Summary
Imagiologia de proteínas centrosomal durante Drosophila espermatogénese é um método potente para identificar novas proteínas críticas para a biologia do centrossoma, bem como para elucidar a função particular de jogadores conhecidos neste processo.
Abstract
Centrossomas são conservadas organelos à base de microtúbulos, cuja estrutura e mudança dramaticamente ao longo do ciclo celular e diferenciação de células de função. Centrossomas são essenciais para determinar o eixo de divisão celular durante a mitose e núcleos cílios durante a interfase. A identidade das proteínas que medeiam estas alterações dinâmicas permanece apenas parcialmente conhecida, e a função de muitas das proteínas que têm sido implicados nesses processos é ainda rudimentar. Um trabalho recente mostrou que Drosophila espermatogênese fornece um sistema poderoso para identificar novas proteínas críticas para a função centrosome e formação, bem como para obter insights sobre a função específica de jogadores conhecidos em processos relacionados com o centrossoma. Drosophila é um modelo genético organismo estabelecido onde os mutantes em centrosomal genes podem ser prontamente obtidos e facilmente analisadas. Além disso, os recentes avanços na sensibilidade e resolução de microscopia de luz edesenvolvimento de marcadores centrosomal geneticamente marcadas robustas têm transformado a capacidade de usar testes de Drosophila como um sistema modelo simples e acessível para estudar centrossomas. Este artigo descreve o uso de marcadores centrosomal geneticamente marcadas para executar telas genéticos para novos mutantes centrosomal e para obter insights sobre a função específica de genes recentemente identificados.
Introduction
Testículos de Drosophila são um sistema de órgãos adequados para estudar uma variedade de processos celulares e de desenvolvimento e foram examinados durante os anos 1-9 extensivamente. Este manuscrito centra-se no uso de testículos de Drosophila para estudar o centrossoma, um organelo celular conservada. Tal como noutros sistemas, centrossoma da função de testículos de Drosophila em mitose, meiose, e ciliogênese 10. Centrossomas são compostos por um par de estruturas baseadas em microtúbulos conhecidos como centríolos rodeadas por uma rede complexa de proteínas que se refere ao material que pericentriolar (PCM). O par centríolo é composto de um centríolo mãe mais velha e um centríolo filha mais nova. À medida que a célula progride para a mitose, os dois centríolos separar, duplicar e adquirir uma grande quantidade de PCM para finalmente formar dois centrossomas distintas. O centrossoma contendo o centríolo mãe original é referido como o centrossoma mãe e do centrosome contendo o centriole filha inicial é referido como o centrossoma filha.
Testículos de Drosophila são ideais para estudar a base molecular da biologia do centrossoma por microscopia de fluorescência para uma variedade de razões.
- A maioria das proteínas de Drosophila, que são necessários para a biologia do centrossoma nos testículos são conservadas entre eucariotas, sugerindo que a visão relevantes para a biologia do centrossoma em seres humanos e outras espécies pode ser adquirida através do estudo do centrossoma em Drosophila testículos 1,11-14.
- Realizar análise mutante em Drosophila fornece uma vantagem significativa, já que, ao contrário de muitos outros modelos, as mutações centrosomal em Drosophila não são embrionárias letal, permitindo, assim, a análise genética clássica da função centrosome. Esta característica única de Drosophila é devido à presença de contribuição materna que persiste durante as fases críticas do desen embrionáriovolvimento. 1,11-14. Assim, pode-se a) mutações de estudo que eliminam completamente formação centrosome e b) estudar o destino de um centrossoma normal que foi formado no embrião por contribuição materna em um contexto mutante após a contribuição materna foi esgotado (o princípio do método é descrita em 11).
- Transgenes funcionais com marcas fluorescentes geneticamente codificados que rotulam o centrossoma estão disponíveis. Muitas dessas linhas de usar o próprio promotor da proteína para conduzir a transcrição do transgene, a fim de evitar a forte sobre-expressão. Isto é particularmente importante, porque a sobre-expressão das proteínas, muitas vezes resulta em produtos manufacturados que interferem com a análise da função centrossoma 1,11.
- O centríolo e centrosome são excepcionalmente longa em todo Drosophila espermatogênese, permitindo assim uma análise rápida e fácil do centrossoma por imagem.
