Cell Klemme som en robust, Mikrofluid Intracellulær Delivery Platform

Summary

Hurtig mekanisk deformation af celler har vist sig som et lovende, vektor-fri metode til intracellulær levering af makromolekyler og nanomaterialer. Denne protokol indeholder detaljerede trin om, hvordan man bruger systemet til en bred vifte af applikationer.

Abstract

Hurtig mekanisk deformation af celler har vist sig som et lovende, vektor-fri metode til intracellulær levering af makromolekyler og nanomaterialer. Denne teknologi har vist potentiale i håndteringen tidligere udfordrende applikationer, herunder levering til primære immunceller, celle omprogrammering, kulstof nanorør og kvantepunktet levering. Denne vektor-fri microfluidic platform afhængig mekanisk sprængning af cellemembranen til at lette cytosolisk levering af målmaterialet. Heri beskriver vi den detaljerede metode til brug for disse mikrofluidenheder herunder enhed forsamling, cellepræparation og systemdrift. Denne levering tilgang kræver en kort optimering af enhedens type og driftsbetingelser for tidligere urapporteret applikationer. De medfølgende vejledning er generaliserbare til de fleste celletyper og levering materialer da dette system ikke kræver specialiserede buffere eller kemisk modifikation / konjugeringsreaktioner trin. Dette arbejde giver ogsås anbefalinger om hvordan man kan forbedre enhedens ydeevne og problemfri skyde potentielle problemer relateret til tilstopning, lav levering effektivitetsgevinster og cellernes levedygtighed.

Introduction

Levering af makromolekyler til cellen cytoplasma er et afgørende skridt i terapeutiske og forskningsmæssige applikationer. Nanopartikel medieret levering, for eksempel, har vist potentiale i genterapi ^1,2, mens protein levering er en lovende middel til at påvirke cellulære funktion i både kliniske ³ og laboratorie ⁴ indstillinger. Andre materialer, såsom små molekyle narkotika, kvantepunkter eller guld nanopartikler, er af interesse i ansøgninger fra kræftmedicin ^5,6 til intracellulær mærkning ^7,8, og enkelt molekyle sporing ^9.

Cellemembranen er hovedsagelig impermeabel for makromolekyler. Mange eksisterende teknikker bruger polymere nanopartikler ^10,11, liposomer ^12, eller kemiske modifikationer ¹³ for at lette membran afbrydelse eller endocytotisk levering. I disse metoder, levering effektivitet og celle levedygtighed er ofte afhængige af strukturen i the målmolekyle og celletype. Disse metoder kan være effektive ved levering af strukturelt ensartede materialer, såsom nukleinsyrer, men er ofte dårligt egnet til levering af mere strukturelt forskellige materialer, såsom proteiner ^14,15 og nanomaterialer ^7. Desuden endosomet forstyrrelser mekanisme, at de fleste af disse metoder er afhængige af, er ​​ofte ineffektiv og dermed efterlader meget materiale fanget i vesikel strukturer ^16. Endelig mener metoder, der ofte er udviklet til brug med etablerede cellelinjer ikke oversætte godt til primære celler.

Membran perforeringselementer fremgangsmåder, såsom elektroporering ^17,18 og sonoporation ^19, er et attraktivt alternativ i visse anvendelser, men de er kendt for at forårsage levedygtighed lav celle og kan begrænses ved ladningen af mållevering materiale.

Hurtig mekanisk deformation af celler, en mikrofluid tilgang til levering, har for nylig demonstrated sine fordele i forhold til de nuværende teknikker i forbindelse med celle omprogrammering ²⁰ og nanomateriale levering ^21. Denne metode er baseret på mekanisk sprængning o cellemembranen at lette cytosolisk levering af materiale til stede i den omgivende buffer. Systemet har vist så potentiale i tidligere udfordrende celletyper (f.eks primære immunceller og stamceller) og materialer (fx antistoffer og kulstof nanorør). Heri er generelle fremgangsmåde til at anvende disse anordninger til intracellulær levering af target makromolekyler beskrevet. Proceduren er generaliserbare til de fleste celletyper og levering materialer, anbefales det dog, at man foretager en kortfattet optimering af betingelser, som nærmere beskrevet i vores tidligere rapporteret design guidelines ^20, for eventuelle tidligere urapporteret applikationer. Til dato, er systemet blevet anvendt med succes til levering af RNA, DNA, guld nanopartikler, kvantepunkter, kulstof-nanorør, proteins, og dextran polymerer ^20,21.

