Summary
Cortisol (CORT) reichert sich in der wachsenden Haarschaft von Menschen und nicht-menschlichen Primaten. Wir beschreiben Methoden zur Extraktion und Analyse von Haar CORT mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit. Messung von CORT Haar ist besonders für die Beurteilung chronischer Stress über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten geeignet.
Abstract
Das Stresshormon Cortisol (CORT) wird langsam in die wachsende Haarschaft von Menschen, nichtmenschliche Primaten und anderen Säugetieren aufgenommen. Wir entwickelten und validierten ein Verfahren zur Extraktion und Analyse CORT von Rhesusaffen Haar und anschließend angepasst diese Methode für die Verwendung mit der menschlichen Kopfhaare. Im Gegensatz zu CORT "point samples" aus Plasma oder Speichel erhalten, bietet Haar CORT eine integrierte Messung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-System (HPA)-Aktivität und damit physiologischen Stress, während der Zeit der Hormon Gründung. Da die menschliche Kopfhaar wächst mit einer durchschnittlichen Rate von 1 cm / Monat, CORT Stufen von Haar Segmente erhalten einige cm in der Länge kann potenziell als Biomarker von Stress über eine Anzahl von Monaten erlebt zu dienen.
In unserem Verfahren wird jede Haarprobe wird zunächst zweimal in Isopropanol gewaschen, um CORT von außerhalb des Haarschaftes, der von Schweiß oder Talg abgelagert hat, zu entfernen. Nach dem Trocknen derProbe wird zu einem feinen Pulver zu brechen das Haar die Proteinmatrix und vergrößern die Oberfläche für die Extraktion zu erden. CORT vom Innenraum des Haarschaftes in Methanol extrahiert wird das Methanol abgedampft, und der Extrakt wird in Assaypuffer rekonstituiert. Heraus CORT zusammen mit Standards und Qualitätskontrollen, wird dann mittels eines sensitiven und spezifischen kommerziell erhältlichen Enzym-Immunoassay (EIA) Kit analysiert. Auslesen von der EIA ist mit CORT pg pro mg pulverisierte Haargewicht umgewandelt. Diese Methode wurde in unserem Labor verwendet worden, um Haar CORT beim Menschen zu analysieren, verschiedene Arten von Makaken-Affen, Krallenaffen, Hunde und Eisbären. Viele Studien sowohl aus unserem Labor und von anderen Forschungsgruppen haben die breite Anwendbarkeit des Haar CORT zur Beurteilung der chronischen Stressbelastung in natürlichen als auch Labor-Einstellungen demonstriert.
Introduction
Mess Cort im Plasma, Speichel, oder gelegentlich in Urin oder Kot wurde als Index der physiologische Stress Selye seit Entdeckung der Rolle der HPA-Achse in Stress 1 verwendet. Obwohl zahlreiche Arbeiten veröffentlicht worden über HPA Aktivität akut belastenden Situationen hat das Feld, das durch das Fehlen einer einfachen und zuverlässigen Index der chronischen physiologischen Stress behindert. Dieses Problem entsteht, weil Plasma und Speichel sowohl Ausbeute als "Punkt" Schätzungen der HPA Tätigkeit, die einer zirkadianen Variation sind und können durch Umweltstörungen verwechselt werden. Harn-und Stuhlproben ergeben Messungen von CORT und / oder Metaboliten-Ausscheidung, die eine Anzahl von Stunden bis zu einem ganzen Tag in einigen Fällen zu überspannen. Sammlung mehrerer Proben mit einer dieser Matrizen können eine grobe Composite-Index der Kortikosteroid-Konzentration im Laufe der Zeit zur Verfügung stellen, jedoch bietet keiner dieser Ansätze einen wirklich langfristigen Index der HPA-Aktivität und die Reaktionsfähigkeit dieser syStammzellen zu chronischen Stressfaktoren.
