Summary
細菌性生物発光遺伝子カセットを発現する哺乳動物細胞（
Abstract
哺乳動物細胞ベースのインビトロアッセイは、広く毒性試験のための動物実験の代替として用いられているが、原因ホタルルシフェラーゼに基づくスクリーニング法の破壊的な性質のために必要とされる並列の試料調製の高い金銭的および時間コストに限定されている。このビデオは、目的の化合物の細胞毒性効果を監視するための安価で容易な方法としては、ルシフェリン基質の破壊的な添加を必要としない自律的に生物発光哺乳動物細胞の利用が記載されている。安定的に完全な細菌の生物発光（luxCDABEfrp）遺伝子カセットを発現する哺乳動物細胞は、自律的に高価であり、おそらくは干渉ルシフェリン基板と、外部エネルギー源による励起、又は伝統的である試料の破壊を添加せずにピークが490nmでその光信号を生成する光学イメージング手順の間に行われるS。外部刺激からのこの独立性は結果の信号のみをアクティブ代謝中に検出されていることを意味し、もっぱら細胞上の生物発光反応を維持するための負担を配置します。生物生産の変化は細胞の成長と代謝に悪影響を示すものであるので、この特徴は、 ルクス発現細胞株細胞毒性に対するbiosentinelとして使用するための優れた候補になります。同様に、必要なサンプル破壊の自律的な性質や不足が毒物曝露の期間を通じて、リアルタイムで同じサンプルを繰り返しイメージングを可能にし、自動化された方法で、既存の画像処理装置を使用して複数のサンプル間で実行することができます。
Introduction
彼らは食品医薬品局（FDA）によって、消費者の使用が承認される前に米国では、人間の消費のために意図された医薬品やその他の製品は、広範な評価を必要とする。このテストを実行するための負担は、実質的に新規化合物の開発コストを増加させ、したがって、消費者にとってコストの上昇につながり現像剤1上に配置されている。伝統的にずっとこのスクリーニングのが人間のホストのプロキシとして機能するように、動物の科目を利用しているが、これはADME / Toxの（吸着、分布、代謝、排泄、および毒性に毎年費やさ推定28億ドルで、大規模な財政負担であることが証明された）2のみをスクリーニングし、動物モデルは確実に人間の毒性応答3を予測できないことを示唆している証拠。したがって、in vitroでのヒト細胞培養ベースのテストでは 、その相対的に低いの過去20年間の人気を得ているコスト、高スループット、および人間の生物学的利用能及び毒物学4のより良い表現。現在、細胞培養系毒性スクリーニング法は、細胞生存5を評価するために、細胞膜の完全性をプロービング、内因的に利用可能な細胞質酵素の活性のスクリーニング、またはミトコンドリアの活性のレベルを追跡し、そのようなATPレベルを測定するなどの様々なエンドポイントを採用、6。測定は、従って、単一の時点でデータを生成し、取り出すことができる前に、しかし、関係なく選択されたエンドポイント、これらの方法は、すべてのサンプルの破壊を必要とする。結果として、多数の試料を調製し、基本的な毒物学的動態研究のため、並列に処理し、再度新たな化合物の開発に要するコストと労力を添加する必要がある。また、使用したアッセイは、そのようなガウルシフェラーゼ7、 ウミホタル属ルシフェラーゼ8、 型Metridiaルシフェラーゼ9としてルシフェラーゼ分泌細胞溶解の必要性を排除し、エンドポイント測定用媒体の一部を必要とするが開発されてきたが、これらは依然として所定の時点でのサンプリングに限定されるものではなく外因性の光活性化基質の添加を必要としている。