- Etapas consecutivas na espermatogênese e centrosome biology são organizadas por ordem cronológica ao longo dos testículos, começando na ponta testículo com os centrossomas de células estaminais do esperma e que termina na parte inferior dos testículos com tamanho reduzido do centrossoma e na actividade de células de esperma maduros (Figuras 1 e 2). Isso permite uma fácil identificação e análise da função centrossoma durante as diferentes fases de desenvolvimento do esperma.
- Testes são facilmente dissecada a partir de larvas macho, pupas e adultos 27.
- Durante a espermatogênese, o centrossoma e seus centríolos proceder através de composição múltipla, estrutural e estados funcionais para funcionar na mitose, meiose e formação cílio. Durante estes processos, as monta centrossoma, duplicatas, migra, âncoras para partes específicas da célula, amadurece, se divide e cria um cílio. Além disso, o centriole do spermatid madura dá origem a um precursor centriolar chamado o PCL 1. Também no spermatid maduro, o centrossoma passa por um processo called redução centrosome em que ele perde muitos componentes do PCM eo centríolo (Figuras 1 e 2). Assim, os estudos nos testículos permitem abordar vários aspectos da vida, tais como a retenção de centrosome centrosome nas células-tronco, a duplicação centríolo, estabilidade centríolo, alongamento centríolo, separação centríolo e segregação, recrutamento PCM, ciliogênese, formação de PCL, a redução centrosome e nucleação de microtúbulos astral entre outros.
- Finalmente, os estudos de biologia centrosome são ajudados por outras características bem conhecidas de Drosophila que fizeram dele um organismo modelo preferido para estudos biológicos. Estes incluem um curto tempo de geração, a facilidade de genética, assim como a mutagénese aleatória e dirigida para o local.
Em conjunto, as características acima indicadas de Drosophila testículos fornece um modelo em que o centrossoma pode ser estudada por imagem de fácil, rápida, e detalhado. As técnicas descritasneste trabalho foram aplicados para investigar vários aspectos da biologia centrosome incluindo formação centríolo 11, a duplicação centríolo 15, o recrutamento PCM 16, regulamentação centrosome 17 e ciliogênese 18. Estas técnicas também foram aplicados ao estudo do centrossoma em outras áreas da biologia tais como a regulação da meiose 19, a montagem do eixo 20, e a actividade do centrossoma na divisão de células estaminais assimétrica 21, entre muitos outros.
Imagem de testículos nos centrossoma começa com a obtenção de moscas que expressam proteínas centrosomal geneticamente marcadas e isolar os testículos de larvas macho, pupas, ou moscas adultas. Estas moscas são disponíveis a partir de vários grupos de investigação 1,11,15,22-25. Os testículos conter todas as fases larvares de espermatogénese antes da meiose e são úteis na análise de mutações que são letais em pupa ou adulto. No entanto, pupa Tarde ou jovens adult testículos são as mais robustas e contêm todos os pré e pós-meióticas estágios da espermatogênese, tornando-os preferíveis para análise. Uma vez que o número de células de esperma diminui com o envelhecimento da mosca, a utilização de testículos adulto também é apropriado para o estudo do centrossoma no contexto de envelhecimento 26.. Um método de isolamento de testículo de moscas adultas foi anteriormente descrito 27.
Imagem de centrossomas e sua função em testes de Drosophila pode ser alcançado através de três linhas interligadas que estão aqui (Figura 3) apresentados. Selecção de faixa que é a mais adequada depende da natureza da questão do investigador está a tratar.