Mess CORT im Haar hat damit begonnen, diesen wichtigen Bedarf in der Stress-Literatur zu füllen. Erste Studien von verschiedenen Laboratorien zeigte die Anwesenheit von CORT in menschliches Haar, aber nicht untersuchen, ob Haare CORT Stufen in Abhängigkeit von Stress 2 geändert. Als unser Labor hat in der Regulation des Rhesusaffen HPA-Achse durch verschiedene Sozial-und Verhaltensfaktoren 3 interessiert seit vielen Jahren, machten wir uns auf Verfahren zur Extraktion und Analyse von Rhesusaffen Haar 4 zu etablieren und zu validieren. Basierend auf der Annahme, daß Blut übertragbaren Cort langsam und kontinuierlich wachsende Haar eingearbeitet, deren Zweck dieses neuen Verfahrens wurde auf ein Niveau von Haar abgeleitet CORT als integrierte Index von HPA-Aktivität über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten zu verwenden.
Mehrere methodischen Herausforderungen in der Entwicklung der vorliegenden Protokoll aufgetreten. Zunächst hatten frühere Studien, dass kleine Mengen o gezeigtf zirkulierenden CORT in Schweiß und Talg ausgeschieden wird und daher Beschichtung der Außenseite der Haarschaft 2. Um dieses Potenzial zu verwechseln eliminieren, entwickelten wir eine milde Waschverfahren, die auf externe CORT entfernen, während eine minimale Auswirkung auf CORT innerhalb der wachsenden Haarschaft vorhanden erscheint. Somit Affenhaar diesem Verfahren (dh zwei 3-minütiges Waschen mit Isopropanol) unterworfen verloren etwa 7-8% der gesamten Haar CORT Gehalt und eine dritte Waschschritt entfernt von weniger als 1% Steroid aus der Probe 4. Es scheint mehrere externe CORT in menschlichen Haaren, da dasselbe Verfahren entfernt einen Durchschnitt von 27% Gesamtgehalt CORT aus den Proben (K. Rosenberg und J. Meyer, unveröffentlicht). Wie Affenhaar, enthielt jedoch eine zusätzliche Wasch weniger CORT (etwa 7%) als die ersten zwei Waschungen. Daher ergibt sich aus beiden Affen-und Menschenhaar unterstützt die Behauptung, dass die meisten (wenn nicht alle) externe CORT entfernt werden kann, während ein Hauptfraktionention von CORT innerhalb der inneren Haarmatrix. Zweitens unsere Pilotstudien zeigten auch, dass die Schleif Haar vor signifikant erhöht CORT Erholung von der Probenextraktions, vermutlich durch Aufbrechen des Komplexes proteinartigen Matrix des Haares sowie die Erhöhung der Oberfläche für das Eindringen von Lösungsmitteln zur Verfügung. Wurden zwei verschiedene Schleifverfahren entwickelt, die jeweils Vor-und Nachteile. Verfahren 1, die eine Kugelmühle verwendet, hat den Vorteil der Herstellung von feinstem Pulver. Allerdings ist eine Kugelmühle eine relativ teure Geräte und Artikel, wenn mit Standard-Mahlbecher und Kugeln verwendet wird, in der Lage, Schleifen nur zwei Proben gleichzeitig ist es. Kleine Proben sind auch schwierig zu verarbeiten unter Verwendung einer Kugelmühle mit Standard Mahlbecher. Methode 2, welche eine BeadBeater verwendet, ist weniger effektiv in ihrer Schleiffähigkeit. Als Ergebnis beträgt die durchschnittliche Rückgewinnungs CORT etwa 10% niedriger mit diesem Verfahren im Vergleich zu der Kugelmühle (unveröffentlichte Daten). Andererseits ist ein BeadBeaterist wesentlich billiger als eine Kugelmühle, kann 16-24 Proben gleichzeitig, je nach Modell gemahlen werden, und das Verfahren ist für kleine Proben gut geeignet. Aufgrund der oben erwähnten Differential Erholung ist es ratsam, das gleiche Schleifverfahren für alle Proben innerhalb einer bestimmten Studie verwendet.
