Summary
本文提供了一个协议，右心室的大小和小鼠肺动脉高压的超声心动图评价。应用范围包括表型测定和序列评估转基因和心肌病和肺血管病变的毒素诱导的小鼠模型。
Abstract
转基因和肺动脉高压（PAH）的毒性模型被广泛用于研究PAH的病理生理和调查潜在的治疗方法。定的费用和参与创建疾病的动物模型的时候，也有研究工具，以准确地评估疾病的表型的表达是至关重要的。右心室功能不全是肺动脉高压的主要表现。超声心动图是在啮齿动物模型右心室功能的无创性评估的主体，有明确的翻译给人类在其中相同的工具用于的优势。肺动脉高压小鼠模型发布超声心动图协议所缺乏的。
在这篇文章中，我们描述了一个协议，用于评估RV和肺动脉高压的小鼠模型具有显性负突变BMPRII肺血管的功能，但是，这个协议适用于影响肺血管或心脏右任何疾病。我们提供动物制剂，图像采集和血液动力学计算每搏量，心输出量和肺动脉压力的估计值的详细说明。
Introduction
升高的肺动脉压和右心室（RV）功能障碍是肺血管疾病的动物模型和人类患者的肺动脉高压（PAH）的标志。 PAH的转基因和毒性（ 如野百合碱或缺氧）模型被广泛用于研究PAH的病理生理和调查潜在的治疗方法。定的费用和参与创建疾病的动物模型的时候，也有研究工具，以准确地评估疾病的表型的表达是至关重要的。
超声心动图是在啮齿类动物模型1,2心室功能的无创性评估的中流砥柱。超声心动图具有明显的翻译给人类在其中相同的工具用于的优势。此外，一些遗传模型表现出不完全外显3，无创识别受影响的动物的能力，节省了宝贵的时间和资源。 disea的无创性评估在不牺牲动物本身的严重程度也可以让研究人员连续调查研究治疗的效果。这一点尤其重要，因为快速性与平移疗法可进展为人体试验4,5。
在人类中，房车大小和肺动脉高压的超声心动图评价是由于胸骨位置和房车6的不规则形状特别具有挑战性。啮齿类动物模型具有体积小的附加挑战和极其快速的心脏速率（300〜700次/ min）。最近的进展包括更高的帧速率和更小的换能器具有改进的图像质量，在某些实验方案甚至允许有意识的成像，虽然大多数啮齿动物成像在麻醉下7,8完成。超声心动图在肺动脉高压大鼠模型的极好的实验方案进行了描述和验证对MRI和侵入血流动力学1,9。然而，超声心动图发布肺动脉高压小鼠模型的协议所缺乏的。
在这篇文章中，我们描述了一个协议，用于评估PAH的小鼠模型具有显性负突变BMPRII和肺动脉环缩后孤立右室后负荷模型房车和肺血管的功能，但是，这个协议适用于任何疾病的影响肺血管或心脏的权利。我们将介绍动物准备和房车的尺寸和功能以及主肺动脉（PA）的大小的详细的评估。我们还演示了估计每搏输出量和心输出量所需要的技术和计算。技术上的限制，排除肺动脉压精确的多普勒估计，但我们已经应用了经过验证的人代孕，肺动脉加速时间，估计PA的压力。
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Protocol
1。设备准备
- 检查超声换能器的缺陷。根据所使用的设备上，这一步可能是不必要的。
- 如果气泡被观察到，除去位于右侧的换能器头的螺钉，并且通过用26号针头的孔中添加无菌水。换能器头内的气泡是常见的。他们会阻碍收购质量的图像。
- 检查膜覆盖探测是否有泄漏或孔。必要时进行更换。
- 打开软件并初始化探头。
- 从下拉菜单中选择心脏包，以及适当的换能器。点击“初始化”。使用20-60 MHz探头的老鼠在35 g和a 15-45 MHz探头对小鼠大于35克
- 选择运算符，动物和日期的人口统计数据屏幕上，并选择“启动”。
2。鼠标Preparat离子包括麻醉，脱毛，并定位
- 麻醉方法 ：鼠标放置在感应腔和麻醉用便携式，桌面麻醉含有异氟醚蒸发器和废气容器的机器。
