Summary
Imaging av centrosomal proteiner under Drosophila spermatogenesen är en kraftfull metod för att identifiera nya proteiner kritiska för centro biologi samt att belysa den särskilda funktion av kända aktörer i denna process.
Abstract
Centrosomes bevaras mikrotubuli-baserade organeller, vars struktur och funktionsförändringar dramatiskt under hela cellcykeln och celldifferentiering. Centrosomes är viktigt att bestämma celldelning axeln under mitos och att kärn cilier under interfas. Identiteten av de proteiner som medierar dessa dynamiska förändringar förblir endast delvis kända, och funktionen hos många av de proteiner som har varit inblandade i dessa processer är fortfarande rudimentära. Senaste arbete har visat att Drosophila spermatogenesen ger ett kraftfullt system för att identifiera nya proteiner kritiska för centro funktion och bildning samt att få insikt i den särskilda funktion av kända spelare i centrorelaterade processer. Drosophila är en etablerad genetisk modellorganism där mutanter i centrosomal gener kan lätt erhållas och enkelt analyseras. Vidare, de senaste framstegen inom den känslighet och upplösning av ljusmikroskop ochutveckling av robusta genetiskt taggade centrosomal markörer har förändrat möjligheten att använda Drosophila testiklar som ett enkelt och tillgängligt modellsystem för att studera centrosomes. Detta dokument beskriver användningen av genetiskt-taggade centrosomal markörer för att utföra genetiska skärmar för nya centrosomal mutanter och att få insikt i den specifika funktion av nyligen identifierade gener.
Introduction
Drosophila testiklar är ett lämpligt organ för att studera en mängd olika cellulära och utvecklingsprocesser och har granskats mycket under åren 1-9. Detta manuskript fokuserar på användning av Drosophila testiklar att studera centro, en konserverad cellorganell. Som i andra system, centrosome av Drosophila testiklar funktion i mitos, meios och ciliogenesis 10. Centrosomes är sammansatta av ett par av mikrotubuli-baserade strukturer som kallas centrioler omgivna av ett komplext protein nätverk kallat pericentriolar material (PCM). Den centriole paret består av en äldre mor centriole och en yngre dotter centriole. Eftersom cellen fortskrider mot mitos, båda centrioler separat, duplicera, och skaffa en stor mängd PCM för att slutligen bilda två distinkta centrosomes. Den centro innehåller den ursprungliga moder centriole kallas modercentro och centrOsome innehåller den ursprungliga dottern centriole kallas dottern centro.
Drosophila testiklarna är idealiska för att studera den molekylära grunden för centro biologi genom fluorescensmikroskopi för en rad olika skäl.
- De flesta av de Drosophila proteiner som krävs för centro biologi i testiklarna är konserverade bland eukaryoter, vilket tyder på att insikten relevant för centro biologin hos människor och andra arter kan vinnas genom att studera centro i Drosophila testiklar 1,11-14.
- Utföra mutant analys i Drosophila ger en betydande fördel eftersom, till skillnad från många andra modeller, centrosomal mutationer i Drosophila inte embryonala dödliga, vilket möjliggör för klassisk genetisk analys av centro funktion. Denna unika egenskap hos Drosophila är beroende på närvaron av maternell bidrag som kvarstår under de kritiska stadierna av embryonal utveckngen. 1,11-14. Således kan man a) studie mutationer som helt eliminerar centrobildning och b) studera öde en normal centro som bildades i det tidiga embryot genom moderns bidrag i en mutant sammanhang efter moderns bidrag har utarmat (principen för metoden finns beskriven i 11).
- Funktionella transgener med genetiskt kodade fluorescerande taggar som märka den centro finns tillgängliga. Många av dessa linjer använder proteinets egen promotor för att driva transkription av transgenen för att förhindra stark överuttryck. Detta är särskilt viktigt eftersom överuttryck av proteiner resulterar ofta i artefakter som stör analysen av centro funktion 1,11.
- Den centriole och centro är unikt långa hela Drosophila spermatogenes, vilket möjliggör snabb och enkel analys av centro genom avbildning.