Nachdem die Haarproben verarbeitet worden sind, werden sie mit Methanol und CORT der Extrakte mittels einer sensitiven und spezifischen kommerziellen EIA-Kit ursprünglich zur Speichel CORT Messung analysiert. Die Extraktions-und Testverfahren wurden zum Teil durch die zeigen, dass serielle Verdünnungen der Extrakte aus Affenhaarproben ergab UVP-Messwerte, die die aus authentischen CORT-Standards erhalten Lesungen eng parallel validiert. Wir haben dann gezeigt, dass Haare CORT (zusätzlich zu Plasma-und Speichel CORT) war empfindlich auf die großen Lebens Stressor einer verwaltungs beauftragt Umzug der Affen zu neuen Wohnviertel 4,5. Die Präsentationt Papier liefert eine detaillierte Darstellung der in unserem Labor routinemäßig verwendet werden, um Menschen und Affen Haarproben zu verarbeiten und aus solchen Proben zu extrahieren und zu analysieren, CORT Methoden.
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Protocol
1. Entnahme und Lagerung
- Menschliches Haar
- Sichern die gesamte Länge der Haare (bis zu einem Stift-Breite im Durchmesser) mit einem Gummiband oder Clips abgetastet werden. Haare schneiden so nah an der Kopfhaut wie möglich (dabei nicht zu nick der Haut) mit einer sauberen Schere. Hinweis: Die Standard-Probenentnahmebereich ist der hintere Scheitelpunkt des Schädels.
- Einige Forscher haben einen Rückgang in den Menschenhaar CORT Ebenen mit der Entfernung von der Kopfhaut 6, die aufgrund von wiederholten Kontakt mit Wasser und Shampoo 7 Auswaschen sein kann, wenn auch sehen Manenschijn et al. 8 Thomson et al. 9 zum Gegenteil führt berichtet (und die kein Segment Rückgang beobachtet wurde) Um die Auswirkungen dieses Potenzial "Washout-Effekt" zu minimieren, empfehlen wir die proximalen Segmente sammeln Haare auf der Kopfhaut mit einer Länge von nicht mehr als 3 cm (bei einer durchschnittlichen Wachstumsrate von 1 cm / Monat 10, eine 3 cm Segment enthält CORT, die etwa über die letzten 3 Monate hinterlegt wurde). Um dies zu erreichen, verwenden Sie ein Lineal, um 3 cm vom ersten Schnitt messen und wieder geschnitten, um die 3 cm Probe zu erhalten. Hinweis: Sobald das Haar auf Länge geschnitten wurde, ist es nicht mehr notwendig, um die Stränge in Ausrichtung zu halten, es sei denn die Studie beinhaltet das Schneiden der Probe in separate 1 cm lange Segmente eine Retrospektive Kalender CORT Abscheidung über den Zeitraum vor der Probenahme zu etablieren 6.
- Platzieren Sie die Haarprobe in einem Beutel aus Aluminiumfolie, einem sauberen Papierumschlag oder ein 15 ml-Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen des Typs zur Proben Waschen verwendet wird. Als Cort im Haar 2 extrem stabil, Proben unbegrenzt bei -20 ° C gelagert werden, falls erforderlich, über Nacht bei Raumtemperatur versandt.
- Das Haar Sammlung Verfahren sollte an Freiwilligen durchgeführt werden und die Praxis Proben sollten vor Antritt einer vollständigen Studien abgewogen werden. Hinweis: Haarproben, wie small 5-10 mg können mit den hier beschriebenen Verfahren analysiert werden, obwohl es wünschenswert ist, um Proben> 10 mg sammeln, um die Wahrscheinlichkeit zu erhalten EIA-Ablesungen unter der niedrigsten CORT Standard minimieren.
- Affe Haar
- Shave Haar (100-250 mg) aus dem Nacken mit einem Standard-Tierschermaschine. Rasieren Sie so nah an der Haut wie möglich, darauf achtend, nicht nick die Haut und verursachen Blutungen, weil das Blut der Kortikosteroid-Konzentration im Vergleich zu denen in der Haar gefunden werden, sind extrem hoch. Hinweis: Die Hals-Bereich wurde für die routinemäßige Stichproben gewählt, weil es in der Regel eine gute Quelle der Haare und kann leicht für das Nachwachsen der Haare vor dem Resampling beobachtet werden.