A trilha envolve imagem dos testículos ao vivo. É o mais rápida das três faixas, mas só pode ser aplicada quando a amostra não necessita ser preservada e imunocoloração quando não é necessária. Na faixa A, testículos são montados (intacta, perfurado ou corte) em lâminase cuidadosamente esmagados sob uma lamela de modo a formar uma única camada de células, facilmente identificáveis. As células são então visualizadas usando microscopia de contraste de fase e microscopia de fluorescência. A utilização de contraste de fase é particularmente importante para a análise de testículos de Drosophila, porque revela informação celular que não é visível com outras formas de iluminação transmitida e, portanto, permite a rápida identificação de várias fases de desenvolvimento do esperma 28,29. No entanto, a faixa A tem duas desvantagens principais. Em primeiro lugar, a integridade morfológica das células é frequentemente comprometida uma vez que os testículos são rompidas. Em segundo lugar, as células não fixadas às vezes se mover dentro da amostra, fazendo com que a imagem de múltiplas camadas confocal dentro de uma região especificada difícil. Para promover a análise dos tipos de células específicas, testículos pode ser perfurada ou cortada, a fim de orientar o modo como as rupturas de testículos de modo que sob o esmagamento minimamente lamela afecta a morfologia do tipo celular de interesse.
Pista B envolve a fixação química dos testículos. Esta pista requer uma quantidade intermédia de tempo para a preparação de amostras e tem a vantagem de que as amostras fixadas podem ser guardados para posterior análise. Além disso, a fixação serve para fazer as estruturas celulares mais rígidas, minimizando o movimento do espécime durante o exame. No entanto, a microscopia de contraste de fase torna-se muito menos informativa após a fixação química, tornando algumas fases de desenvolvimento difícil identificar esperma.
Pista C é a mais demorada, mas tem a vantagem adicional de que as estruturas celulares são fixas e imunocoradas, permitindo a visualização de proteínas que não estão disponíveis com as marcas genéticas adequadas. Há muitos anticorpos disponíveis comercialmente e de vários grupos de pesquisa para imunomarcação centrossomas e estruturas relacionadas com centrossoma em testículos de Drosophila.
Protocol
1. Pista A. Preparação de Testes ao vivo
- Prepare PBS dissolvendo 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4 em 800 ml de água destilada e ajustar o pH para 7,4. Levar o volume a 1 litro e esterilizar por autoclavagem.
- Isolar testículos como previamente descrito 27.
- Preparar tampão de coloração DAPI por diluição de 1 mg / ml a 1 ug / ml em PBS. Use a folha de alumínio para proteger o tubo de luz e armazenar a -20 ° C.
- Após o isolamento dos testículos, mergulhar a amostra em 6 ul de tampão de coloração DAPI no topo de uma lâmina de microscópio de vidro carregadas positivamente durante 10 min. Testículos aderem bem a lâminas disponíveis comercialmente carregados positivamente, permitindo a fácil manipulação do espécime. Lâminas positivamente carregadas são covalentemente modificada para conferir uma carga positiva estática à superfície do vidro. Semelhante ao revestimento polilisina, isso promove a interação do wi testículosª a superfície da lâmina.
- Lavar o excesso de DAPI, substituindo o tampão de coloração duas vezes com 6 mL de PBS. Use um pedaço de papel de filtro para afastar o buffer depois de cada etapa de lavagem. Tenha cuidado para não remover acidentalmente os testículos, juntamente com o tampão durante cada lavagem.
- Adicionar 6 ul de PBS para o espécime. A quantidade de tampão utilizado deve ser ajustado para o tamanho da lamela. Os volumes fornecidos neste protocolo são para uma lamela mm 18 x 18. Opcional: É aconselhável para perfurar os testículos perto da localização relativa do tipo de células de interesse. Isto vai garantir que haja uma pressão mínima sobre essas células, durante o passo de esmagamento, mantendo assim a sua integridade estrutural. Perfuração dos testículos pode ser realizada utilizando um bisturi afiado limpo.
- Com cuidado, coloque uma lamela em cima do espécime.
- Selar as bordas da lamínula usando unha polonês claro para garantir que o buffer não evapora a partir dos espécimes vivos, enquanto imenvelhecimento.
- Usar um marcador para indicar a posição dos testículos para facilidade em colocar a amostra sobre a lâmina e proceder à imagiologia.
- Lavar o excesso de tampão de coloração DAPI, substituindo o tampão por duas vezes com 6 mL de PBS. Use um pedaço de papel de filtro para afastar o buffer depois de cada etapa de lavagem. Tenha cuidado para não remover acidentalmente a amostra juntamente com o tampão durante cada lavagem.
