Summary
V3 工作流是使用无污渍凝胶的西方污点程序。无污渍技术使研究人员能够可视化蛋白质分离质量，验证转移效率，最重要的是，使用总蛋白质定量作为可靠的加载控制来验证兴趣蛋白的变化。
Abstract
西方污点是一种非常有用和广泛采用的实验室技术，但它的执行是具有挑战性的。工作流程通常被描述为"黑匣子"，因为实验者直到最后几个步骤才知道它是否已经成功执行。此外，由于在整个西方印迹处理过程中缺乏有效的质量控制工具，西方污点数据的质量有时会受到挑战。在这里，我们描述了V3西部工作流程，它应用无污渍技术来解决与传统的西方污点协议相关的主要问题。此工作流程允许研究人员：1） 在大约 20-30 分钟内运行凝胶：2） 在凝胶运行后 5 分钟内可视化样品分离质量：3） 在3-10分钟内转移蛋白质：4） 量化验证转让效率：最重要的是5）使用总蛋白质负荷控制来验证兴趣蛋白水平的变化。这种新颖的方法消除了剥离和反驳内务蛋白质的污点的需要，如β作用素、β-图布林、GAPDH 等。V3 无污渍的工作流程使西方污点过程更快、更透明、更量化、更可靠。
Introduction
西方污点是一种非常有用的技术9，然而，西方印迹有两个主要的挑战：长期和劳动密集型的过程和数据的质量。传统协议大约需要 2 天。它涉及许多步骤，包括样品制备、凝胶铸造、蛋白质电泳和转移、膜阻塞以及抗体孵化、成像，以及经常剥离、重新测试，最后进行数据分析。在整个过程中，没有可靠和灵活的流程控制工具。因此，每个步骤都可以引入错误，这些错误有可能生成数据人工制品：因此，加载控制在西方印迹中至关重要，以识别和纠正错误。加载控制通常是通过检查每个样本中参考蛋白质的蛋白质水平来完成的，以查看其是否均等。人们经常使用家政蛋白质，如β作用素 ，β-图布林，GAPDH，作为负载控制。
西方污点数据的质量取决于可靠的负载控制。但是，在使用家政蛋白进行装货控制时，有两个合理的顾虑：1） 家政蛋白带的抗体免疫检测经常饱和，因此无法区分样品之间的负荷差异：2） 在某些实验条件下，样品中的内务蛋白质表达水平可能有所不同，例如siRNA治疗、细胞死亡、细胞分化等11，28，3，6，10，21。由于这些担忧，科学期刊现在要求"对于定量比较，应使用适当的试剂、控制和具有线性信号范围的成像方法"（自然指南）。同样，《临床调查杂志》的编辑们也要求更可靠的装载控制装置24。出于这些原因，需要验证家政蛋白质才能用作负载控制。首先，必须确保它以免疫检测方法14，29的线性动态范围进行测量。第二，必须确保在所有样本26，31，25，19，20中一致表达。
可靠负载控制的另一种解决方案是使用污点中的蛋白质总量测量。一些研究人员用总蛋白污渍染色了斑点，如库马西、火烈鸟粉红、Sypro Ruby、阿米多黑、庞绍S和无污渍技术，以测量每个车道的总蛋白质信号为负载控制16，20，13，27，1，4，12。蛋白质总负荷控制避免了与家政蛋白质相关的陷阱。首先，它真实地反映了每个样本所装载的蛋白质量。其次，总蛋白污渍在用于西印分析的普通加载范围内表现出优良的线性动态范围（复合细胞赖苏酸盐的10-50微克蛋白质），并准确区分样本12的加载差异。
无污渍技术是一种新型的全蛋白染色方法，其中一种独特的化合物混合在丙烯酰胺凝胶溶液中，均匀地分布在铸造凝胶中。电泳完成后，凝胶暴露在紫外线下至少1分钟，使污渍化合物与蛋白质中的色氨酸残留物发生反应。这些蛋白质在紫外线下变得兴奋，以发出强烈的荧光信号，可以在无污渍的成像仪（如ChemiDoc MP系统）中可视化和量化。然而，无污渍化合物本身不吸收紫外线，导致凝胶图像背景低。色氨酸残留物的修饰是不可逆转的，蛋白质不仅可以在凝胶中，而且在蛋白质转移后的任何时间在污点上可视化。