- Legen Sie die Haarprobe in einem Beutel aus Aluminiumfolie oder einer 15 ml mit Schraubverschluss Polypropylen-Zentrifugenrohr. Affenhaar Proben gespeichert und in der gleichen Weise wie oben für den menschlichen Haarproben beschrieben versendet.
- Da Affen Haare, im Gegensatz zu menschlichen Kopfhaar wächst zu einer bestimmten Länge und dann stops wachsenden 11, ist es im Allgemeinen nicht möglich ist in diesem Fall, um Abstand von der Haut als Kalender für CORT Abscheidung zu verwenden. Allerdings, wenn ein Tier mehr als einmal (zum Beispiel während der regelmäßigen Routinegesundheitsprüfungen) abgetastet werden, ist es wünschenswert, eine erste Rasur durchführen, um eine Grundlinie Zeitpunkt festzulegen und dann reshave den gleichen Bereich, nachdem die gewünschte Zeit abgelaufen ist. CORT in der zweiten Probe wurde während der Rasur-reshave Intervall, das eine genaue Zuordnung der CORT-Gehalt der Probe zu HPA-Aktivität über dieses Intervall 5 ermöglicht abgeschieden.
2. Beispiel Waschen und Trocknen
- Wasch
- Platzieren Sie jede Haarprobe in eine 15 ml mit Schraubverschluss Polypropylen-Zentrifugenröhrchen.
- 5 ml der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)-grade Isopropanol zu jedem Röhrchen, gefolgt von wiederholten Umkehrung für 3 min unter Verwendung eines Rotors.
- Dekantiert die Isopropanol in einen Abfallbehälter, wobei cnicht zu einem Proben verlieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 und 2.1.3 noch einmal.
- Die Trocknung
- Trocknen Sie das Haar für mindestens 2-3 Tage, um komplette Isopropanol Verdunstung zu gewährleisten.
3. Beispiel Schleifen und CORT Extraktion - Methode 1 für große Proben
- Probenschleifen
- Legen Sie bis zu 250 mg getrocknetes Haar in einen 10 ml Mahlbecher aus rostfreiem Stahl mit einem einzigen 12-mm-Edelstahlschleif Kugel.
- Mahlen die Probe für 6 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 25 Hz unter Verwendung einer Kugelmühle.
- Wiegen bis zu 50 mg Pulver Haar auf einer Analysenwaage und übertragen sie auf eine saubere 2,0 ml Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen für die anschließende Extraktion CORT dann.
- CORT Extraktion
- 1,0 ml HPLC-Methanol zu dem Mikrozentrifugenröhrchen pulverförmige Probe enthält.
- Verschließe das Röhrchen und Inkubation der Probe für 18-24 h bei Raumtemperatur mit COnStant Inversion mit einem Rotator.
- Zentrifugieren der Röhrchen bei 14.000 Upm für 1 min bei Raumtemperatur, um das pulverförmige Haarpelletieren.
- Übertragen Sie 0,6 ml der Überstand in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, kümmert sich nicht um das Pellet von pulverförmigen Haare stören.
4. Beispiel Schleifen und CORT Extraktion - Methode 2 für kleine Proben
- Probenschleifen
- Platzieren von bis zu 60 mg des Haares in eine vorgewogene 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für Korn Schlagen verstärkt.
- Erneut wiegen, das Fläschchen, um die Probengewicht zu erhalten.
- Fügen Sie drei 3,2 mm Chromstahlkugeln in jedes Fläschchen und dann mahlen die Probe für mindestens 2 min in einer Kugelmühle. Bei der Sichtprüfung zeigt, dass die Probe nicht ausreichend pulverisiert, dann führen weitere Schleif für 0,5 oder 1 min. Hinweis: Keine Übertragung der Masse Haar ist in diesem Fall erforderlich, da CORT Extraktion wird in der gleichen Gefäß wie das Schleifen durchgeführt wird.
- CORT Extraktion
- 1,5 ml von HPLC-Qualität von Methanol zu dem Mikrozentrifugenröhrchen pulverförmige Probe enthält.
- Verschließe das Röhrchen und Inkubation der Probe für 18-24 h bei Raumtemperatur unter konstantem Inversion unter Verwendung eines Rotators.