Protocol

1.. Opbevaring

1. Opbevar reservoirerne, holdere, O-ringe og mikrofluidenheder i 70% ethanol. Brug en beholder (f.eks krukke eller bægerglas), som har et låg for at forhindre fordampning og forurening med støv eller uden partikler. Placer enhederne i en beholder (1), reservoirer og O-ringe i en anden beholder (2), og indehavere i den tredje (3).

Bemærk: Brugen af ​​70% ethanol til opbevaring er at opretholde sterilitet. Hvis de eneste dele af løsningen er ethanol og vand (dvs. ingen denatureringsmidler) skal alle systemkomponenter være fuldt kompatible og vil ikke nedbrydes over tid.

2. Skift ethanolopløsning i beholdere (2) og (3) før hver brug for at forhindre krydskontaminering tværs eksperimenter og minimere forekomsten af ​​uønskede partikler, der kan forårsage tilstopning.

2. Eksperiment Forberedelse

1. Placer containere (2) og (3) i et ultralydsbad for 5-10 min før hver brug. Dette hjælper med at fjerne eventuelle forurenende partikler fra tidligere forsøg.
2. Ren arbejdsplads i biosikkerhed kabinet med 70% ethanol-opløsning.
3. Spray alle materialer (3 containere og pincetter) med en 70% ethanol opløsning, før du lægger dem ind i biosikkerhed kabinet.

3. Assembly

1. Sæt ned 2-3 næsten fnugfri klude i arbejdsområdet.
2. Fjern plastik reservoirer fra deres beholder med en pincet og sæt dem på klude til at fremskynde fordampningen af ​​ethanol løsning fra indvendige overflader. Blidt tryk reservoirerne på overfladen eller blæse luft igennem dem for at lette fjernelse af ethanol løsning.
3. Indsæt O-ringe i deres korrekte holder på reservoirerne.
4. Fjern holderen og chips fra de respektive beholdere og tillade ethanol fordampe (~ 1-2 min.)
5. Brug en pincet til at placere den ønskede chip face-up (dvs. adgang huller op) i holderen. Hæv indehaverenmed chippen til øjenhøjde for at sikre, at chippen ligger fladt i holderen og justeres om nødvendigt med en pincet. VIGTIGT: Hvis enheden ikke passer ordentligt i holderen, er der risiko for, at det vil bryde i løbet af de efterfølgende trin.
6. Næste, sæt blidt reservoirerne på holderen og tilpasse dem med clips. Pas på, at O-ringene ikke falder ud af deres slots i løbet af denne proces.
7. Tryk forsigtigt ned på reservoirerne indtil de klikker på plads. Sikre, at begge sider af reservoirerne er sikre, og at chippen synes at være i den korrekte position.

4.. Cell Preparation

1. For klæbende celler (primære eller etablerede linjer): Plade celler 1-2 dage forud for forsøget, således at de ikke er mere end 80% sammenflydende på dagen for eksperimentet.
2. Placer celler i suspension (i PBS eller relevant medie) og sigte mod en koncentration på 1,0 x 10 ⁶ celler / ml til 1,0 x 10 ⁷ cel driftls / ml. BEMÆRK: Vi har ikke observeret signifikante ændringer i leveringen ydeevne på grund af koncentration celle.
3. Bland cellerne og den ønskede levering materiale i et separat rør til opnåelse af det ønskede materiale koncentration for eksperimentet. VIGTIGT: Da den beskrevne levering Metoden bygger på diffusion til at lette leveringen, vil en højere koncentration materiale giver højere levering. Hvis det er muligt, anbefales det at anvende en 1 uM opløsning af det ønskede materiale til de første forsøg. Denne koncentration kan derefter titreret i fremtidige eksperimenter efter behov. Den laveste rapporterede koncentration bruges med denne enhed er 10 nM ^21.