- 汽化器与3升/分钟的氧流量设定为3％。此相对高的麻醉速率是用来实现快速麻醉效果，因此减少应激反应，可能影响心脏功能。该协议的期限短最大限度地减少任何潜在危险的动物。这是非常重要的，以始终保持麻醉速率是相同的。该协议已被优化，专用异氟醚作为麻醉剂，因此对其他药物的最佳条件可能与本协议而有所不同。麻醉的下部深度可被选择，这取决于试验的需要，但是一旦麻醉协议是成立的，不能改变。麻醉会影响心脏速率和行吟诗人ř血流动力学测量。因此，如果麻醉深度的实验过程中发生变化时，数据可能不适合的分析是有用的。如果几个老鼠是在一天内进行成像，麻醉分开他们。
- 监控室内温度，以确保它是实验组之间是相同的。室温下可影响血管反应性，甚至当鼠标在加热的表，所以它应该监测和保持相同，将被比较实验组之间。虽然这个协议并不直接测量动物的温度，恒定的环境和表温度确保有实验组之间几乎没有温度变化。
- 脱毛 ：从胸部用脱毛霜去除头发鼠标被麻醉后。开始应用程序与棉签，在锁骨，并继续到刚好低于隔膜。
- 将小鼠放回麻醉室1分钟使脱毛工作。要确定是否麻醉是有效的，坚决按您的缩略图对鼠标的爪子之一。如果不存在退出，麻醉是足够的。如果肢体撤回，将鼠标放回麻醉室一分钟。
- 取少量润滑软膏鼠标的眼睛，以避免损坏角膜。
- 从胸部取出头发用2×2纱布垫。在脱毛霜使用的化学品具有腐蚀性，并且会伤害皮肤，如果它留太久，所以应注意从皮肤移除所有的产品。
- 适用于皮肤保湿以下脱毛。
- 定位：鼠标放置在一个ventrodorsal位置上加热表设置为37°C。正确的定位是必要的收购质量的图像。使用可捕捉体温，呼吸和心脏速率的表。使用集成的铁路系统的所有OWS进行精确定位，随后，图像优化。
- 轻轻地用胶带了所有四只爪子和应用传导凝胶一角钱大小的量于胸。
3。采集图像：成像在胸骨旁长轴观
- 锁的超声换能器到位的安装内侧的轨道系统上，并且将其旋转10°逆时针，从而使金属探头换能器的直接在心脏放置。更具体地，所述探针应该是在胸部左侧，在第二或第三肋间隙，并横向于胸骨。
- 操纵x和位于铁路系统的y轴，直到获得正确的观点。
- 选择“B模式”。这是在系统控制台的右上部发现，为了项目二维实时图像。
- 查看显示器上的以下解剖结构：
- 从顶点整个心脏到aort一个 - 顶点将会显现在最左边的画面，并在最右边的主动脉。
- 左心室（LV）的内腔
- 左心室后壁（LPW）
- 室间隔（IVS）
- 右心室的内腔（RV）
- 前，后二尖瓣瓣叶（AML与PML）
- 升主动脉（AO）
- 左心房（LA）
- 按扫描/冻结按钮“冻结”的形象获得主动脉的一个直径测量这一观点。然后用鼠标拉回通过视频环路在图像的底部，直到左心室处于收缩期，并且在主动脉是在其最大直径。
- 单击测量工具在屏幕的左上角和选择，看起来像一条对角线的图标。左击鼠标，并从前方画一条直线到主动脉，perpendicula后壁r以它的长轴。保存按“帧存储”按钮。
- 按“日比商店”创建一个视频环路
4， 采集图像：成像在胸骨旁短轴切面
- 重新换能器的3点和9点位置（横向）。角度稍微尾端通过操纵传感器安装，实现了主动脉和左心室腔的最佳观赏。金属探针将被水平，并直接放置在胸骨。
- 操纵的x轴和y轴的轨道系统上，直到获得正确的视图。左心室内腔可以看出，随着前外侧和后内侧乳头肌，这是显示器的右侧可见。这是为短轴的标准参考点，这表明了左心室的中间部分，其中尺寸的测定。稍微从基准点与x轴和y轴，以使不同的解剖结构视图偏离将是必要的，但定位是通过参考上述观点进行说明。
- 获得短轴视图下进行下列测量：
- B模式
- 主动脉的两个直径测量值。
- 三次测量肺动脉流出道。
- 脉冲多普勒模式（PW）
- 主动脉三个速度时间积分测量（VTI）
- 肺动脉三VTI测量测量刚好接近肺动脉瓣。
- 通过跟踪VTI曲线从血液流动开始到峰值速度测量肺动脉加速时间。