2. Faixa B. Preparação de Testes Fixos
- Preparar tampão Fix por diluição de solução stock de formaldeído a 37% em PBS para uma concentração final de 3,7% de formaldeído em PBS 1x
- Preparar tampão de coloração DAPI diluindo estoque de 1 mg / ml de DAPI e 1 mg / ml em PBS.
- Mergulhar os testículos numa queda de 6 ul de PBS no topo de uma lâmina de microscópio de vidro carregadas positivamente.
- Orientar manualmente os testículos de forma linear ou como de outro modo preferido.
- Use um pedaço de papel de filtro para afastar o PBS e substituí-lo com 6 mL de Fixtampão por 5 min.
- Use um pedaço de papel de filtro para afastar o buffer Fix e mergulhar a amostra em 6 mL de tampão de coloração DAPI para 10 min.
- Com cuidado, coloque uma lamela mm 18 x 18 em cima do espécime.
- Selar as bordas da lamínula usando unha polonês claro para garantir que o buffer não evapora a partir da amostra, enquanto imagem.
- Usar um marcador para indicar a posição dos testículos para facilidade em colocar a amostra sobre a lâmina e proceder à imagiologia.
3. Pista C. Preparação de histoquímica Testículos
Siliconização lamela: mergulhar múltiplos 18 x 18 mm em lamelas de um pequeno tabuleiro que contém a solução com silicone e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente numa hotte. Certifique-se de que as lamelas são totalmente exposta e não são empilhadas em cima umas das outras.
- Coloque a amostra em uma queda mL 5 de PBS na lamela siliconizada. Oriente otestículos se for o caso e furar os testículos com um bisturi afiada. Delicadamente, coloque uma lâmina de vidro carregada positivamente sobre a lamela, permitindo que o PBS para se tornar uniformemente dispersas entre as lamelas e slide. Use um pequeno pedaço de papel de filtro para afastar o excesso de tampão entre a lamela e slide. Como o tampão é removido por o papel de filtro, o aumento da pressão vai esmagar os testículos. Muitas amostras devem ser preparadas simultaneamente, como alguns podem ser perdidos ou danificados ao longo do protocolo. Um gravador de vidro pode ser utilizado para rotular os slides se diferentes tipos de amostras vai ser preparados em simultâneo.
- Lava-se a lamelas 3x durante 1 min cada, em água, seguido de 3x durante 1 min cada, em etanol a 70%, e uma lavagem final durante 1 min em água. Permitir as lamelas siliconizadas secarem naturalmente sob uma coifa.
- Solte os slides em nitrogênio líquido e permitir que a amostra para congelar por 5-10 min.
- Remova os slides da liquid nitrogênio usando um grande fórceps. Use um bisturi para remover rapidamente a lamela. A amostra deve permanecer no slide. Tenha cuidado para não manchar a amostra durante este processo, deslizando as lamelas ao longo do slide.
- Incubar as lâminas em metanol prechilled em uma coloração jarra de Coplin de vidro a -20 ° C por 15 min.
- Transferir as lâminas para uma tina de coloração Coplin vidro contendo acetona pré-arrefecida a -20 ° C durante 30 seg.
- Lavar as lâminas durante 1 min em PBS, à temperatura ambiente, utilizando uma coloração frasco Coplin vidro.
- Prepare PBST-B, completando PBS com 0,1% de Triton-X100 a 1% Albumina de Soro Bovino (BSA). 5% de soro normal, a partir das mesmas espécies de hospedeiros como o anticorpo secundário (a partir do passo 3.14) pode ser usado em vez de BSA para reduzir o ruído de fundo produzido a partir do anticorpo secundário a ligação não especifica.
- Incubar as lâminas durante 10 min em PBST-B em um frasco de vidro para coloração Coplin para bloquear sites inespecíficas.
- Encha as cavidadesa câmara de umidade com água. Humidade no interior da câmara irá minimizar a evaporação de soluções de anticorpos a partir da amostra durante os passos de incubação.
- Prepare PBST-BR, completando PBST-B com 100 ug / ml de RNase A. RNase A degrada o ARN na amostra, e também serve como um agente bloqueador adicional, absorvendo fortemente à superfície do vidro.