- På varandra följande steg i spermatogenes och centro biology är organiserade kronologiskt längs testiklarna, med början vid testiklarna spetsen med centrosomes av sperma stamceller och slutar längst ner i testiklarna med nedsatt centro storlek och aktivitet i mogna sädesceller (figur 1 och 2). Detta gör det möjligt för enkel identifiering och analys av centro funktion under olika utvecklingsstadier spermier.
- Testiklar lätt dissekeras från manliga larver, puppor och vuxna 27.
- Under spermatogenes, den centro och dess centrioler går genom flera sammansättning, strukturella och funktionella stater att fungera i mitos, meios, och cilium bildning. Under dessa processer, de centro monterar, dubbletter, migrerar, ankare till specifika delar av cellen, mognar, klyftor, och skapar en cilium. Vidare centriole av det mogna spermatid ger upphov till en centriolar prekursor namnges PCL 1. Även i mogna spermatid genomgår centro en process called centro minskning varigenom den förlorar många komponenter av PCM och centriole (figurerna 1 och 2). Således, studier i testiklarna tillåter en att ta upp flera aspekter av centro liv såsom centroansamling i stamceller, centriole dubbelarbete, centriole stabilitet, centriole töjning, centriole separation och segregation, PCM rekrytering, ciliogenesis, PCL-formation, centro minskning, och astrala mikrotubuli kämbildning bland andra.
- Slutligen är studier av centro biologi med hjälp av de andra välkända egenskaper hos Drosophila som har gjort det ett föredraget modellorganism för biologiska studier. Dessa inkluderar en kort generationstid, lätthet att genetik, liksom slumpmässig och riktad mutagenes.
Tillsammans, de ovan angivna egenskaperna hos Drosophila testiklar ger en modell där centro kan studeras genom enkel, snabb och detaljerad avbildning. De tekniker som beskrivsi denna uppsats har tillämpats för att undersöka många aspekter av centro biologi inklusive centriole formation 11, centriole dubbel 15, PCM rekrytering 16, centro reglering 17, och ciliogenesis 18. Dessa tekniker har också använts för att studera den centro i andra områden av biologin, t.ex. meiotisk reglering 19, spindelenheten 20, och centro aktivitet i asymmetrisk stamcells division 21 bland många andra.
Imaging av testiklarna i centro börjar med att få flugor som uttrycker genetiskt-märkta centrosomal proteiner och isolera testiklarna från manliga larver, puppor eller vuxna flugor. Dessa flugor är tillgängliga från flera forskargrupper 1,11,15,22-25. Larv Testiklarna innehåller alla stadier av spermatogenesen före meios och är användbara när man analyserar mutationer som är dödlig i puppa eller en vuxen. Men sen pupal eller unga adult testiklarna är den mest stabila och innehåller alla pre-och post-meiotiska stadier av spermatogenesen, vilket gör dem bättre för analys. Eftersom antalet sädesceller minskar när gylf åldrar, är också lämpligt för att studera den centro i samband med åldrande. 26 användningen av vuxen testiklarna. Förfarande för testikel isolering från vuxna flugor har tidigare beskrivits 27.
Imaging av centrosomes och deras funktion i Drosophila testiklar kan uppnås via tre relaterade låtar som presenteras här (Figur 3). Valet av vilket spår som är lämpligast är beroende på arten av den ifrågavarande undersökaren adressering.
Spår A involverar avbildning av levande testiklarna. Det är den snabbaste av de tre spår men kan endast användas när prover inte behöver bevaras och när immunfärgning krävs inte. I Spår A, är testiklar monterade (intakt, genomborrade eller klippa) på objektglasoch försiktigt kläm under ett täckglas för att bilda ett enda lager av lätt identifierbara celler. Cellerna sedan visualiseras med både faskontrastmikroskopi och fluorescensmikroskopi. Användningen av fas-kontrast är särskilt viktig för analys av Drosophila testiklar eftersom det avslöjar cellulär information som inte syns med andra former av överförd belysning och därmed möjliggör en snabb identifiering av olika stadier av spermieutvecklingen 28,29. Emellertid har Spår A två huvudsakliga nackdelar. För det första är den morfologiska integriteten för cellerna ofta äventyras när testiklarna brustit. För det andra, ofixerade celler rör sig ibland i provet, vilket gör att avbilda flera konfokala skikt inom ett specificerat område svårt. Att främja analyser av specifika celltyper, kan testiklarna genomborras eller skäras för att styra hur testiklarna brister såsom att krossa under täckglaset minimalt påverkar morfologin av celltypen av intresse.