- M模式
- 三次测量的左室内径在二中astole（LVIDd比值）
- 三次测量的左室内径的收缩（LVIDs）
- 三次测量右心室内径（RVID）的。右室腔将只显示在该视图中如果扩张。
- 使用M-模式追踪的LV在三个不同的心动周期前壁2舒张峰值之间的距离测量心脏速率的三倍。
- B模式
- B模式测量：
- 从乳头肌视图颅操纵Y轴，直到主动脉半月瓣进入焦点。
- 获得的主动脉刚刚阀上面的测量在最大的直径。
- 点击测量工具，在屏幕的左上角，然后选择看起来像一个斜线的图标。
- 左击鼠标，并从前方画一条直线到主动脉后壁。
- 操纵吨他的x轴和y轴，直到主肺动脉分叉。这个结构将在前方看到的，并在液晶显示屏上主动脉的右侧。
- 操纵y轴尾端直到主肺动脉瓣环映入眼帘。它不会被作为明确定义为主动脉。
- “冻结”的形象，并获得测量在收缩。
- 收集共有三个测量。
- 脉冲波（PW）多普勒测量：PW模式主要用于血液流经动脉和静脉的血流动力学评估。在这个协议中，它会被用于检索主动脉和肺动脉的3速度时间积分的测量。
- 把主动脉回视图如步骤4.3.1，和子弹点1所述。
- 选择“私服模式”。这是位于系统控制台的右上角，并会产生血流的多普勒读数通过主动脉。
- 放置SA投影机的简易体积的正上方的主动脉瓣的电平。在x轴和y轴可能需要稍微调整，以获得足够的多普勒信封。信封应该有白色边框，以及内部中空，表示层的血流量。
- 一旦得到充分的观点是，“冻结”的形象和跟踪多普勒信封的边缘。这将计算VTI。
- 旋转“角度”旋钮位于系统控制台顺时针旋转，直到分段黄线对显示器的右上侧看到的图像在温度为0°。此黄色线表示血流通过血管的方向。由于换能器本身是成角度以这样的方式来产生所述心脏的横截面或横向视图，该线必须被调整到0℃，以配合的血液通过升主动脉的垂直流动。
- 将样品体积近端肺动脉瓣中的中心的水平右室流出道和重复VTI测量方法同上。血液的流动应该出现反转，或血液中相对于显示器上的主动脉的流动相反。
- 把主动脉回视图如步骤4.3.1，和子弹点1所述。
- M模式下测量：M-模式成像提供沿着单个超声波束的组织运动的高时间分辨率，并用于量化腔的尺寸，以及学习瓣膜，心肌，和血管壁的运动。
- 恢复“B模式”和重新定位的换能器获取的“参考视图”（左心室在乳头肌水平的横截面图）。
- 按“M型”。这将产生一个连续的视频源在以下解剖结构的运动将作为“丝带”可见。如果扩张，右室腔内会出现在饲料的顶部是一个非常薄的黑色丝带。室间隔（IVS）将作为正下方的房车不透明的带状可见流明。 LV的管腔将直接看到下面的IVS。它是大黑的空间，占据了大部分的饲料。下面的左心室内腔是LV后壁（LVPW），这将被看作是一个不透明的带状。
- 冻结图像，并根据需要到呼吸不发生点拉回到通过视频环。当鼠标呼吸作用，图像获取被隔膜和胸壁的运动受阻，从而产生所发生与常规频率在饲料中扭曲的“污点”伪影。
- 使用对角线图标获得以下测量：
- 三种测量左室舒张末期内径，其表现为室间隔和左室后壁之间的最大距离。
- 三次测量左室收缩末期维度，它显示为室间隔和左室后壁之间的最短距离。
- 三种测量心脏速率，这是通过单击心脏图标，然后从收缩期峰值测量到的做在左室后壁收缩期峰值。
- 如果RV管腔扩张，取得使用对角线图标三次测量。
- 记录在“B模式”，按“日比商店”按钮，短胸骨旁轴视图的视频循环。
- 进入“文件”，选择“浏览学习”来概括一下你的测量，单击“结束会话”，然后“提交会话数据。”
- 恢复鼠标所概述IACUC协议，并清理。
- 将数据导出为CSV文件到U盘以供后续分析。
- 计算心脏功能（ 表1）的参数如下：
- 左室流出道面积
- 左心室搏出量
- 左心室心输出量
- 短轴缩短率
- 肺动脉区
- 肺动脉加速时间