5.. Betjening

1. Pipette blanding af celler og levering materiale i et reservoir (nuværende design har en max 150 ul kapacitet). BEMÆRK: De fleste apparatkonstruktioner er fuldt reversible derfor strømningsretning gennem kanalerne ligegyldigt. Prøver kan indlæses i en af ​​de to reservoirer. Fastgør trykslangen til den fyldte reservoir og spænd møtrikken for at sikre korrekt tætning (fingrene er ofte tilstrækkeligt).
2. Indstil trykket til det ønskede niveau på regulatoren. Denne styrer den hastighed, hvormed cellerne bevæger sig gennem enheden. Bemærk, at celle flow ikke starter, før der trykkes på knappen.

BEMÆRK: I tidligere arbejde har nitrogen eller trykluft fungerede lige så godt som bæregas.

4. Hæv enheden til øjenhøjde, og orientere den, så væsken i reservoiret er let synligt. BEMÆRK: Spor væskesøjle at afbryde systemet, før reservoiret er tømt.
5. Tryk på knappen for at presse reservoiret og begynde celle flow.
6. Når væskeniveauet er cirka 2 mm fra bunden af ​​reservoiret, hurtigt vende regulatoren til 0 psi til at stoppe strømmen. VIGTIGT: Hvis man undlader at stoppe strømmen, før reservoiret er tømt, risikerer man at skubbe prøven fra collection reservoiret. Bemærk også, at hvis væskesøjlen ikke bevæger sig på en mærkbar hastighed eller er aftaget væsentligt i forhold til den oprindelige strømningshastighed (f.eks 3x langsommere) er monteret enhed sandsynligvis tilstoppet og skal udskiftes. Betjening af en tilstoppet enhed kan føre til højere celledød.
7. Saml de behandlede celler fra det passende reservoir og placere dem i den ønskede samling rør / plade. VIGTIGT: Må ikke fortyndes de indsamlede celler i eventuelle buffere på dette stadium, da porerede celler vil fortsætte med at optagelse materiale i op til 10 min ^20. Efter dette vindue er gået, fortyndes cellerne i det ønskede medie / buffer.
8. Til at indsamle flere behandlede celler eller prøv alternative eksperimentelle betingelser, skal du gentage trin 5,1-5,7 efter behov. Husk på, at chips er reversibel, kan derfor prøver monteres enten i reservoiret. Vær sikker på at udveksle chips som er nødvendig, hvis de tilstoppes. Kassér tilstoppede enheder.

6.. Demontering

1. Placer hver del i den passende opbevaringsbeholder (beskrevet i afsnit 1).
2. Sted, der bruges chips i en separat beholder til bortskaffelse.

Representative Results

Figur 1 indeholder en beskrivende skematisk mikrofluid delivery system. Figurerne 2a-b illustrerer typiske resultater fra behandling af HeLa-celler med forskellige apparatkonstruktioner i nærvær af fluorescens-konjugeret 3 kDa dextran ^20. Hvis proceduren er fulgt korrekt, vil systemets ydeevne være følsom over for enhedstype og driftshastighed. Derfor bør man optimere disse forhold til en given anvendelse, før man går videre til mere komplekse eksperimenter. I rækken af driftsbetingelser vist i figuren, er cellelevedygtighed over 80%, men skal man bemærke, at suboptimal levering parametre (f.eks upassende chip type) kan føre til levedygtighed under 30%. Således levedygtighed og levering effektivitet skal optimeres samtidig for eventuelle tidligere urapporteret celletype. Hvis en enhed design er upassende for målet celletype, vil man se resultater, der spænder fra ingen levering til høj cell død (fx 10% levedygtighed). Hvis de eksperimentelle betingelser var upassende, f.eks målmaterialet bundet til celleoverfladen, kan man ikke være i stand til at måle levering præcist som overfladen bindende signal kan maskere den cytoplasmatiske signal.