- Zentrifugieren der Röhrchen bei 10.000 rpm für 5 min bei Raumtemperatur, um das pulverförmige Haarpelletieren. Hinweis: Die Chromstahlkugeln verbleiben in dem Rohr mit dem Haar während der Extraktion und Zentrifugation Schritte, die für den unteren Drehzahlkonten Zentrifugieren im Vergleich zu Verfahren 1.
- Übertragen Sie 1,0 ml der Überstand in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, kümmert sich nicht um das Pellet von pulverförmigen Haare stören.
5. Lösungsmittelverdampfung und Proben Rekonstitution
- Trocknen Sie die Methanol unter Verwendung entweder eines Vakuumverdampfers oder eines Stroms von Stickstoffgas bei einem Vakuumverdampfer ist nicht verfügbar. Wenn ein Vakuumverdampfer verwendet wird, kann der Methanoldampf mittels eingeschlossen werdeneiner Kühlfalle oder einem chemischen Falle mit einer Aktivkohlepatrone ausgestattet.
- Nach Entfernung des Methanols rekonstituieren Cort Extrakt in einem geeigneten Volumen von EIA-Assay-Puffer (Assayverdünnungsmittel). Wenn relativ hohen CORT Werte zu erwarten sind, dann verwenden Sie ein Puffervolumen von 0,4 ml oder mehr. Wenn relativ niedrige Werte zu erwarten sind, dann wird das Volumen auf 0,2 ml oder weniger verringert werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Hinweis: 0,2 ml ausreichend Volumen, um doppelte Aliquots der Probe mindestens zweimal im Falle laufen eine Wiederholung der Probe erforderlich ist.
- Entweder testen die rekonstituierte Probe sofort oder frieren sie bei -20 ° C für spätere Analysen. Hinweis: Falls die rekonstituierte Probe eingefroren ist, ist es wichtig, Sublimation während des Gefrier Zeitraum seit einer Änderung in Probenvolumen zu vermeiden, wird zu einem falschen Wert CORT, wenn die endgültigen Berechnungen durchgeführt werden führen.
6. CORT Assay und Datenkonvertierung
- Assay die Haar Extrakte fürCORT mit einem hochempfindlichen Enzym-Immunoassay (EIA)-Kit. Hinweis: Bei Verwendung eines handelsüblichen Speichel CORT EIA-Kit, folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers als im Kit Einsatz angegeben, außer dass die Testproben werden doppelte Aliquots jeder wiederhergestellt Haar-Extrakt anstelle von Speichelproben sein.
- Bereiten Sie eine Qualitätskontrolle (QC) Haar-Extrakt für den Einsatz bei jedem Test.
- Sammeln Sie eine Reihe von zusätzlichen Haarproben und verarbeiten sie entweder einzeln wie in den Schritten 4.1 und 4.2 oder bündeln sie für große Probenverarbeitung wie in den Schritten 3.1 und 3.2.
- Das Lösungsmittel verdampft und rekonstruieren die Extrakte wie in den Schritten 5.1 und 5.2, dann bündeln die wiederhergestellten Extrakten aus mehreren Einzel-oder Sammelproben.
- Aliquot ein geeignetes Volumen der gepoolten rekonstituierte Extrakt (zB 0,10 ml) in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und für die spätere Verwendung einfrieren.
- Auftauen und führen ein QC aliquoten in zweifacher Ausfertigung auf jeder Mikro Immunoassay, ein Refe bietenRenče CORT Wert für die Überprüfung der Qualität von jedem Lauf.
- Eine Intra-Assay-Variationskoeffizienten (CV, definiert als Standardabweichung dividiert durch den Mittelwert aus einer Reihe von Abtastwerten) kann durch Analysieren 10-12 QC Vertiefungen im gleichen Durchlauf berechnet werden, während ein Inter-Assay-CV berechnet werden Verwendung der QC-Werte auf eine Gruppe von Auflagen. Wenn man den Mikroplatten-Reader-Software berechnet einen Lebenslauf für die Doppel, die jedes Haar-Extrakt, dann eine alternative Methode zur Bestimmung der Intra-Assay-CV ist, um den Mittelwert dieser einzelnen CV-Werte über die gesamte Platte zu berechnen.