Spår B innebär kemisk fixering av testiklarna. Detta spår kräver en mellanliggande tid för provberedning och har fördelen att fasta prover kan sparas för senare analys. Vidare tjänar fixering för att göra cellulära strukturer styvare, vilket minimerar rörelsen av provet under avbildning. Dock blir faskontrastmikroskopi mycket mindre informativ efter kemisk fixering, vilket gör vissa utvecklingsstadier svårt att identifiera spermier.
Spår C är den mest tidskrävande, men har fördelen att cellstrukturer är fasta och immun, vilket möjliggör visualisering av proteiner som inte är tillgängliga med rätt genetik taggar. Det finns många antikroppar som finns både kommersiellt och från olika forskargrupper för immunfärgning centrosomes och centrorelaterade strukturer i Drosophila testiklar.
Protocol
1. Spår A. Beredning av Live Testiklar
- Förbered PBS genom att lösa 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4 i 800 ml destillerat vatten och justera pH till 7,4. Ta volymen till 1 liter och sterilisera i autoklav.
- Isolera testiklar såsom tidigare beskrivits 27.
- Förbered DAPI färgning buffert genom att späda 1 mg / ml lager till ett ig / ml i PBS. Använd aluminiumfolie för att skydda röret mot ljus och förvara vid -20 ° C.
- Efter isolering av testiklarna, sänk ned provet i 6 | il av DAPI-färgning buffert på toppen av en positivt laddad objektglas under 10 min. Testiklar hålla sig väl till kommersiellt tillgängliga positivt laddade bilder, vilket möjliggör enkel hantering av provet. Positivt laddade objektglas är kovalent modifierad för att ge en statisk positiv laddning till glasytan. Liknar polylysin beläggning, främjar denna växelverkan av testiklarna with ytan av bilden.
- Tvätta överskott DAPI genom att ersätta färgning buffert två gånger med 6 l PBS. Använd en bit filterpapper för att transportera bort bufferten efter varje tvättsteg. Var försiktig så att inte av misstag tar bort testiklarna tillsammans med bufferten vid varje tvätt.
- Lägg till 6 l PBS till provet. Den mängd buffert som används bör justeras efter storleken på täckglas. De volymer som anges i detta protokoll är för en 18 x 18 mm täckglas. Tillval: Det är lämpligt att genomborra testiklarna nära den relativa placeringen av celltypen av intresse. Detta kommer att säkerställa att det finns minimalt tryck på dessa celler under squashing steget, och därigenom bibehålla sin strukturella integritet. Piercing av testiklarna kan utföras med användning av en skarp, ren skalpell.
- Placera försiktigt ett täckglas ovanpå provet.
- Täta kanterna på täckglas med användning av genomskinligt nagellack för att säkerställa att bufferten inte avdunstar från levande exemplar medan imåldrande.
- Använd en markör för att ange positionen för testiklarna för att underlätta att hitta provet på objektglaset och vidare till bildbehandling.
- Tvätta överskott DAPI färgning buffert genom att ersätta bufferten två gånger med 6 l PBS. Använd en bit filterpapper för att transportera bort bufferten efter varje tvättsteg. Var noga med att inte av misstag ta bort preparatet tillsammans med bufferten vid varje tvätt.
2. Spår B. Framställning av fasta Testiklar
- Förbered Fix buffert genom att späda 37% formaldehydstamlösning i PBS till en slutkoncentration av 3,7% formaldehyd i 1 x PBS
- Förbered DAPI färgning buffert genom att späda 1 mg / ml DAPI lager till 1 pg / ml i PBS.
- Doppa testiklarna i en 6 ^ il droppe av PBS på toppen av en positivt laddad glasmikroskopskiva.
- Orientera manuellt testiklarna i ett linjärt sätt, eller som på annat sätt föredras.
- Använd en bit filterpapper för att transportera bort PBS och ersätta den med 6 pl av Fixbuffert under 5 min.
