserede hår. Bemærk: krom stål perler forbliver i røret med håret under ekstraktion og centrifugering trin, som tegner sig for den lavere centrifugering hastighed i forhold til metode 1.
- Overfør 1,0 ml af supernatanten til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør, pas på ikke at forstyrre pellet af pulveriseret hår.
5.. Afdampning af opløsningsmiddel og Sample Rekonstituering
- Tør ned methanol under anvendelse af enten et vakuum fordamper eller en strøm af nitrogengas, hvis en vakuuminddamper er ikke tilgængelig. Hvis der anvendes et vakuum fordamper, kan methanol damp blive fanget ved hjælpen kold fælde eller en kemisk fælde udstyret med et aktivt kul patron.
- Efter fjernelse af methanol, rekonstituere CORT ekstrakt i et passende volumen af EIA assay buffer (assay-fortyndingsmiddel). Hvis der forventes relativt høje CORT værdier, så bruge en buffer volumen på 0,4 ml eller mere. Hvis der forventes relativt lave værdier, så volumen kan reduceres til 0,2 ml eller derunder for at øge følsomheden. Bemærk: 0,2 ml er tilstrækkelig volumen til at køre dublerede portioner af prøven mindst to gange i tilfælde en gentagelse af prøven er påkrævet.
- Enten analysere den rekonstituerede prøve straks eller fryse det ved -20 ° C til senere analyse. Bemærk: Hvis den rekonstituerede prøve er frosset, er det vigtigt at undgå sublimering under frysepunktet perioden siden en ændring i prøvevolumen vil føre til en falsk CORT værdi, når de endelige beregninger er udført.
6.. CORT Assay og datakonvertering
- Analysere hår ekstrakter tilCORT hjælp af en høj-følsomhed enzymimmunoassay (EIA) kit. Bemærk: Hvis du bruger en kommerciel spyt CORT EIA kit, følg producentens anbefalinger som angivet i sættet indsatsen bortset fra at prøverne vil være dublerede portioner af hver rekonstitueret hår ekstrakt i stedet for spytprøver.
- Forbered en kvalitetskontrol (QC) hår ekstrakt til brug i hvert assay.
- Saml en række ekstra hårprøver og enten behandle dem individuelt som i trin 4.1 og 4.2 eller samle dem for stor prøve behandling som i trin 3.1 og 3.2.
- Opløsningsmidlet afdampes og rekonstruere de uddrag som i trin 5.1 og 5.2, så samle de rekonstituerede uddrag fra flere individuelle eller poolede prøver.
- Afmål en passende volumen af den poolede rekonstitueret ekstrakt (f.eks 0,10 ml) i individuelle mikrocentrifugerør og fryse til senere brug.
- Tø og køre en QC portion i to eksemplarer på hver immunoassay mikroplade til at give en refeDet sker jævnligt CORT værdi for at kontrollere kvaliteten af hver kørsel.
- En intra-assay variationskoefficient (CV, defineret som standardafvigelsen divideret med middelværdien af et sæt sampleværdier) kan beregnes ved at analysere 10-12 QC brønde i samme løb, hvorimod en inter-assay CV kan beregnes ved hjælp af QC-værdier over en gruppe af kørsler. Hvis ens mikropladelæser software beregner et CV for hullerne til dobbeltbestemmelse, der repræsenterer hvert hår ekstrakt, så en alternativ metode til bestemmelse af intra-assay CV er at beregne middelværdien af de individuelle CV-værdier på tværs af hele pladen.
- Hvis nogen proeveekstrakt giver en læsning større end den højeste CORT standard i VVM, derefter en anden portion af ekstraktet fortyndes med en passende mængde assaypuffer og den efterfølgende VVM-aflæsningen er korrigeret for fortyndingsfaktoren. Prøver også rutinemæssigt analyseres igen, hvis CV for hullerne til dobbeltbestemmelse er> 10%.
- Fordi CORT VVM kits er designet til at måle CORT vadier i flydende prøver, såsom spyt eller plasma, skal produktionen af mikropladelæseren software omdannes til mængden af CORT per vægtenhed pulveriseret hår. Følgende formel konverterer assay output i ug / dl til pg CORT per mg hår:
(A / B) * (C / D) * E * 10.000 = F
hvor A = ug / dl fra assay output; B = vægten (i mg) af hår udsat for ekstraktion, C = vol. (I ml) methanol tilsættes til det pulverformige hår D = vol. (I ml) methanol udvundet fra ekstraktet og efterfølgende tørret ned, E = vol. (I ml) assaypuffer anvendt til at rekonstituere det tørrede ekstrakt, og F = slutværdi hår CORT koncentrationen i pg / mg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser udskrift fra et repræsentativt sæt af menneskelige hårprøver (voksen mandlige og kvindelige forsøgspersoner) behandles ved hjælp af metode 2 slibning og udvinding. Computer software blev anvendt til at generere data output og passer til en 4-parameter sigmoidal kurve til Cort standarder (figur 2). De mellem-og cv'er fra denne plade varierede fra 0,01 til 5,73% med en gennemsnitlig intra-assay CV på 1,34%. Den inter-assay CV bestemt ved QC værdier fra ni seneste menneskehår assays blev 4,41%. De 37 analyserede prøver på denne plade gav en række hår CORT værdier fra 3,1 til 650 pg / mg (median = 10,2 pg / mg; betyde ± SD = 36.0 ± 110 pg / mg).