- Coloque um pedaço de aproximadamente 1x1 cm de Parafilm no topo da amostra de espalhar uniformemente a solução de anticorpos e proteger a solução de anticorpo a partir de evaporação. Fechar a câmara de humidade e incubar a amostra com o anticorpo primário durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Retire os slides de PBST-B. Utilizar um pedaço de papel de filtro para secar a superfície da lâmina em torno do espécime, utilizando-se o cuidado de não secar a própria amostra. Finalmente, coloque o slide na câmara de umidade com o modelo voltado para cima
- Adicionar cuidadosamente 100 ul do anticorpo primário diluído em PBST-BR na parte superior da especificaçãoImen (1:200 é geralmente uma boa concentração de partida para anticorpos descaracterizados).
- Cobrir as amostras com um a cerca de 1 x 1 cm pedaço de Parafilm e fechar a câmara de humidade. Incubar a amostra com o anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente.
- Abra a câmara de umidade e utilize uma pinça para remover suavemente a Parafilm do slide. Incubar as lâminas durante 5 min em PBST num frasco Coplin coloração de vidro à temperatura ambiente para lavar. Repetir este processo por um total de três lavagens.
- Retire os slides de PBST-B e colocá-los na câmara de umidade com o modelo voltado para cima. Adicionar cuidadosamente 100 ml de anticorpo secundário diluído em PBST-BR na parte superior do espécimen.
- Abra a câmara de umidade e utilize uma pinça para remover suavemente a Parafilm do slide. Mais uma vez, lava-se a amostra 3x durante 5 min cada em PBST num frasco Coplin coloração de vidro seguido de 3x durante 5 minutos cada em PBS.
- Use um Kimwipe e papel de filtro para cuidadosamente secar a superfície da lâmina, tendo o cuidado para evitar tocar ou a secagem da amostra.
- Adicionar 6 mL de meio de montagem de amostras, cobrir com uma lamela limpo (não revestido com silicone), eo selo bordas com unha polonês.
- Usar um marcador para indicar a posição dos testículos para facilidade em colocar a amostra sobre a lâmina e proceder à imagiologia.
4. Notas de imagem
Imagem pode ser alcançado através de um microscópio de luz comum vertical ou invertido ou microscópio confocal. É importante que o microscópio está equipado com contraste de fase, especialmente para a imagiologia de amostras testiculares vivos (faixa A). Este recurso tornou-se recentemente disponível em microscopia confocal.
Quando os testículos quebrar espontaneamente (Track A), a ponta (caule região da célula) é normalmente mantida intacta e é facilmente identificável, proporcionando um bom marcador para localizar e utilizar inicialmente para a orientação.
_content "> Centríolos são bastante pequenas estruturas e as imagens devem ser tiradas com 63X ou 100X objetivos, um fator de zoom de 4-6X, e uma resolução de pelo menos 512 x 512 pixels, quando possível.Representative Results
Centrossomas sofrer várias transformações morfológicas e funcionais ao longo da espermatogénese. Esta característica faz com que a espermatogénese de testículos de um sistema útil para estudar diferentes aspectos da biologia do centrossoma. Um tal processo é facilmente observado alongamento centrossoma. Em espermatogónios, o marcador centriolar ANA1-GFP marca a 0,6 um longo centriole (Figura 4a). Este centríolo alonga durante a espermatogênese e atinge um comprimento de 2,5 mM de espermátides quase maduros. Desde centríolos em Drosophila esperma são excepcionalmente longa, a imagem pode ser usada para fazer declarações quantitativos sobre alongamento centrosome (Figura 4b). Análise de comprimento centriole também pode ser realizada em um fundo mutante e vários mutantes foram identificadas que alteram o crescimento centriole (Figura 5). Exemplos são sempre cedo (ALY) e bala de canhão (CAN), mutações que arrest espermatogênese antes do início da meiose 30, mas não bloqueiam centríolo alongamento. Nestes mutantes, centríolos do espermatócitos madura crescer até cerca de ~ 2,4 mM, em comparação com células de controlo de centríolos que atingem um máximo de 1,8 um.