- Använd en bit filterpapper för att transportera bort Fix bufferten och fördjupa förlagan i 6 l av DAPI färgning buffert för 10 min.
- Placera försiktigt en 18 x 18 mm täckglas ovanpå provet.
- Täta kanterna på täckglas med användning av genomskinligt nagellack för att säkerställa att bufferten inte avdunstar från provet medan avbildning.
- Använd en markör för att ange positionen för testiklarna för att underlätta att hitta provet på objektglaset och vidare till bildbehandling.
3. Spår C. Framställning av immunfärgades Testiklar
Cover siliconization: Fördjupa flera 18 x 18 mm täckglas i en liten bricka som innehåller silikonisering lösning och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur under en huv. Kontrollera att täckglasen är fullt exponerad och inte staplas på varandra.
- Placera provet i en 5 l droppe PBS på silikontäckglas. Orienteratestiklar som önskat och tränga testiklarna med en vass skalpell. Placera försiktigt en positivt laddad glas objektglas under täckglas, vilket gör att PBS att bli jämnt fördelade mellan täckglas och objektglaset. Använd en liten bit filterpapper för att transportera bort överskottet buffert mellan täckglas och objektglas. När bufferten avlägsnas genom filterpapper, kommer ökningen av trycket squash testiklarna. Många prover bör beredas samtidigt, eftersom en del kan gå förlorad eller skadas under loppet av protokollet. En glasgravören kan användas för att märka bilderna om olika typer av prover kommer att utarbetas samtidigt.
- Tvätta täck 3x i 1 min vardera i vatten, följt av 3x i 1 min vardera i 70% etanol, och en slutlig tvättning under 1 min i vatten. Låt silikoniserade täcklufttorka under en huv.
- Släpp bilderna i flytande kväve och låta provet för att frysa i 5-10 min.
- Ta bort bilderna från den liquid kväve med användning av en stor pincett. Använd en skalpell för att snabbt ta bort täckglas. Provet bör förbli på bilden. Var noga med att inte smeta provet under denna process genom att skjuta täck längs slide.
- Inkubera objektglasen i förkyld metanol i ett glas Coplin färgning burk vid -20 ° C under 15 min.
- Överför objektglasen till en glas Coplin färgning burk innehållande förkyld aceton vid -20 ° C under 30 sek.
- Tvätta sliderna under 1 min i PBS vid rumstemperatur under användning av en glas Coplin färgning burk.
- Förbered PBST-B genom att komplettera PBS med 0,1% Triton-X100 och 1% bovint serumalbumin (BSA). 5% normalt serum från samma värdart som den sekundära antikroppen (från steg 3,14) kan användas i stället för BSA för att minska bakgrundsbruset har framställts av icke-specifik sekundär antikropp-bindning.
- Inkubera objektglasen under 10 min i PBST-B i en glas Coplin färgning burken för att blockera icke-specifika ställen.
- Fyll brunnarna ifuktkammare med vatten. Fuktighet inne i kammaren kommer att minimera avdunstning av antikroppslösningar från provet under inkubationen steg.
- Förbered PBST-BR genom att komplettera PBST-B med 100 mikrogram / ml RNas A. RNas A degraderar RNA i provet och även fungerar som en extra blockerande medel genom att absorbera kraftigt på glasytan.
- Placera en cirka 1x1 cm bit Parafilm på toppen av provet för att sprida antikroppslösningen jämnt och skyddar antikroppslösningen från att avdunsta. Stäng fuktkammaren och inkubera provet i den primära antikroppen under 1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort bilderna från PBST-B. Använd en bit filterpapper för att torka det område på objektglaset runt provkroppen, med användning av försiktighet inte att torka provet självt. Slutligen, placera bilden i fuktkammare med provet uppåt
- Försiktigt lägga 100 pl av primär antikropp utspädd i PBST-BR ovanpå specImen (1:200 är i allmänhet en bra startkoncentration för okarakteriserade antikroppar).
- Täck provet med en ca 1 x 1 cm bit Parafilm och stäng fuktkammaren. Inkubera preparatet vid sekundär antikropp under 1 timme vid rumstemperatur.