Metode 1 anvendes i vores laboratorium til at behandle hårprøver fra ikke-humane primater og andre store dyr. En repræsentativ analyse af voksne rhesusabe hår (for det meste fra hundyr) gav en række CORT værdier 50,1-102 pg / mg (median = 75,0; middel ± SD= 75,8 ± 14,0 pg / mg). Den gennemsnitlige intra-assay CV til denne analyse var 2,08%, og den inter-analyse CV bestemt ved QC værdier fra ni seneste abe hår assays blev 4,63%.
Figur 1. Software udgang til en repræsentativ menneskehår CORT assay. De duplikerede brønde er som følger: S1-S6 - CORT standarder i området fra 0,012 ug / dl (S6) til 3,0 ug / dl (S1), S7 - 0 CORT brønde; B1 - ikke-specifik binding (NSB) brønde, der mangler anti-CORT antistof (softwaren automatisk fratrækker den gennemsnitlige NSB optiske densitet [OD] værdi fra alle andre OD aflæsninger), C1 og C2 - høj og lav CORT kalibratorer leveres af fabrikanten; T1 - QC;
T2-T38 - prøver. Fra C1-til T38, den øvre værdi i hver celle i matrixen er den målte OD værdifuldt e fra den tilsvarende godt, og den lavere værdi i den venstre celle af parret er CORT værdi i mg / dl beregnet ud fra den gennemsnitlige OD-værdi. Bemærk, at prøverne T9 og T31 gav aflæsninger over det højeste CORT standard. Som følge heraf blev begge prøver senere fortyndet 4-fold i assay-fortyndingsmiddel og analyseres igen. De reanalyseret værdier blev brugt efter korrektion for fortyndingsfaktoren. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Standardkurve for OD-værdier versus log CORT koncentration for de samme menneskelige hår analyse. R-kvadrerede værdi er vist i panel A er den beregnede goodness of fit af kurven til standarderne./ 50882/50882fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Håret CORT ovenfor beskrevne procedure er enkel at udføre, er relativt billigt, gør brug af let tilgængelige kemikalier, reagenser og forsyninger og kræver udstyr, der, med en undtagelse, er tilbøjelige til at være til stede i en typisk analytisk laboratorium. Undtagelsen er en slibning apparat, såsom en kuglemølle eller mini-beadbeater. Vi bemærker, at nogle forskergrupper hakkekød hårprøver i små fragmenter omkring 1 mm i længde 12, men baseret på vores observationer, vi anbefaler at udføre slibning i stedet for hakning, hvis det overhovedet er muligt. Et andet område af metodisk variation i litteraturen indebærer, om ikke at vaske hår før CORT udvinding 13, og hvis ja, hvad vask betingelser for at bruge. Hvis vask ikke er udført, så risikerer man muligheden for, at methanolekstrakt vil indeholde ikke kun CORT indarbejdet langsomt over uger eller måneder af hårvækst, men også sved-og / eller sebum-afledt CORT deponeret nylig påoverfladen af håret. Undersøgelser om isbjørne prøver støtte eksistensen af to CORT brøker i håret: en løst bundet fraktion fjernes ved kort isopropanol vask af intakt hår, der formentlig repræsenterer primært overfladeforurening, og et mere stramt bundne fraktion, der er tilgængelig ved omfattende methanol udvinding af pulveriserede hårprøver 14. Den samme konklusion kan drages fra aftagende mængder CORT udvundet fra abe og menneskehår ved gentagen isopropanol vask (se Indledning). På den anden side, hvis vask er udført, så valget af opløsningsmiddel og vaskebetingelser kan have en betydelig indvirkning på de resulterende CORT værdier. The Society of Hair Testing har offentliggjort retningslinjer for udvælgelsen af et passende opløsningsmiddel for at minimere hår hævelse og potentiel opløste eluering fra det indre af hår matrix under vaskeprocessen 15. Selv om disse anbefalinger blev udviklet til anvendelse på narkotika testning i håret, er de relevant for steroid analyse samt.