- 右心室每搏输出量
- 心脏指数
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Representative Results
该协议的主要目标是量化的RV大小和功能，并了解在何种程度上肺血管病变是。无论是鼠标和超声心动图设备适当的准备是必不可少的获得准确和可重复的结果。老鼠应该有自己的胸部脱毛和四肢固定在成像平台用胶带。麻醉，在这种情况下，异氟醚，经鼻锥给药。换能器应该检测的缺陷，特别是气泡，这可能会降低图像质量。获得心脏的优良品质四腔观是相当困难的小鼠所以使用胸骨旁短轴和长轴该协议的重点是房车评估。在这些视图中相应解剖结构示于图1A和1B。
房车的大小最好评估在胸骨旁长轴观，是衡量从游离壁的interventricul的距离使用M模式（ 图2）芳隔膜。该测量只可能当RV被扩张为正常RV是非常小的。在小鼠中，这是不可能精确地测量在人体中诸如面积变化率与三尖瓣环平面收缩漂移右心室功能的通常的度量。这些测量需要右室游离壁这是很难获得的小鼠高品质的看法。但是，在使用脉冲多普勒在右心室流出道（RVOT）和肺动脉的直径的电平来测量速度时间积分（VTI），有可能估计RV每搏输出量（ 图3）。每搏输出量和心输出量是从表1中的公式计算。心脏速率从M型成像获得的。
主扩声直径反映在人10的PAH的严重程度，并且可以在小鼠中测量在胸骨旁短轴观（ 图3）。这是IMportant有主功率放大器的两侧的清晰视图，因为此值的平方来计算心输出量的方程中。如果PA的大小不能被精确地测量，左心室流出道直径和LVOT VTI可以被插入到上面的方程为RV和LV输出等于在无分流的。
房车VTI可以进一步审问估计PA的压力通过测量峰值速度（肺动脉加速时间[PAT]， 图4）的时间。在人类中的PAT被用于二分PA的压力一样高或低11，并且可以被用来估计PA压力时，三尖瓣返流不存在。12
图1。的小鼠解剖，A组超声心动图视图显示了在胸骨旁长轴观正常的解剖结构。面板B显示解剖在胸骨旁短轴切面。右心室扩大在B组。 点击这里查看大图 。
图2。扩张型心肌病右心室的测量。该图展示（ 一 ）普通房车尺寸对照小鼠（B）中的鼠标进行肺动脉环缩模型严重RV增大。 点击这里查看大图 。
图3。测量和右心室每搏输出量的计算，这个数字显示了测量FOR 2均右心室VTI和肺动脉内径。该方法用于计算每搏输出量与这些数据也证实。 点击这里查看大图 。
图4。 PAT。测量肺动脉加速时间是衡量峰值速度在右室流出道VTI的时间。 点击这里查看大图 。
表1：在超声心动图实用计算。
| 尺寸 | 公式 |
| 肺动脉/主动脉瓣区 | π（直径/ 2） |
| 右心室每搏输出量 | PA的面积×VTI |
| 心输出量 | 心脏率×每搏输出量 |
| 心指数 | 心输出量/体表面积 |
| 短轴缩短率 | （左室舒张末期内径 - 左室收缩末期尺寸）/左室舒张末期内径 |
体表面积= 10.5（克）2/3 13
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Discussion
小鼠模型中的疾病，无论是转基因或毒素相关的，需要的表型的验证，该模型实际上是概括了人类疾病它被用于仿真。此验证通常可以通过一个特定特征的存在或不存在来实现，对于肿瘤的例子发展。然而，导致血流动力学异常，如左心室肥厚或我们的转基因PAH的模型主动脉缩窄模型模型更难以验证。这些模型需要血液动力学或工具的任意终端测量到测量无创血流动力学异常和心脏功能。超声心动图是这样的模型非常重要，因为它允许血流动力学和心功能的实时定量分析，而无需患病动物14的牺牲。此外，个别动物可连续成像遵循的疾病或对治疗的反应的自然历史。我们估计，proficienCY右心脏的超声心动图，根据此协议可以执行大约20考试后获得的。