- Öppna fuktkammaren och använda pincett för att försiktigt ta bort Parafilm från bilden. Inkubera objektglasen i 5 min i PBST i en glas Coplin färgning burk vid rumstemperatur för att tvätta. Upprepa processen för totalt tre tvättar.
- Ta bort bilderna från PBST-B och placera dem i fuktkammaren med förlagan uppåt. Försiktigt tillsätt 100 l av sekundär antikropp utspädd i PBST-BR ovanpå provet.
- Öppna fuktkammaren och använda pincett för att försiktigt ta bort Parafilm från bilden. Återigen, tvätta provet 3x 5 minuter vardera i PBST i ett glas Coplin färgning burk följt av 3 x 5 minuter vardera i PBS.
- Använd en Kimwipe och filterpapper för att försiktigt torka ytan av bilden, var noga med att inte röra eller torkning av provet.
- Lägg till 6 l av Monterings media till exemplar, täck med en ren täckglas (ej belagd med silikon), och tätningen kanterna med nagellack.
- Använd en markör för att ange positionen för testiklarna för att underlätta att hitta provet på objektglaset och vidare till bildbehandling.
4. Imaging Anmärkningar
Imaging kan uppnås med användning av en upprätt eller inverterad regelbundna ljusmikroskop eller konfokalmikroskop. Det är viktigt att mikroskopet utrustas med fas-kontrast, särskilt för avbildning av levande testiklar exemplar (spår A). Denna funktion har nyligen blivit tillgängliga på konfokala mikroskop.
När testiklarna sönder spontant (spår A), är spetsen (stamcellsområdet) vanligtvis hålls intakt och är lätt att identifiera, vilket ger en bra markör för att initialt hitta och använda för orientering.
_content "> centrioler är ganska små strukturer och bilder bör därför tas med hjälp av 63X eller 100X mål, en zoomfaktor på 4-6X, och en upplösning på minst 512 x 512 bildpunkter när möjligt.Representative Results
Centrosomes genomgår flera morfologiska och funktionella transformationer under loppet av spermatogenesen. Denna egenskap av spermatogenesen gör testiklarna ett användbart system för att studera olika aspekter av centro biologi. En sådan lätt observeras process är centro töjning. I spermatogonier, det centriolar markör ANA1-GFP markerar 0,6 ìm långa centriole (figur 4a). Denna centriole förlängs under spermatogenes och når en längd på 2,5 mikrometer i nästan mogna spermatider. Eftersom centrioler i Drosophila spermier är unikt långa, kan avbildning användas för att göra kvantitativa uttalanden om centro töjning (figur 4b). Analys av centriole längd kan också utföras i en mutant bakgrund och olika mutanter har identifierats som förändrar centriole tillväxt (figur 5). Exempel är alltid tidigt (aly) och kanon (CAN), mutationer som arrest spermatogenes före uppkomsten av meios 30 men inte blockera centriole töjning. I dessa mutanter, centrioler av den mogna spermatocyte växa till ca ~ 2,4 nm i jämförelse med centrioler av kontrollceller som når högst 1,8 um.
Figur 1. Spermatogenes och centro biologi. A) Utveckling av stam-och spermatogonier. Alla spermier kommer från stamceller som finns vid den apikala spetsen av testiklarna. Varje stamcell delar asymmetriskt för att bilda en stamcells som ärver mamman centro och en stamfader spermatogonium som ärver dottern centro 31. Som spermatogonier formen, blir de omgivna av 2 cysta celler, som fortsätter att omge spermatocyter och spermatider i hela spermatogenes. Spermatogonier divide 4 gånger för att producera 16 spermatogonier, var och en innehåller två centrioler. B) Utveckling av spermatocyter och Meiosis. Under Spermatocyte utveckling, centrioler duplicera en gång till för att generera fyra centrioler organiserad i två par per cell och 64 centrioler per cysta. Tidigt under Spermatocyte utveckling, flyttas varje centriole till plasmamembranet, bryggor till den och förlänger för att bilda en struktur som liknar en primär cilium 18,32-34. I mogna spermatocyter, når centriole längd ~ 1,8 ìm. De centrosomes spela en viktig roll i meios. Under meios I, de centriole par som fortfarande är knutna till plasmamembranet flytta mot mitten av cellen och skapar cellmembran invaginations vid sin distala spets. PCM runt centrioler växer, nucleates astrala mikrotubuli, och colocalizes med spindeln pole. Under övergången till meios II, separerar centriole par så att endast en enda centriole är pret vid varje spindel pol. C) spermiogenesen. Vid slutet av meios II, har tidig runda spermatid en enda centriole fäst vid invaginated plasmamembranet. En stor rund mitokondrie derivat finns nära kärnan och senare börjar att förlänga längs växande axoneme i senare runda spermatider. Under spermatogenes, de axoneme former och töjer inuti cytoplasman. Förutom en ny centriolar struktur som kallas PCL (Proximal Centriole Liksom) intill den redan existerande centriole 1. I slutet av spermatogenesen, celler som delar en gemensam cysta separat från varandra för att bli helt mogna rörliga spermier. Diagrammen i Spermatocyte utveckling (B) och spermiogenesen (C) visar endast en cell av de 16 spermatocyter och 64 spermatider respektive per cysta, och inte skildra cysta cellerna. Klicka här för att visa storar siffra.