- Wenn eine Probe Extrakt ergibt ein Lese größer als der höchste Standard CORT im EIA, dann ein weiteres Aliquot des Extrakts mit einer geeigneten Menge an Testpuffer verdünnt, und das anschließende Lesen EIA ist für den Verdünnungsfaktor korrigiert. Die Proben werden auch routinemäßig erneut analysiert, wenn der Lebenslauf für die Doppel ist> 10%.
- Da CORT EIA Kits sind so konzipiert, CORT va messenLues in flüssigen Proben wie Speichel oder Plasma, das Ausgangssignal des Mikroplatten-Lesesoftware muss CORT Menge pro Gewichtseinheit des pulverförmigen Haar umgewandelt werden. Die folgende Formel konvertiert Assay Ausgabe in g / dl auf CORT pg pro mg Haar:
(A / B) * (C / D) * E * F = 10.000
A = g / dl von Assay-Ausgang; B = Gewicht (in mg) der Haare, um die Extraktion unterzogen, C = vol. (In ml) von Methanol zu dem pulverförmigen Haar zugegeben, D = vol. (In ml) Methanol aus dem Extrakt gewonnen und anschließend getrocknet unten, E = vol. (In ml) der Testpuffer verwendet, um den Trockenextrakt zu rekonstituieren, und F = Endwert der Haare CORT Konzentration in pg / mg.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt den Ausdruck aus einer repräsentativen Reihe von menschlichen Haarproben (erwachsenen männlichen und weiblichen Probanden) nach der Methode 2 Schleifen und Extraktion verarbeitet. Computersoftware wurde verwendet, um den Datenausgang zu erzeugen und eine 4-Parameter-sigmoiden Kurve an die CORT Standards (Fig. 2) zu passen. Die zwischen-und Lebensläufen von dieser Platte reichte von 0,01 bis 5,73% bei einer durchschnittlichen Intra-Assay-VK von 1,34%. Die Inter-Assay CV bestimmt unter Verwendung der QC-Werte von den letzten neun Menschenhaar-Assays wurde 4,41%. Die 37 Proben auf dieser Platte analysiert ergab eine Reihe von Haar CORT-Werte von 3,1 bis 650 pg / mg (Median = 10,2 pg / mg; Mittelwert ± SD = 36,0 ± 110 pg / mg).
Methode 1 wird in unserem Labor benutzt, um Haarproben von nicht-menschlichen Primaten und andere große Tiere zu verarbeiten. Ein Vertreter der Erwachsenen Assay Rhesusaffen Haare (meist aus Frauen) ergab eine Reihe von CORT-Werte von 50,1 bis 102 pg / mg (Median = 75,0; Mittelwert ± SD= 75,8 ± 14,0 pg / mg). Die durchschnittliche Intra-Assay CV für diesen Test war 2,08% und mit den QC-Werte von den letzten neun Affen Haar-Assays wurde 4,63% der Inter-Assay CV bestimmt.