无污渍技术应用于V3西部工作流程（图1），以解决对传统工作流程的主要投诉，特别是使用家政蛋白质作为负载控制的问题。使用此工作流程，可以：1） 在大约 20-30 分钟内运行凝胶：2） 在凝胶运行后 5 分钟内检查样品完整性和蛋白质分离质量：3） 在3-10分钟内转移蛋白质：4） 量化检查转移效率：和 5） 最重要的是，使用总蛋白质加载控制验证兴趣蛋白水平的变化。
Protocol
1. 蛋白质样品准备
（描述了从细胞培养中提取蛋白质的典型程序）
- 将 HeLa 细胞培养盘放在冰中，用冰冷的三叶草盐水（TBS;20 mM 三叶草-HCl，pH 7.5，150m NaCl）清洗细胞。
- 吸气 TBS，然后添加 1 毫升每 100 毫米菜冰冷 RIPA 缓冲 （50 mM Tris-HCl pH 8.0， 150 mM NaCl， 1% NP-40， 0.5% 脱氧酸钠， 0.1% SDS） 补充磷酸盐和蛋白酶抑制剂.
- 使用冷塑料细胞刮刀将粘附细胞从盘子中刮下来：轻轻地将细胞悬架转移到预制的微中微管中。
- 在旋转器上的 4 °C 下保持持续搅拌 30 分钟。
- 在 4 °C 预制离心机中以 16，000 x g 旋转 20 分钟。
- 轻轻地从离心机中取出管子，放在冰上。将超自然的超自然移植到冰上保存的新鲜管子上，然后丢弃颗粒。
- 取出少量（10-20微克）的测定，以执行蛋白质检测。使用RC DC检测套件确定每个样本的蛋白质浓度。
- 如有必要，请将蛋白质样本引用至-20 °C进行长期储存。 重复冻结和解冻周期会导致蛋白质降解，应避免。
- 以每个样品约20微克为例，加入等量的2倍莱姆利样品缓冲区（4%SDS，10%2-麦加普托乙醇，20%甘油，0.004%溴酚蓝色，125米特里斯-HCl，pH 6.8）。
- 在样品缓冲区中加热每个细胞裂解物 5 分钟，温度为 95 °C。
- 离心机在16，000 x g的微中心，为期1分钟。
2. 凝胶电泳与无污渍凝胶（+30分钟）
- 以标准TGX任何KD无污渍预制凝胶（中度格式凝胶），从盒式磁带底部取出梳子和胶带。
- 将盒式磁带放在标准单元中，用 60 毫升运行缓冲器（25 mM Tris、190 m 血糖、0.1% SDS、pH 8.3）填充集成的上缓冲室。用运行缓冲器冲洗井。
- 将下缓冲箱的每一半填充 400 毫升运行缓冲到标记的填充线。
- 加载蛋白质样本和适当的蛋白质标记。
- 将盖子放在油箱上，将颜色编码的香蕉塞与盖子上的相应插孔对齐。
- 在200 V或300 V时运行凝胶约30分钟或20分钟。
3. 使用化学分子 MP 系统检查蛋白质分离质量的无污渍凝胶成像（+5 分钟）
- 从细胞中取出凝胶盒。使用标准单元盖中的凝胶盒式打开工具打开盒式磁带并释放凝胶。
- 将几毫升水涂抹在切米多克 MP 成像仪的紫外线样品盘中心。小心地将凝胶从盒式磁带上抬起，放在托盘上。
- 启动图像实验室软件，并捕获无污渍凝胶图像 （图 1A）与以下设置：
应用：无污渍凝胶
凝胶激活时间：1 分钟
成像区域：标准凝胶
图像曝光时间：自动优化最强烈的频段 - 从样品托盘中取出凝胶，然后立即进行转移步骤。
4. 带跨布洛特涡轮系统的蛋白质转移（~10分钟）
- 打开一个跨布洛特涡轮增压米迪PVDF传输包;将底部堆栈（包括膜）放在传输盒的基座上。
- 将凝胶放在膜上，将顶部堆叠放在凝胶上，并推出气泡。
- 将盖子放在盒式磁带底座上，然后转动表盘将其锁定。
- 将盒式磁带插入膨胀机舱。