Figur 2. Drosophila Testiklar. En överlagring av ett fas-kontrast och GFP fluorescens mikroskop av en hel-mount testikel som uttrycker den pan-centriolar markör Ana-1-GFP. Distinkta område som motsvarar paneler 1-3 i figur 1 är separerade med en streckad röd linje A) Stamceller och spermatogonier, B) spermatocyter och Meios, C) spermiogenesen.
Figur 3. Spår Mot Imaging centrosomes i Drosophila Testiklar.
Figur 4. Centro förlängning under spermatogenes. A) Varje steg visar en fas-kontrast bild (vänster), fluorescens bild (mitten), och förstorad bild av centro (höger). Den fas-kontrast bild visar den särskilda cellstadiet baserat på positionen och morfologi av cellen, kärnan, kärnsystemet och mitokondrier. Den fluorescens bild visar DNA färgas med DAPI (blå). Den centro bilden visar centrosomes märkta av Asterless-GFP (Asl, översta bilderna) och ANA1-GFP (ANA1, nedre bilden). En vit cirkel belyser cellmembranet i både faskontrast-och fluorescensbilder. De streckade vita cirklar och den grå cirkeln i fluorescensbild markera positionen av kärnan och kärnsystemet, respektive. Gula pilen pekar på Y-bestrukennågra loopar. Röda streckade cirklarna markerar mitokondrierna. Stages 1-6 avser 29 och etapp 13-17 avser beskrivning av cellsteg i 32. Steg 1: Primär Spermatocyte. Identifierat som en liten cell en spets av testis. Steg 2a: Polar Spermatocyte. Identifieras genom närvaron av en mitokondrier lock på en sida av kärnan. Steg 3: apolärt Spermatocyte. Identifieras genom sin relativa större storlek än den primära spermatocyte och avsaknaden av en mitokondrier mössa. Steg 4: Primär Spermatocyte. Märkt med uppkomsten av allt: Alla 3 Y-kromosom slingor. Steg 5: Mogen Primär Spermatocyte. Största Spermatocyte produceras spermatogenes, identifieras genom en ytterligare ökning av kärnstorleken. Steg 6: Premeiotic Primär Spermatocyte. Y-kromosom loopar upplösas och kärnan försvinner. Steg 13: Lök Stage spermatid. Rund cell som innehåller lika stor kärna och mitokondrier. Steg 17: Late spermatid. Identifierat som en långsträckt spermatid som förblir en del av en BUNDLe av 64 spermatider med kärnor som finns nära basen av testiklarna., Kärnor är något bredare än mogna spermatider som finns i sädesblåsor. Skala barer, 10 | im och en im. B) Diagram visar medelvärdet och standardavvikelsen för varje etapp som mätt av Asterless-GFP (blå) och ANA1-GFP (grönt). I etapp 6, Asterless-GFP (blå) och ANA1-GFP (grönt) medelvärden och standardavvikelser lappar och endast Asterless-GFP (blå) är uppenbar. Start Stage 13, gör Asterless-GFP inte dekorera hela centriole och mätningar bestämdes inte (ND).