来估计心输出量的超声心动图的能力，也是对肺血管阻力（PVR）在处死时的计算是至关重要的。采用电导导管心输出量的测量是因为房车的小规模往往是不可靠在我们的模型。在处死时，我们测量侵入PA收缩压使用电导导管，并与超声心动图心输出量结合起来，以确定PVR（肺楔压假设为低，被忽略）。这使我们能够进一步量化肺血管疾病在我们的模型中的程度。
超声心动图的理论与实践的局限性
要认识到，超声物理学的应用对人类和牲畜有局限性是很重要的。用多普勒血流速度的精确测量是依赖于相对流动，以声波作用（角度的传感器的目的是）的角度的角度。对于每度这两个角度都是对齐的，血流速度的测量将由COS（θ）15被降低。在临床上，如果两个角是关闭超过20°的测量认为是不可靠的。这对于本协议中的左室流出道和右室流出道VTI测量潜在的重要意义。如果PW的角度不能很好对齐的LVOT RVOT和血液流动的方向，测得的SV和心输出量将是错误的低。
另一个潜在的测量误差是在PA和主动脉区其然后用于计算SV和心输出量的计算。因为圆的面积为πR2，在主动脉或肺动脉的直径的测量不确平方和误差复合。在人类s时，RVOT和LVOT直径来计算的，而不是在主动脉和肺动脉的直径SV，但在小鼠中是很难准确地识别和LVOT RVOT所以我们替换主动脉和肺动脉的区域。提供了相同的技术被用来在一个动物到下一个，这个微小的差别应该不会影响研究结果。
右心室功能不全是在人类肺动脉高压的主要表现形式。一些实际的限制涉及到右侧心脏的无创性评估。在人类和小鼠中，右心室位于相邻于胸壁。此靠近换能器，使成像前的RV游离壁非常困难的。该房车是一个不规则的月牙形状，这就排除像那些用于确定左室大小和功能的体积假设。在小鼠RV的大小通常只能在看到右室游离确定为正常或因难扩大墙。但是，这种分类方法是仍然有帮助验证肺血管疾病的存在或不存在。
超声心动图检查可对小鼠有或无麻醉下进行。我们更倾向于使用麻醉最大化我们的测量的质量和准确性，但认识到麻醉会降低心脏速率。当无麻醉下进行，图像质量可能会受到影响，过程是紧张的，将提升心脏和血压的动物的来源。我们执行与麻醉的相同程度的所有超声心动图，让之间和小鼠中的结果进行比较。
房车和肺血管功能的影响的定量依赖节拍多普勒估测跨肺动脉瓣，右室流出道VTI击败流量。这可以被用来作为一个二分变量（高/低），但是当仔细测量，可作为在小鼠序列测量或差异组间比较erent干预。先进的设备是市售的使用彩色多普勒评估的三尖瓣关闭不全（TR）喷射，用于在人类中进行量化的肺动脉高血压的严重程度的存在和速度。在人类没有可测量的TR喷射，将PAT是用来作为替代，以确定肺动脉高压是否存在或不存在11。 PAT将缩短为PH值恶化，因为房车弹射将停止越早对增加的压力。这种方法也被在PAH大鼠模型验证为肺动脉高压1严重性的准确估计。最后，RVOT VTI包络的形状可以在RV和在人类16肺血管之间耦合光棚。信封的切角是与开槽后肺血管阻力升高表明较高的电阻一致。然而，我们并没有观察到这些模式在小鼠中我们PAH的模型，即使在随后的小鼠合作nfirmed通过侵入式测量有严重的PH值。
除了超声心动图，心脏磁共振成像（CMR）是右心室功能评估中唯一的非侵入性的替代。在大鼠中，CMR提供RV厚度，质量和体积（从而射血分数和心输出量）17的精确测量。此外，CMR测量的PAT和流量 - 时间曲线（类似于VTI）与超声心动图和无创血流动力学测量的强烈关联。尽管取得了一些明显的优势，CMR是更加昂贵和费时比超声心动图检查，并为那些原因在我们的实验中很少使用。据我们所知，没有研究证实这里所描述的侵袭性测量或CMR的超声心动图测量。然而，我们经常使用这个协议来评估疾病外显率和严重程度18-20提出了测量。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 770 High Resolution Micro-Ultrasound System | Visualsonics Inc. | get more info at www.visualsonics.com/products | |