- 通过选择预设的 Turbo 程序并选择标准凝胶尺寸 （midi） 开始转移，然后按 RUN。典型的跑步只需 7 分钟。
- 转移结束后，拆解染迹三明治，将污点和凝胶放在装有除离子水的容器中。
5. 使用化学分子 MP 系统检查蛋白质转移效率和质量的无污渍凝胶和斑点成像（+5 分钟）
- 将转移后凝胶放在切米多克 MP 成像仪的样品盘上。
- 启动图像实验室软件，并捕获传输后凝胶（图1B）的无污渍图像，设置如下：
应用：无污渍凝胶
凝胶激活时间：无
成像区域：标准凝胶
图像曝光时间：与转移前凝胶图像的曝光时间相同 - 从样品托盘中取出凝胶，然后用以下设置对污点（图 1C）进行成像。成像时，用几滴水或TBST保持污点湿润。
应用：无污渍
成像区域：标准凝胶
图像曝光时间：自动优化最强烈的频段 - 从样品托盘中取出印迹膜，并将其放置在具有 TBST 的容器中（TBS 中的 0.1% Tween 20）。
6. 抗体孵化
- 在室温下将污点放入 TBST 中 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 溶液中，在室温下放置 1 小时。
- 在含有针对第一个目标蛋白和针对第二个目标蛋白质升起的兔子原抗体的溶液中，在 4 °C 的溶液中隔夜孵化污点。
- 倒出含有主要抗体的溶液。接下来，在20毫升TBST中搅拌5分钟，洗净污点。重复4次，共洗5次。
- 在室温下孵育1小时，在二级抗体溶液中含有Dylight 650组合山羊抗鼠抗体和Dylight 549结合山羊抗兔抗体。
- 倒出含有主要抗体的溶液。接下来，在20毫升TBST中搅拌5分钟，洗净污点。重复4次，共洗5次。
7. 图像实验室软件成像和数据分析 - 蛋白质总正常化（约 5 分钟）
- 通过打开新的多通道协议、配置三个荧光通道并运行协议，获得斑点的多重荧光图像（图 1E）。
频道 1：
应用： 污点 Dylight 650
成像区域：标准凝胶
图像曝光时间：自动优化最强烈的频段
频道 2：
应用： 污点 Dylight 549
成像区域：标准凝胶
图像曝光时间：自动优化最强烈的频段
频道 3：
应用：无污渍
成像区域：标准凝胶图像曝光时间：自动优化最强烈的波段 - 单击分析工具框中的规范化图标，然后单击"是"以检测车道和带。
- 如果需要，选择并使用"车道和带工具"对车道和带进行调整。
- 选择无污渍图像作为规范化通道。
- 选择 MW 分析工具，并通过检查下面的框来分配 MW 标准车道。
- 要查看规范化卷，请单击工具栏上的分析表。所有计算将由软件自动执行，包括正常化因子和标准化卷。目标蛋白质带强度值现在根据蛋白质负荷的变化进行调整。这将允许在样本中准确比较目标蛋白质。
Representative Results
1. 用无污渍凝胶图像评估样品完整性、蛋白质分离质量和转移效率。
HeLa细胞中的蛋白质提取物在300 V分离20分钟，在18井标准任何KD TGX无污渍凝胶上。蛋白质样本以四种不同量装载3倍（兰斯1-3，40微克;车道 4-6， 30 μg;车道 7-9， 20 μg;车道 10-12， 10 μg）。凝胶在紫外线下激活1分钟。 图2A 显示蛋白质分离后立即获得的凝胶图像。蛋白质样本完整性（如 降解）和分离质量（如 蛋白质沉淀）可以通过此凝胶图像进行视觉评估。然后，蛋白质被转移到硝基纤维素膜使用跨布洛特涡轮增压7分钟。 图 2B 显示了转移后凝胶的无污渍图像。两张图像都是以相同的曝光时间（6.8秒）获得的。选择了3号巷和12号车道来衡量转移效率。使用图像实验室软件中的音量工具，绘制了一个矩形框（蓝色），以覆盖两个凝胶图像上的通道 3 和 12。根据这些箱子的体积值计算，两条车道的换乘效率为80%（图2C）。在这个实验中，AnyKD TGX凝胶被选中用于研究中小尺寸的目标蛋白质，并且没有针对大蛋白质的转移进行优化。优化转移效率需要使用较低的百分比凝胶（例如 4-20%）和/或调整转移时间，以促进大蛋白质的转移。2. 无污渍总蛋白负荷控制是西方印迹中家政负荷控制的可靠替代品，可以量化兴趣蛋白水平的微小变化。