Måling CORT i håret snarere end plasma eller spyt giver en række fordele 2. Vigtigst er det, denne tilgang giver en biomarkør for integrerede CORT niveauer over perioder på uger til måneder, der er upåvirket af den tid på dagen, hvor prøverne er indsamlet eller ved kortvarig stress eksponering før indsamling. Hår samling er invasiv, selvom prøveudtagning af visse dyrearter såsom rhesus aber eller bjørne kan kræve bedøvelse af emnet af sikkerhedsmæssige årsager. En anden fordel er, at CORT er ekstremt stabil i håret sammenlignet med andre prøvematricer, som tillader analyse af historiske eller arkiveringsformål prøver, selv om de er blevet opbevaret ved omgivende temperatur i en lang periode. Endelig har CORT niveauer i menneskehår segmenter skåret ved successivt større afstande fra hovedbunden undertiden blevet brugt til at skabe en retrospektiv kalender over HPA aktivitet over tid. I sådanne tilfælde er det særligtly vigtigt at være opmærksom på den tidligere nævnte "udvaskning" effekt af gentagen hårvask. Selv om nogle undersøgelser har undladt at kopiere denne effekt 8,9, er det værd at bemærke, at i disse undersøgelser prøverne blev ikke vasket før methanolekstraktion. Denne vigtige metodiske forskel kan hjælpe med at forklare, hvorfor hår CORT niveauer ikke faldt med afstanden fra hovedbunden.
Nogle begrænsninger af hår CORT fremgangsmåde bør også nævnes. For det første kan denne fremgangsmåde ikke påvise ændringer i døgnrytmen rhythmicity af HPA-aktivitet (som ses hos nogle deprimerede patienter) eller opvågningen CORT respons. Hår CORT niveauer også måske ikke registrere effekten af relativt korte stressfaktorer, der fandt sted i løbet af hormonet inkorporering. Derfor bør denne tilgang opfattes som et supplement til målinger af spyt og / eller plasma CORT, ikke som en erstatning for sådanne målinger. For det andet, mens brugen af hår CORT vilsandsynligvis være af særlig værdi for forskere interesseret i psykosociale og miljømæssige stressfaktorer, er det vigtigt at huske på, at forhøjede HPA aktivitet kan opstå under en række forskellige forhold, herunder motion, metaboliske abnormiteter, og smitsomme sygdomme. For det tredje, mens der findes data fra både mennesker og aber, der støtter hypotesen om, at håret CORT stammer hovedsageligt fra blodbanen 2, denne hypotese er endnu ikke bevist. Faktisk Ito og medarbejdere 16 har vist, at der foreligger en funktionel HPA-lignende system i Mikrodissekterede menneskelige hårsække opretholdt i orgel kultur. I hvor høj grad hårsækkene bidrager til CORT målt i håret forbliver ukendt på dette tidspunkt.
På bare et par år siden sin fremkomst som en ny biomarkør for HPA-akse-aktivitet, har hår CORT blevet brugt i en bred vifte af applikationer på tværs af en lang række arter. Mange af disse applikationer falder flere store thæm med henblik på at bestemme, hvor lang sigt HPA aktivitet er relateret til kronisk stress, endokrine lidelser, såsom Cushings sygdom eller neuropsykiatriske lidelser, såsom post-traumatisk stress disorder 2,17-19. Andre undersøgelser har brugt hår CORT at undersøge HPA akse funktion i forhold til adfærdsmæssige temperament, normal udvikling, indflydelse af udviklingsmæssige faktorer såsom tidlige barndomsoplevelser i mennesker eller forskellige produktionssystemer forhold i aber, beskyttelse af vilde-levende dyr miljømæssige og retrospektiv undersøgelse af historiske eller arkivers prøver. Arter studeret til dato med hensyn til hår CORT indbefatter mennesker, flere arter af ikke-menneskelige primater (makakaber, vervet aber og bavianer), hunde, katte, kvæg, heste og flere arter af bjørne. Det er sandsynligt, at anvendelsen af hår CORT at vurdere langsigtede HPA aktivitet, uanset at undersøge den fysiologiske respons på kronisk stress eller behandle andre eksperimentelle spørgsmål, vil fortsætte med at exekspandere og anvendes til et endnu større udvalg af arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Kymberlee O'Brien, Celia Moore og Edward Tronick (Institut for Psykologi, University of Massachusetts, Boston) for at sikre de menneskelige hårprøver analyseret i denne undersøgelse, og Stephen Suomi og Amanda Dettmer (Laboratory of Comparative Etologi, NICHD) for tilvejebringe de rhesus abe hårprøver. Initial udvikling og fortsat anvendelse af denne metode er blevet støttet af NIH RR11122 til MAN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production - Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. Montagna, W., Dobson, R. L. IX, Pergamon Press. 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. an, H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. Ø, Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair - State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