Figur 5. Onormalt långa centrioler i etapp 6 spermatocyter av aly och kan mutanter. AC) Ljus mikroskop av hela testiklar och fluorescerande panel av representativa centro laBeled genom ANA1-GFP. Observera den avvikande formen av testiklarna i aly och kan mutanter, som blir resultatet av en brist på spermatider till följd av meiotiska gripande. D) Diagrammet visar genomsnittet, standardavvikelse, och datadistribution av centriole längd i vildtyp, aly och kan . Provnummer för varje datapunkt är inom parentes. Scale bar, 1 fim.
Discussion
Studera centro biologi i flyga testiklar som använder genetiskt etikette centrosomal markörer är en användbar metod för att bedöma centro funktion och aktivitet i både vildtyp och mutant sammanhang. I synnerhet är Spår A lämplig för snabb screening av centrosomal störningar såsom missbildning, misegregation, instabilitet, eller abnorm längd i ett försök att identifiera nya mutanter. Vidare spermatid cilier i levande preparat förblir rörliga i ungefär 15 min efter dissekering och användning av levande testiklar i Spår A möjliggör också för spermierörlighet för att lätt hanteras. Eftersom aktiviteten av spermier rörliga cilier är direkt relaterad till centro funktion, kan analyser göras för att bestämma effekterna av olika centrosomal mutationer på ciliär funktion. Spår B kan användas för flera observationer speciellt när statistiska uppgifter krävs till exempel för att räkna antalet centrioler per cell och eller antalet celler per cysta. Spår C är mest useful för detaljerade observationer som kräver färgning med antikroppar. Exempel innefattar märkning av en speciell celltyp, såsom stamceller, färgning av ett protein som inte har en tillgänglig tagg såsom acetylerad tubulin, eller för att kontrollera frånvaron eller mislocalization av ett protein i en mutant.
När avbildning centrosomes och centrorelaterade strukturer, att använda genetiskt märkta markörer snarare än antikroppar är inte bara experimentellt enklare, men ger också mer robusta och reproducerbara resultat. Därför är användningen av genetiskt-märkta centrosomal proteiner en tillförlitlig metod för mekanistiska och kvantitativa analyser som kräver en stor datamängd. Till exempel har användningen av genetiskt-etikette centrosomal markörer varit särskilt värdefull för kvantifiering av centriole längd. En sådan analys har visat att olika mutationer kan klassificeras i två kategorier baserat på variationen i centriole längd. En kategori innehåller mutationer som chanGE centriole längd men påverkar inte standardavvikelsen 1 och den andra kategorin omfattar mutationer som påverkar både centriole längd och standardavvikelsen i längd 11. Sådana kvantitativa data kan ge värdefull insikt i funktionen av vissa centrosomal gener. Centrosomal mutanter som uppvisar defekta centriole längd med ökad standardavvikelse kan bero på en destabilisering av centriolar struktur. Emellertid kan defekta centriole längd med en vanlig standardfelet indikerar att mutationen inte strukturellt inte destabiliserar centriole och är mer sannolikt att bero på en förändring i regleringsmekanism kontrollerar centriole längd. På grund av bristande överensstämmelse i immunofärgning, kvantitativa analyser är svåra med användning av markörer antikropp enbart.
Den centro är en stor, komplex proteinliknande struktur och många av dess proteiner bara finns inom dess inre. Användning av genetiskt märkta centrosomalmarkörer snarare antikropparna tillåter en att konsekvent märka inre komponenter centro vars epitoper kan vara på annat sätt otillgängligt för markörer antikroppar. Exempelvis lokaliseringsstudier av Bld10 användning av antikroppar finner det protein som skall anrikas på de distala och proximala ändarna av centriole 13, medan Bld10-GFP visar en mer likformig fördelning 1. Emellertid är det också viktigt att beakta graden av uttryck av en särskild genetiskt märkt protein, eftersom detta kan påverka fördelningen protein. Lokalisering av Sas-4-GFP-och SAS-6-GFP uttryckt under deras endogena är begränsad till de proximala ändarna av centriole 1,16,35 Å andra sidan, Sas-4-GFP-och SAS-6-GFP uttrycks under stark ubikitinpromotor är lokaliserade längs hela längden av den centriole 12,14. En annan viktig faktor är effekten av den genetiska tag på proteinfunktion. Analysera om genetiskt märkta proteiner är funktionella kan vara TESted genom införande av transgena proteiner till en mutant bakgrund och undersökning av om den transgena proteiner räddar den mutanta fenotypen.