| RMV (Real-Time MicroVisualization) 704B 40 mH Scanhead w/ Encapsulated Transducer | Visualsonics Inc. | get more info at www.visualsonics.com/products | |
| Vevo Integrated Rail System including the Physioogical Monitoring System | Visualsonics Inc. | get more info at www.visualsonics.com/products | |
| Computer Monitor set up for use with the Vevo770 | DELL or other General Supplier | ||
| Computer Mouse set up for use with the Vevo770 | General Supplier | ||
| Vevo770 Cardiac Package Software | Visualsonics Inc. | get more info at www.visualsonics.com/products | |
| VetEquip Portable Tabletop Anesthesia Machine with an Isoflurane Vaporizer | VetEquip | get more info at vetequip.com | |
| Activated Charcoal Waste Gas Containers | VetEquip/Vaporguard | 931401 | get more info at vetequip.com |
| Puralube Eye Ointment | Henry Schein | get more info at henryschein.com | |
| Ecogel 100 Ultrasound Gel | EcoMed Pharmaceuticals | 30GB | get more info at ecomed.com |
| 3M Transpore Tape | Fisher Scientific | 1527-0 | get more info at fishersci.com |
| Small Flathead Screwdriver | General Supplier | ||
| Sterile H2O | DDI H2O from faucet and then autoclave | ||
| 6 in Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | get more info at fishersci.com | |
| Nair (depilatory cream) | General Supplier | ||
| 2 in x 2 in Gauze Sponges | Fisher Scientific | get more info at fishersci.com |
References
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