基材のコストを排除するだけでなく、必要なサンプル破壊の不利益を回避するために、ヒト細胞株は同様である生きた細胞の連続的な監視を可能にするために完全な細菌の生物発光（ ルクス ）遺伝子カセット（luxCDABEfrp）を発現する遺伝子操作されている蛍光染料ベースのライブセルイメージングに、追加光子活性化と微視的調査手続きなし。この細胞株は、このように試料の破壊を回避し、構成的に外部刺激を必要とせずに連続的な、直接検出するための光信号を生成することができる。機構的に、これらの細胞から発生する生物発光シグナルが発生S luxAB形成されたルシフェラーゼ酵素が減少リボフラビンリン酸塩の存在（FRP遺伝子によってFMNからリサイクルさFMNH 2、中長鎖脂肪酸アルデヒド（内在性基質を用いたluxCDE遺伝子産物によって合成され、再生）の酸化を触媒するとき製品）と酸素分子10。宿主細胞中での発現カセットルクスしたがって、細胞破壊又は外因性基質を添加せずに製造され、検出される光が可能となる。同様に、 ルクス遺伝子および内因的に利用できるFMNとの間の相互作用、およびO 2補基質、及びFMNH 2〜FMNの変換をサポートすることができる環境を維持するための要件は、得られた生物発光信号のみが生きているから検出できることを保証、代謝的に活性な細胞。
これらの要件は、以前にそのルクス -BASを実証するために利用されていますED生物発光出力は、携帯人口規模11とその毒性化合物の曝露用量反応ファッション12 autobioluminescent生産を損なうと強く相関している。ここでは、毒性試験のためのautobioluminescent哺乳類細胞のアプリケーションを検証する代表例として知られているDNA損傷活性ブレオマイシンファミリーの抗生物質の自動毒性スクリーニングを実証するために以前に特徴付けautobioluminescentヒト胎児腎臓（HEK293）細胞ライン11を使用しています。
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Protocol
1。細胞調製
- 液体窒素凍結ストックから生物発光HEK293細胞のバイアルを回収し、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、抗生物質、抗真菌1×0.01 mMの非必須アミノ酸、およびT、0.01 mMのピルビン酸ナトリウムでそれらを成長させる37℃、5％CO 2で75組織培養フラスコ。
注：メディアと補足コンポーネントが細胞株によって異なりますので、それに応じて選択する必要があります。 - リフレッシュ中に到達するまで2〜3日ごとに〜80％合流。
注：必要な細胞の量は、実験計画に基づいて行われます。必要に応じて、より多くの細胞を継代培養することにより得ることができる。 - テストのために細胞を回収。
- 培地を除去し、リン酸塩で細胞を洗浄するには、優しく、フラスコを渦巻くことで緩衝生理食塩水（PBS）、その後破棄はPBSを過ごした。
- 2分間37℃でトリプシンとインキュベートを追加し、あるいは細胞までフラスコから切り離されました。
- PBS中剥がれた細胞を収集し、クリーンな遠心管に移す。
注：非接着細胞株を使用する場合は、遠心分離により細胞を分離し、PBSで1回洗浄する。
- 血球計または他の細胞カウントシステムを使用して総細胞数を決定します。
- 5分間300 xgで細胞懸濁液を遠心。上清を捨て、新鮮な、温めておいた培地で細胞を再懸濁します。
- 不透明なマルチウェルプレートの各ウェルへの細胞のシード同数。ブラック24ウェルプレートの各ウェルに、1mlの容積のこの例では、プレート5×10 5細胞。ネガティブコントロールとして機能する3つのウェル中の培地のプレートが等量。
注：各ウェルに播種細胞数が柔軟であり、個々の実験のために最適化することができる。各生物発光細胞株については、実験的に細胞数とbiolumiとの間の関係を決定するnescent出力だけでなく、最小限の検出可能な細胞は、前に、毒性試験に数える。標準化された撮像条件で人口サイズの広い範囲（例えば、1×10 3〜1×10 6細胞）を横切ってこの、メジャー生物発光をしています。 - 以下のように化合物（複数）のテストで細胞を扱う。
2。化学準備
- 濃厚原液としてテストされている化学物質を準備します。この例では、100mgの/ブレオマイシンファミリーの抗生mlの原液を使用しています。
注：有機溶剤、化学添加するための車両として使用されている場合は特に、潜在的な車両ベース毒性影響を最小限にするため、それは株式の濃度は、少なくとも1,000倍希望ポストアプリケーション濃度にすることをお勧めします。 - 細胞に直接製造化学株式を追加します。この例では、線量の最終濃度100、200、300、および400μgのトリ/ mlとその他の抗生物質井戸をひだのある。対照として未処理細胞の三井戸のままにしておきます。