Figura 1. Espermatogênese e Biologia centrossoma. A) Desenvolvimento de Células Estaminais e espermatogônias. Todas as células de esperma têm origem a partir de células-tronco encontradas na extremidade apical dos testículos. Cada célula-tronco se divide assimetricamente para formar uma célula-tronco que herda a centrosome mãe e um spermatogonium progenitor que herda a centrosome filha 31. Como forma de espermatogônias, tornam-se rodeado por 2 células cisto, que continuam a cercar os espermatócitos e espermátides em todo espermatogênese. As espermatogônias dividem 4 vezes para produzir 16 espermatogônias, cada um contendo dois centríolos. B) Desenvolvimento de espermatócitos e meiose. Durante o desenvolvimento de espermatócitos, centríolos duplicar mais uma vez para gerar quatro centrioles organizadas em dois pares por célula e 64 centrioles por cisto. Cedo durante o desenvolvimento de espermatócitos, cada centriole move-se para a membrana plasmática, docas para ele, e alonga-se para formar uma estrutura que se assemelha a um cílio primário 18,32-34. Em maduros de espermatócitos, comprimento centriole atinge ~ 1,8 mM. Os centrossomas desempenham um papel essencial na meiose. Durante a meiose I, os pares de centríolos que ainda estão ligados ao movimento da membrana plasmática para o centro da célula e criar invaginações da membrana celular em sua ponta distal. O PCM em torno dos centríolos cresce, nucleia microtúbulos astrais, e colocaliza com o pólo do fuso. Durante a transição para a meiose II, a dupla centríolo separa de modo que apenas um único centríolo é apresent em cada pólo do fuso. C) A espermiogênese. No final da meiose II, o mais cedo redondo spermatid tem um único centriole ligada à membrana plasmática invaginada. Uma grande derivado mitocondrial rodada é encontrado perto do núcleo e mais tarde começa a se alongar ao longo do crescente axonema em posteriores espermátides arredondadas. Durante a espermatogénese, as formas axonema e se alonga no interior do citoplasma. Além disso, uma nova estrutura centriolar conhecido como o PCL (Proximal Centríolo Like) aparece perto do centríolo preexistente 1. No final da espermatogénese, células que partilham uma cisto comum separar um do outro para se tornar espermatozóides móveis totalmente madura. Os diagramas de desenvolvimento espermatócito (B) e espermiogênese (C) representam apenas uma célula dos 16 espermatócitos e 64 Espermátides, respectivamente por cisto e não retratam as células do cisto. Clique aqui para ver grandefigura r.
Figura 2. Os testículos Drosophila. Uma sobreposição de um de contraste de fase e fluorescência da GFP micrografia de um testículo todo-mount expressando o marcador pan-centriolar Ana-1-GFP. Área distinta correspondente aos painéis 1-3 da Figura 1 são separados por uma linha vermelha tracejada A) Células-Tronco e espermatogônias, B) espermatócitos e meiose, C) espermiogênese.
Figura 3. Faixas Para geração de imagens centrossomas em Drosophila testículos.
Figura 4. Centrossoma Alongamento durante a espermatogênese. A) Cada etapa mostra uma imagem de contraste de fase (à esquerda), imagem de fluorescência (meio), e uma imagem ampliada do centrossoma (direita). A imagem de contraste de fase demonstra a fase particular de célula com base na posição e na morfologia da célula, núcleo, nucléolos, e as mitocôndrias. A imagem de fluorescência mostra DNA corado com DAPI (azul). A imagem mostra centrosome centrossomas rotulados por Asterless-GFP (Asl, top imagens) e ANA1-GFP (ANA1, imagem inferior). Um círculo branco destaca a membrana celular em ambas as imagens de contraste de fase e fluorescência. Os círculos brancos tracejadas e o círculo cinzento na imagem de fluorescência destacar a posição do núcleo e o nucléolo, respectivamente. Seta aponta amarelos para o Y-cromoalguns laços. Tracejado vermelho círculos marcam as mitocôndrias. Estágios 1-6 refere-se a 29 e encena 13-17 refere-se à descrição de estágios celulares em 32. Fase 1: Primário espermatócito. Identificado como uma pequena célula de uma dica do testículo. Etapa 2a: Polar espermatócito. Identificados pela presença de um tampão de mitocôndria de um lado do núcleo. Fase 3: Apolar espermatócito. Identificada pelo seu tamanho relativamente maior que os espermatócitos primários e falta de uma tampa de mitocôndrias. Estágio 4: Primário espermatócito. Identificado pelo aparecimento de tudo: Todos os 3 ciclos do cromossomo Y. Etapa 5: Mature primária espermatócito. Espermatócitos maior produzido na espermatogénese, identificado por