Fixering av Drosophila testiklar kan utföras med hjälp av olika kemiska fixeringsmedel. Här beskriver vi fixering med såväl formaldehyd (spår B) och metanol-aceton (spår C). Emellertid kan antingen fixativ användas omväxlande och eftersom olika fixativ kemiskt kan störa nativa antikroppsepitoper, måste valet av lämplig fixativ för immunofärgning bestämmas experimentellt. Följande fixativ och inkubationsbetingelser användes vanligen: 3,7% formaldehyd, 5 min vid rumstemperatur, metanol, 15 min vid -20 ° C; aceton, 10 min vid -20 ° C; metanol, 15 min vid -20 ° C. följt av aceton, 30 sek vid -20 ° C, etanol, 20 min vid -20 ° C. Även fixering med aceton, metanol och etanol inte kräver en utökad permeabilization steg för immunfärgning, fixering with formaldehyd bör följas av en 1 h inkubation i PBST-B vid rumstemperatur för att permeabilisera cellmembranen och tillåta antikropp tillgång till intracellulära epitop. Vidare är vissa fixativ är mer lämpade för särskilda antigener. Exempelvis formaldehyd fungerar väl för fixering av små proteiner, medan metanol och aceton är väl lämpade för upptagning av stora molekylkomplex 36.
Immunfärgning av Drosophila testiklar har tidigare beskrivits för observation av kromatin strukturer och mikrotubuli cytoskelettet 29,37. Här (spår C), har förfarandet optimerats för analysen av centrosomal strukturer som innehåller genetiskt-taggade proteiner. Vi ger en detaljerad beskrivning av denna procedur för att vägleda personer som är oerfarna av att arbeta i Drosophila testiklar. Detta förfarande innefattar även modifieringar för att förbättra konservering och morfologin hos testiklarna, såsom genom användning av siliconized täckglas och positivt laddade objektglas.
Disclosures
Fri tillgång till denna publikation stöddes av Leica Microsystems.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag (R01GM098394) från NIH och National Institute of General Medical Sciences samt bidrag 1.121.176 från National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
| Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
| 37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| 18x18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
| Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
| Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
| Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |
References
- Blachon, S., et al. A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication. Genetics. 182, 133-144 (2009).
- Hennig, W. Spermatogenesis in Drosophila. The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
- White-Cooper, H. Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis. Reproduction. 139, 11-21 (2010).
- Davies, E. L., Fuller, M. T. Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).
- Belote, J. M., Zhong, L. Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis. Heredity. 103, 23-31 (2009).
- Xiao, X., Yang, W. X. Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance. Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).
- Hennig, W. Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila. Chromosoma. 111, 489-494 (2003).
- Wakimoto, B. T. Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis. Genome research. 10, 1841-1842 (2000).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. Building a centriole. Curr Opin Cell Biol. , (2012).
- Blachon, S., et al. Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication. Genetics. 180, 2081-2094 (2008).
- Basto, R., et al. Flies without Centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly. Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).
- Rodrigues-Martins, A., et al. DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly. Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor. J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).
- Gopalakrishnan, J., et al. Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome. Nat Commun. 2, 359 (2011).
- Gopalakrishnan, J., et al. Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment. Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).
- Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes. Dev Cell. 23, 425-432 (2012).
- Maines, J. Z., Wasserman, S. A. Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule. Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).
- Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 107, 440-451 (1998).
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication. Curr Biol. , (2007).
- Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies. J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).
- Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation. Curr Biol. , (2008).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat Commun. 2, 243 (2011).
- Cheng, J., et al. Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing. Nature. 456, 599-604 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. , e2641 (2011).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).
- White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila. Development. 125, 125-134 (1998).
- Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division. Science. 315, 518-521 (2007).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).
- Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila. Development. 131, 3411-3422 (2004).
- Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. Schatten, H. , Humana Press. (2012).
- Gopalakrishnan, J., et al. Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block. J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).
- Hassell, J., Hand, A. R. Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).
- Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein. Genetics. 133, 569-579 (1993).