注意：ターゲット化学物質の最終濃度は、特定の実験的な目標に基づいて選択されるべきである。広範囲の濃度は、通常、毒性作用の完全なスペクトルを得るためにテストされる。
3。イメージングとデータ解析
- すぐに化学添加後、画像取得と生物発光測定のために適切な機器のイメージングチャンバー内にプレートを配置。
- 生物発光、各読書のため10分の積分時間を使って24時間にわたり15分毎に測定します。
注：この例で使用される積分時間ごとのプレート単位であり、任意の他のルミノメーターを用いごとウェルに基づいて測定のために調整することができる。積分時間は、選択された生物細胞株に基づいて調整することができる。生物発光は、細胞破壊や任意の外部刺激せずに自律的に生産されているので、読んでイングスは、具体的な実験の目的を達成するために任意の所望の時点で採取することができる。 - 互換性のあるソフトウェアを使用して関心領域を識別することにより各ウェルから生物発光強度を定量化する。全光束（光子/秒）または各サンプルの平均輝度（フォトン/センチメートル/秒2 / steridian）のいずれかとして光出力を表示します。
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Representative Results
本研究では、autobioluminescent HEK293細胞の動態を、抗生物質露光（ 図1）に応答して24時間かけて連続的にモニターした。に結合し、DNA 13を切断することにより、生きた細胞を殺すことが知られているブレオマイシンファミリーのメンバーであり、この抗生物質の毒性効果は、擬似カラー画像から直接可視化することができる未処理の細胞と比較して生物生産の減少を介して実証された（ 図2）。簡単な用量反応分析のための任意の時点で異なる濃度の比較のために許可された様々な処理条件の下で試料を繰り返し並列スクリーニングを可能にし、これらの細胞の性質autobioluminescent、。例えば、生物発光は、18時間、15時間後に細胞から産生され、処置の20時間の増大は、その抗生物質治療のresulを示す、 図3の化学物質濃度に対してプロットした用量反応的に生物生産の減少でテッド。
図1。化学物質への曝露に応答して生物発光ダイナミクスの連続的な追跡。構成的生物発光HEK293細胞を、ブレオマイシンファミリーの様々な濃度の抗生物質に曝露した。生物生産は暴露の24時間の期間（1プレート、平均値±標準誤差に関する技術三重のために代表的なデータ）（14から転載）を介して監視した。
図2。処理された細胞の擬似カラー画像。
図3。化学物質曝露の用量反応15時間後に生物発光出力、18時間、および暴露の20時間は、（1プレート上の技術的な三重のために代表的なデータ、抗生物質治療の増加は用量反応的に光生産の減少をもたらしたことを示した平均値±標準誤差）。 R 2値は、線形回帰を算出する。
表1。代表の比較autobioluminescent（ ルクスベース）ヒト細胞または従来のホタルルシフェラーゼ（ リュック ）ベースの96ウェルプレートフォーマットでのアッセイのいずれかを用いて実証毒性画面。
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Discussion
この方法は、生きた細胞が継続的に生涯にわたって監視することができインビトロ細胞毒性スクリーニングアッセイとして自律的に生物発光哺乳類細胞の使用方法を示します。このプロトコルは柔軟性があり、必要に応じて具体的な実験条件に適応するように変更することができる。例えば、ここに示された実験は、急性毒性を追跡するのに適しているが、増加した時間間隔（ すなわち、24時間毎）に繰り返し撮影により遅効性または長期的な効果を評価するように適合さとの間の標準的な培養条件下で細胞を維持することができる朗読。また、積分時間は、生物細胞株に基づいて調整することができる。種々の積分時間で撮像予備実験は、最適な読取窓を決定するために行うことができる。