um aumento adicional no tamanho do núcleo. Estágio 6: premeióticas primária espermatócito. Laços do cromossomo Y se desintegrar eo núcleo desaparece. Etapa 13: Cebola Stage spermatid. Células redondas contendo núcleo de tamanho igual e mitocôndrias. Etapa 17: spermatid Tarde. Identificado como um espermátide alongada que continua a fazer parte de um Bundle de 64 espermatídeos com núcleos encontrados perto da base dos testículos., núcleos são ligeiramente mais largas do que espermatídeos maduras encontradas na vesícula seminal. As barras de escala, 10 mM e 1 mM. B) Gráfico apresenta média e desvio padrão para cada fase medida pelo Asterless-GFP (azul) e ANA1-GFP (verde). No estágio 6, (verde) médias e desvios-padrão Asterless-GFP (azul) e ANA1-GFP se sobrepõem e apenas Asterless-GFP (azul) pode ser apreciado. A partir de Stage 13, Asterless-GFP não decorar todo o centríolo e as medições não foram determinados (ND).
Figura 5. Anormalmente longo Centríolos na fase 6 espermatócitos de aly e pode mutantes. AC) micrografia Luz de testículos inteiros e painel fluorescente do representante centrosome labeled por ANA1-GFP. Observe a forma anormal dos testículos em aly e pode mutantes, o que resulta de uma falta de espermátides como consequência da prisão meiótica. D) Gráfico apresenta média, desvio padrão e distribuição de dados de comprimento centríolo no tipo selvagem, aly e pode . Número de amostras para cada ponto de dados está entre parênteses. Barra de escala, 1 mícron.
Discussion
Estudar biologia centrosome nos testículos mosca utilizando marcadores centrosomal geneticamente marcadas é um método útil para avaliar a função ea atividade centrosome tanto em um contexto do tipo selvagem e mutante. Em particular, A faixa é adequado para a triagem rápida de anormalidades centrosomal como malformação, misegregation, instabilidade, ou comprimento anormal num esforço para identificar novos mutantes. Além disso, os cílios spermatid em preparações vivas conservaram a mobilidade durante cerca de 15 minutos após a dissecção eo uso de testes ao vivo Rastrear A também permite a mobilidade do esperma para ser facilmente tratadas. Uma vez que a actividade de esperma cílios móveis está directamente relacionada com a função do centrossoma, os ensaios podem ser realizados para determinar os efeitos de diferentes mutações centrosomal sobre a função ciliar. Pista B pode ser utilizado para a observação mais específicos, especialmente quando os dados estatísticos são exigidos, tais como para a contagem do número de centríolos por célula e ou o número de células por cisto. Pista C é mais useful para observações detalhadas que exigem coloração com anticorpos. Exemplos incluem marcação de um tipo particular de células, tais como células estaminais, a coloração de uma proteína que não possui uma marca disponíveis, tais como a tubulina acetilada, ou para verificar a ausência ou mislocalization de uma proteína num mutante.
Quando imagiologia centrossomas e estruturas relacionadas com o centrossoma, utilizando marcadores geneticamente marcados em vez de anticorpos não é apenas experimentalmente mais fácil, mas também fornece resultados mais robustos e reprodutíveis. Portanto, a utilização de proteínas centrosomal geneticamente marcadas é uma abordagem fiável para análises mecanicistas e quantitativos que requerem um grande conjunto de dados. Por exemplo, o uso de marcadores centrosomal geneticamente marcadas tem sido particularmente útil para a quantificação de comprimento de centríolos. Tal análise revelou que várias mutações podem ser classificados em duas categorias com base na variabilidade de comprimento de centríolos. Uma categoria inclui as mutações que change comprimento centriole, mas não afectam o desvio padrão 1 e a outra categoria inclui as mutações que afectam tanto comprimento centriole e o desvio padrão de comprimento 11. Esses dados quantitativos podem fornecer informações úteis para a função de determinados genes centrosomal. Os mutantes que exibem Centrosomal comprimento centriole defeituoso com um aumento no desvio padrão pode ser devido a uma desestabilização da estrutura centriolar. No entanto, o comprimento de centríolos defeituoso com um erro padrão normal pode indicar que a mutação não estruturalmente desestabilizar o centriole e é mais provável que seja devida a uma mudança no mecanismo de controlo do comprimento do regulador de centríolos. Devido a inconsistências na imunocoloração, as análises quantitativas são difíceis com o uso de marcadores de anticorpos sozinhos.