MCM-7是一种DNA许可复制因子，在辐照治疗后淋巴母细胞系（LCL）中，其水平降低20-50%。在这个实验中，4个控制和辐照处理淋巴细胞系（LCL）培养物的lysates（每个30μg）在12井标准任何KD TGX无污渍凝胶上分离。凝胶在紫外线下激活1分钟，由跨布洛特涡轮转移到PVDF膜进行免疫凝血。家政蛋白GAPDH（绿色）被探测与兔子抗体（细胞信号技术，美国，1：2，500）和Dylight 549结合山羊抗兔抗体（美国罗克兰，1：20，000）。兴趣蛋白MCM-7（红色）使用小鼠抗体（美国Abcam，1：1，000）和Dylight 649结合山羊抗鼠抗体（罗克兰，1：10，000）进行探测。
图 3A 显示了在四个经过控制和辐照处理的 LCL 样本中检测到的总蛋白质（蓝色）、MCM-7（红色）和 GAPDH（绿色）的多路复用荧光图像。 图 3B 是显示每个样本中总蛋白质模式（30 μg）的相同污渍的无污渍图像。图像实验室软件选择样本通道（蓝色框）来测量 MCM-7、GAPDH 和每个通道的总蛋白质体积。MCM-7 水平在无污渍总蛋白质测量或 GAPDH 方面都进行了标准化。对规范化的MCM-7蛋白质水平进行了统计分析，并在图表（图3C）中显示MCM-7蛋白质带平均体积和标准偏差（n=4）。两种正常化方法均显示小幅下降（约25%）在MCM-7蛋白水平后进行辐照治疗。与GAPDH作为加载控制的数据相比，总蛋白质正常化的数据表现出较小的标准偏差。
图1。V3 西部工作流。 V3 工作流程在左列中以 4 个步骤进行描述。工作流程中使用的主要仪器和试剂在每一步都显示出来。还包括每个步骤的估计时间。右列显示在 V3 工作流中至少可生成 4 张图像。描述了每段数据的使用情况。前转移凝胶、转移后凝胶和污渍（A、B、C）的无污渍图像不能用传统的西方染色技术轻易生成：这些图像和数据提供了重要的信息和检查点沿程序，以提高科学家的控制和可重复性的西方污点工作流。如果在检测中应用了 HRP 组合的二次抗体，则目标蛋白质信号可以在化疗光斑图像（D）上捕获：如果在同一污点上同时检测多个目标蛋白，则目标蛋白信号可以捕获在荧光斑图像（E）上。
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图2。V3 西部工作流程中转移前和转移后凝胶的无污渍图像，以评估样品完整性、分离质量和传输效率。（A） 预传递凝胶无污渍图像。（B） 转移后凝胶无污渍图像。（C） 蛋白质转移效率测量。
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图3。将无污渍总蛋白质测量与 GAPDH 免疫检测进行比较，作为加载控制，以使兴趣蛋白水平正常化。（A） 荧光西斑图像。（B） 无污渍图像。（C） 标准化 MCM-7 蛋白质水平。
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Discussion