Fig. 1 ist. Software-Ausgang für einen repräsentativen menschliches Haar CORT-Assay. Die zwei Vertiefungen sind wie folgt: S1-S6 - CORT Standards im Bereich von 0,012 &mgr; g / dl (S6) auf 3,0 &mgr; g / dl (S1); S7 - 0 CORT Vertiefungen, B1 - unspezifische Bindung (NSB) Vertiefungen, die Anti-CORT fehlt Antikörper (subtrahiert die Software automatisch das durchschnittliche NSB optischen Dichte [OD]-Wert von allen OD-Messwerte), C1 und C2 - Hoch-und Nieder CORT Kalibratoren des Herstellers; T1 - QC;
T2-T38 - Testproben. C1 bis T38 ist der obere Wert in jeder Zelle der Anordnung der gemessene OD Bewertungs e aus dem entsprechenden gut, und der untere Wert in der linken Zelle des Paares ist die CORT Wert in g / dl von der OD-Wert berechnet. Beachten Sie, dass Proben T9 und T31 ergaben Messwerte über dem höchsten CORT Standard. Als Ergebnis wurden beide Proben später verdünnt 4-fach in Testverdünnungsmittels und erneut analysiert. Die Werte wurden erneut analysiert nach der Korrektur für die Verdünnungsfaktor verwendet. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Standardkurve der OD-Werte gegen log CORT-Konzentration für die gleichen menschlichen Haar-Assay. Die in A gezeigt, R-Quadrat-Wert ist der berechnete Güte der Anpassung der Kurve an die Standards./ 50882/50882fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Die oben beschriebenen Haar CORT Verfahren ist einfach durchzuführen, ist relativ preiswert, macht Gebrauch von frei verfügbaren Chemikalien, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien und Geräte benötigt, die, mit einer Ausnahme, wird wahrscheinlich in einem typischen analytischen Labor vorhanden sein. Die Ausnahme ist eine Schleifvorrichtung, wie einer Kugelmühle oder Mini BeadBeater. Wir stellen fest, dass einige Forschungsgruppen Hackfleisch Haarproben in kleine Fragmente etwa 1 mm in der Länge 12, aber auf der Grundlage unserer Beobachtungen, die wir empfehlen, das Schleifen statt Hacken, wenn überhaupt möglich. Ein weiterer Bereich der methodischen Variation in der Literatur handelt oder nicht, um das Haar vor der Extraktion 13 CORT waschen, und wenn ja, welche Waschbedingungen zu verwenden. Wenn Waschen nicht durchgeführt wird, dann ist die Möglichkeit, dass die Methanol-Extrakt wird nicht nur CORT langsam über die Wochen und Monate des Haarwachstums einbezogen, sondern auch Schweiß-und / oder Talg abgeleiteten CORT kürzlich hinterlegt enthalten Risiken eindie Oberfläche des Haares. Studien über Eisbären Proben unterstützen die Existenz von zwei Fraktionen CORT in Haar: eine lose gebundene Fraktion abnehmbar durch kurze Isopropanol Waschen der Haare intakt, die vermutlich vor allem für Oberflächenkontamination und eine fest gebundene Fraktion, die durch umfangreiche Gewinnung von Methanol zugänglich ist pulverförmigen Haarproben 14. Die gleiche Schlussfolgerung kann aus den abnehmenden Mengen von CORT von Affen und Menschenhaar durch wiederholte Wasch Isopropanol (siehe Einleitung) extrahiert gezogen werden. Auf der anderen Seite, wenn das Waschen durchgeführt wird, dann ist die Wahl der Lösungsmittel-und Waschbedingungen können einen erheblichen Einfluss auf die resultierende CORT Werte. Die Society of Testing Haar hat Richtlinien für die Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels zu minimieren, Haarquellpotential und gelösten Elution aus dem Inneren der Haarmatrix während des Waschprozesses 15 veröffentlicht. Wieder Obwohl diese Empfehlungen für die Anwendung auf Drogentests im Haar entwickelt, sind sielevant für Steroid-Analyse als auch.
Mess CORT im Haar anstatt Plasma oder Speichel bietet eine Reihe von Vorteilen 2. Am wichtigsten ist, bietet dieser Ansatz eine Biomarker integriert CORT Ebenen über Zeiträume von Wochen bis Monaten, die von der Tageszeit, wenn die Proben gesammelt oder durch kurze Stressbelastung vor der Sammlung unbeeinflusst ist. Haar-Kollektion ist nicht-invasive, obwohl Probenahme von einigen Tierarten wie Rhesusaffen oder Bären kann Betäubung des Themas aus Sicherheitsgründen erforderlich. Ein weiterer Vorteil ist, dass Cort im Vergleich mit anderen Matrices, die Analyse von historischen oder Archivierungs Proben, auch wenn sie bei Umgebungstemperatur für einen langen Zeitraum gelagert worden erlaubt im Haar extrem stabil. Schließlich haben die Kortikosteron-Konzentration in der Menschenhaar Segmente nacheinander größeren Entfernungen von der Kopfhaut abgeschnitten manchmal verwendet worden, um eine Retrospektive Kalender der HPA-Aktivität über die Zeit zu schaffen. In solchen Fällen ist es besonderslich wichtig zu wissen, der zuvor erwähnte "Washout"-Effekt durch wiederholte Haarwäsche hergestellt werden. Obwohl einige Studien haben es versäumt, diesen Effekt zu 8,9 replizieren, ist es erwähnenswert, dass in diesen Studien wurden die Proben nicht vor Methanolextraktion gewaschen. Diese wichtige methodische Unterschied kann erklären, warum Haare CORT Ebenen nicht mit der Entfernung von der Kopfhaut zurückgehen.