この例で使用される10分の統合は、すべてのトリートメントを横切る生物生産のダイナミックレンジを強調するために選ばれたtの条件は、しかしながら、より短いリーディングフレームは、アプリケーションに応じて適用することができる。 24ウェルプレートを、この例で実証するために使用されている同様に、96 - 又は384ウェルプレートは、より高いスループットアプリケーション置換することができる。代表的な結果は、単板に関する技術三重を発揮ここに示されているが、それは目的の化合物をテストするときに、治療レベル間の統計的有意性を確立するために実施すべきである別のプレート上にその独立したアッセイに注意することが重要です。このアッセイは、検出感度を変化させた様々な楽器での使用に適合させることができるので、また、それが許容される信号対雑音及び信号対バックグラウンド比はごと器具基づいて決定されるべきであることが推奨される。
これは、以前は24ウェルプレートで最小の検出可能な細胞数はここ15記載の撮像条件の下で約1.5×10 4個の細胞であると決定された。しかしながら、確実な検出に必要なセルの最小数がよくサイズが変化し、より小さなウェルの使用は、単位面積当たりの生物発光セルの数を増やすことによって検出に必要なセルの数を減少させることに注意することが重要である。したがって、それは強く生物発光出力と人口規模の関係を審査する前に所望の撮影条件で決定されることをお勧めします。また、光電子増倍管ベースプレートリーダーもIVISルミナ撮像システムの代わりに、データ取得のために使用することができるが、疑似カラー画像を得るための不利益た。関係なく用いられる撮像器具の、不透明プレートは、信号損失および/またはプレートを横断する光子により隣接するウェルの生物汚染を最小限にするために使用されるべきである。
他の一般的な細胞培養ベースの採用アプローチに比べて、この方法では、データ収集がperformeできるという利点を提供しています試料の破壊または基質添加の必要性に加入した完全に自動化された方法でdが解消される。それはまた、細胞溶解要メソッドを使用する場合に必要とされる金銭または時間コストを増大させることなく、同時毒性動態の高い分解能を提供する露光長期間にわたって同じ細胞集団時の動的効果の連続的な追跡、を可能にする（ 表1）。しかしながら、この方法の重要な限界は、細胞型特異的テストは、スクリーニングのためautobioluminescent表現型を生成するために、関心のある各細胞型へルクスカセットの安定なトランスフェクションを必要とするある。その後、細胞を将来の使用のために液体窒素中で保存することができるので、これは一度だけ実行される必要があるが、トランスフェクション手順は、潜在的に時間のかかる作業である。
この前提条件にもかかわらず、ここで説明するプロトコルが必要であり、シンプルかつ安価である最小限の実践的な実験室の人員の作業は、任意の追加の試薬を必要とし、直接毒性解釈のために使用することができるデータを生成しない。これらの理由から、我々はautobioluminescent哺乳動物細胞株は、より詳細な評価を必要と下流化合物を選択するための多数の候補の迅速な予備スクリーニングのためのハイスループットアッセイとして用いることができると結論付けている。
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Disclosures
DM閉じる、SA RIPP、およびGS Sayler 490バイオテクノロジー社の創設者と所有者である
Acknowledgments
これらの研究活動は、化学、バイオ、環境、受賞番号CBET-0853780とCBET-1159344と国立衛生研究所、国立環境健康科学研究所（NIEHS）の下で輸送（CBET）システムの国立科学財団部門によってサポートされていました下の賞番号1R43ES022567-01、国立がん研究所、がんイメージングプログラム賞番号CA127745-01アンダー。本研究で使用IVISルミナ機器は米軍国防大学研究計測プログラムから得られた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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