上述 V3 无污渍协议用于多发式荧光西印染。它也可以应用于使用化疗检测的西方印迹。在多发荧光西斑协议中，无污渍图像在两个时间点获得：1） 蛋白质转移后立即获得：2） 在抗体孵化后的多发荧光成像步骤。第一个无污渍图像用于计算传输效率，第二个无污渍图像用作加载控制。应用化疗方法时，不可能对无污渍和目标蛋白质信号进行多路复用图像，因为化疗发光信号也会出现在无污渍通道中。在这种情况下，我们建议使用蛋白质转移步骤后立即拍摄的无污渍图像进行加载控制和规范化分析。
与传统的使用家政蛋白质作为负载控制的西方污点工作流相比，V3 西部工作流程具有以下独特优势：
首先，V3 工作流程提供了实用、方便和更可靠的负载控制，以验证兴趣蛋白水平的变化。V3 协议使用总蛋白质加载控制来正常化每个样本中测量的兴趣蛋白质水平。它避免了使用家政蛋白质作为负荷控制的两个陷阱：饱和免疫检测和在某些实验条件下样品中不一致的内务蛋白质表达水平。不再需要剥离和反驳带有针对家政的抗体的步骤。使用无污渍技术，无需用 Coomassie 或 Sypro Ruby 等污渍染色和去污渍，以进行蛋白质总测量。只需几秒钟就获得污点图像，使用图像实验室软件完成蛋白质完全正常化大约需要 5 分钟。
其次，V3工作流程使科学家能够更好地控制西方程序，因为它使程序更加透明，并引入了几个质量控制检查点。在无污渍技术的帮助下，研究人员可以在凝胶和污渍上可视化他们的蛋白质样本。科学家可以评估蛋白质样本的完整性（降解与否）、分离质量（沉淀与否）、转移效率和转移质量（甚至转移与否）。这些检查点帮助研究在看到过程中存在重大缺陷时终止实验，并避免在劣质样品和斑点上浪费时间。这项技术还有助于科学家评估膜剥离后是否存在大量蛋白质损失，以及该污点是否适合反驳不同的目标4。
以下是使用 V3 西部工作流确保良好体验和优质数据的一些提示。
- 凝胶运行后立即成像凝胶。在程序中的第一次成像之前，不要将凝胶浸泡在任何缓冲器中，因为它可能会洗去污渍化合物。
- 使用相同的成像区域获取协议中的所有图像。这将允许软件覆盖图像进行数据分析，如总蛋白质正常化。
- 在成像前转移和转移后凝胶时，保持暴露时间一致。这将使软件能够定量测量传输效率。
- 获取污点图像时，用几滴水或 TBST 保持膜湿润。这将避免目标蛋白检测可能出现的脏背景问题。
- 使用低荧光PVDF膜进行多发性荧光西印。
需要注意的是，紫外线激活后的无污渍分子与色氨酸残留物不可逆转地结合在一起。如果表位含有色氨酸，这种不可逆转的修饰可能会影响使用单克隆抗体时的抗原识别。多克隆抗体不太可能受到影响，因为它们识别抗原上的多个表观上位。未绑定无污渍分子很容易从凝胶和膜上冲走，因此不会干扰抗体抗原相互作用。
总之，V3西工作流程使西方污点过程更快、更透明、更定量、更可靠。研究人员现在可以很容易地在西方的污点实验中应用蛋白质总负荷控制，使他们的数据更值得信赖。V3无污渍工作流程已被一些实验室采用，其出版物已经证明，期刊接受无污渍数据作为加载控制在西方污点22，17，7，8，5，23，18，15。
Disclosures
作者安东·波施、乔纳森·科恩、肯尼思·欧、马特·哈蒙德和刘宁是生物拉德实验室公司的员工。
Acknowledgments
作者感谢沃尔夫-迪特尔·斯塔尔兹博士、阿诺德·雷米博士、安东·波施博士、帕特里夏·皮亚蒂博士、汤姆·戴维斯博士、克里斯·西蒙尼博士和杰夫·德班博士对这份手稿的批判性审查和编辑。作者还感谢艾莉森·施瓦茨的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 | |
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