Einige Einschränkungen der Haare CORT Ansatz sollte auch erwähnt werden. Erstens kann dieser Ansatz Veränderungen in der circadianen Rhythmik von HPA-Aktivität (wie in manchen depressiven Patienten aus gesehen) oder das Erwachen CORT Antwort nicht erkennen. Haar CORT Ebenen kann auch nicht erkennen, die Auswirkungen der relativ kurzen Stressoren, die während der Zeit der Hormon Einbau aufgetreten. Daher sollte dieser Ansatz als komplementär betrachtet werden, um Messungen von Speichel und / oder Plasma-Cort nicht als Ersatz für solche Messungen. Zweitens, während die Verwendung von Haar CORT wirdwahrscheinlich von besonderem Wert für Forscher, die sich in psychosozialen und Umwelt-Stressoren sein, ist es wichtig zu beachten, die erhöhte HPA-Aktivität kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich körperlicher Betätigung, Stoffwechselstörungen und Infektionskrankheiten auftreten zu halten. Drittens, während Daten existieren von beiden Menschen und Affen die Hypothese unterstützt, dass Haar CORT ist vor allem aus der Blutbahn 2 abgeleitet, diese Hypothese noch nicht nachgewiesen worden. Tatsächlich Ito und Mitarbeiter 16 haben die Existenz eines funktionellen HPA-ähnliches System in microdissected menschlichen Haarfollikel in Organkultur gehalten gezeigt. Der Grad, in dem Haarfollikel tragen zur CORT im Haarschaft gemessen bleibt zu diesem Zeitpunkt unbekannt.
In nur wenigen Jahren seit seiner Gründung als neue Biomarker für die Aktivität der HPA-Achse, hat Haare CORT in einer Vielzahl von Anwendungen in zahlreichen Arten verwendet. Viele dieser Anwendungen fallen in mehrere große tHäme bei der Bestimmung, wie langfristige HPA Aktivität ist es, chronischen Stress, endokrine Erkrankungen wie Morbus Cushing oder neuropsychiatrischen Erkrankungen wie posttraumatische Belastungsstörung 2,17-19 Zusammenhang sollen. Andere Studien haben Haar CORT zur Funktion der HPA-Achse in Bezug auf Verhaltens Temperament, eine normale Entwicklung, dem Einfluss von Entwicklungsfaktoren wie frühkindliche Erfahrungen bei Menschen oder verschiedenen Haltungsbedingungen in Affen-, Umwelt-Erhaltung der wild lebenden Tiere und retrospektive Untersuchung untersuchen von historischen oder Archivierungs Proben. Spezies die bisher untersucht in Bezug auf Haar CORT umfassen Menschen, mehrere Arten von nicht-menschlichen Primaten (Makaken, Meerkatzen und Paviane), Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, und mehrere Arten von Bären. Es ist wahrscheinlich, dass die Verwendung von Haar CORT zur langfristigen HPA-Aktivität zu beurteilen, ob die physiologische Reaktion auf chronischen Stress zu untersuchen oder zu anderen experimentellen Fragen anzugehen, wird ex weiterhinauszubauen und zu einer noch größeren Vielfalt von Arten angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken Kymberlee O'Brien, Celia Moore, und Edward Tronick (Department of Psychology, University of Massachusetts, Boston) für die Bereitstellung der menschlichen Haarproben in dieser Studie analysiert und Stephen Suomi und Amanda Dettmer (Labor für Vergleichende Verhaltensforschung, NICHD) für Bereitstellung der Rhesusaffen Haarproben. Anfängliche Entwicklung und weitere Nutzung dieser Methode wurde von NIH RR11122 MAN unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0 ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2 mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10 ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12 mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Rotator for 15 ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipettor | |||
| Analytical balance |
References
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