O centrossoma é uma estrutura proteica grande, complexo e muitas de suas proteínas são encontradas apenas dentro de seu interior. Usando centrosomal geneticamente marcadomarcadores, em vez dos anticorpos permite rotular consistentemente componentes internos do centrossoma cujos epítopos podem ser de outro modo inacessíveis para marcadores de anticorpos. Por exemplo, estudos de localização de BLD10 utilizando anticorpos encontra a proteína a ser enriquecida nas extremidades proximal e distal do centriole 13, enquanto BLD10-GFP mostra uma distribuição mais uniforme 1. No entanto, é também importante considerar o nível de expressão de uma proteína geneticamente marcado particular, como esta pode afectar a distribuição da proteína. A localização de Sas-4-GFP e SAS-6-GFP expressa sob a sua endógena é restrita às extremidades proximais dos centríolos 1,16,35 Por outro lado, Sas-4-GFP e SAS-6-GFP expressa sob a forte promotor de ubiquitina estão localizadas ao longo de todo o comprimento do centriole 12,14. Outra consideração importante é o efeito da marcação genética na função da proteína. Analisando se as proteínas geneticamente marcadas são funcionais pode ser tested através da introdução da proteína transgénica para um fundo mutante e examinando se a proteína transgénica resgata o fenótipo mutante.
Fixação de testículos de Drosophila pode ser realizada utilizando uma variedade de fixadores químicos. Aqui, descrevemos a fixação tanto com formaldeído (Faixa B) e metanol-acetona (Faixa C). No entanto, tanto o fixador pode ser utilizado de forma intercambiável e uma vez que vários fixadores podem perturbar quimicamente epítopos de anticorpos nativos, a selecção do fixador apropriada para imunocoloração deve ser determinada experimentalmente. Os seguintes fixadores e as condições de incubação são geralmente utilizadas: 3,7% de formaldeído, 5 min a temperatura ambiente, o metanol, 15 min a -20 ° C; acetona, 10 min a -20 ° C, metanol, 15 min a -20 ° C. seguido de acetona, 30 seg a -20 ° C; etanol, 20 min a -20 ° C. Embora a fixação com acetona, metanol, etanol e não requerem um passo de permeabilização estendida para a imunocoloração, wi fixaçãoth formaldeído deve ser seguido por uma incubação de 1 h em PBST-B à temperatura ambiente, para permeabilizar as membranas celulares e permitir o acesso do anticorpo a epítopos intracelulares. Além disso, certos agentes fixadores são mais adequados para antigénios específicos. Por exemplo, as funções de formaldeído também para a fixação de pequenas proteínas, enquanto metanol e acetona são bem adaptados para a fixação de grandes complexos moleculares 36.
A imunocoloração de Drosophila testículos foi previamente descrito para a observação de estruturas de cromatina e o citoesqueleto de microtúbulos 29,37. Aqui (Faixa C), o procedimento foi otimizado para a análise de estruturas centrosomal contendo proteínas geneticamente marcados. Nós fornecemos uma descrição detalhada deste procedimento para orientar as pessoas que são inexperientes em trabalhar em testículos de Drosophila. Este procedimento também inclui modificações para melhorar a conservação e morfologia dos testículos, como por exemplo, utilizando siliconized lamelas e lâminas de vidro com carga positiva.
Disclosures
O acesso gratuito a esta publicação foi apoiada pela Leica Microsystems.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (R01GM098394) do NIH e do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais, bem como concessão de 1.121.176 National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
| Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
| 37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| 18x18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
| Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
| Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
| Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |
References
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