Figur 2c-d illustrerer vores foretrukne metode til måling af levering effektivitet inden for den levende cellepopulation. Styringen tilfældet i figur 2c er beregnet til at afspejle alle overflade bindende og endocytotiske virkninger cellerne udsættes for levering materiale til mindst lige så lang som de behandlede tilfælde. Den leverede cellepopulation er defineret som skraveret område, således at kun 1-5% af kontrollen befolkning falder inden for denne region. Bemærk, at tidligere arbejde har fastslået, at levering i denne tilgang ikke er medieret ved endocytose ^20. Den dobbelt-top fordeling observeret i den leverede eksempel er ikke nødvendigvis er karakteristisk for systemet, som vi have observeret mere og mindre ensartede fordelinger for forskellige eksperimentelle betingelser.

Figur 1.. S chematic af hele systemet og dets interface til mikrofluidenheder. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Repræsentative resultater med HeLa-celler ^20. A) levering effektivitet og b), cellelevedygtigheden af HeLa-celler behandlet med 3 forskellige apparatkonstruktioner i nærvær af kaskade blå konjugeret 3 kDa dextran (0,2 mg / ml). I disse eksperimenter cellen solution var ved en koncentration på 10 ⁶ celler pr ml i PBS indeholdende 3% kalvefosterserum og 1% F68 Pluronics. Levedygtighed blev målt ved propidiumiodidfarvning af døde celler og levering Resultaterne er vist kun levende celler. Alle datapunkter blev kørt i tre eksemplarer og fejlsøjler repræsenterer 2 SDS. C) en repræsentant histogram for en eksperimentel kontrol, hvor HeLa-celler blev udsat for kaskade blå konjugeret 3 kDa dextran mindst den samme mængde tid, som en enhed behandlet sagen. d) Den tilsvarende tilfælde, hvor cellerne blev passeret gennem indretningen for at lette levering. Fraktionen af den levende celle befolkning, der er i unshaded region af histogrammet er defineret som »leveret« befolkning. Klik her for at se større billede .

Discussion

Visse aspekter af den beskrevne eksperimentelle procedure (dvs. andre end chip design og driftshastighed faktorer), kan skal optimeres afhængig af celletype og levering materiale systemet påføres. Den diskussion, der følger adresser nogle af de mest almindelige faktorer at overveje, når designe eksperimenter.

For at forbedre leveringen signalet for fluorescens-mærkede forbindelser, er man nødt til at tage fat på kilderne til baggrundsfluorescens. Surface binding og endocytose, for eksempel, kan løses ved at vaske cellerne 5-10 min efter levering for at fjerne overskydende materiale, før kultur eller videre forarbejdning. Hvis vælge at give afkald på et vasketrin, ville det være bedst at fortynde de behandlede celler ved 5-10x i det ønskede medie til at sænke koncentrationen af ​​målmaterialet i den omgivende opløsning og dermed reducere endocytotiske satser. I nogle tilfælde, for eksempel protein levering, kan man finde det nødvendigt aktivt at blokere celle surface (fx anvendelse af umærket bovint serumalbumin) for at minimere ikke-specifik binding af leverancen materiale. I en given applikation, hvis fluorescensintensiteten af ​​det ubehandlede tilfælde målt ved flowcytometri, er mere end et årti lavere end endocytose kontrol derefter overfladen binding / endocytose kan være et problem. Bemærk, at problemer med baggrund signal er kun relevante for direkte fluorescerende påvisning af leverancen materiale, funktionelle assays (f.eks celle omprogrammering) er sædvanligvis upåvirket som endocytose eller overflade bundet materiale er ofte inaktive.

For at forbedre levedygtigheden af ​​celler efter behandling, er man nødt til at minimere mængden af ​​behandling efter levering. Det anbefales, at man undgå overdreven centrifugering eller vaske trin og overføre celler i deres ønskede medier i en inkubator 5-10 min efter leveringen er komplet. I klæbende linjer, bliver cellerne ofte fuldt levet og dividere indenfor 24 timer efter behandlingen. Som diskuteret forrigeiously ^20, har vi ikke observeret nogen langsigtede bivirkninger ved brugen af denne teknik.

De mikrofluidenheder anvendes i dette delivery system er tilbøjelige til at tilstopning over tid. Træsko danner ofte ved indsnævringen, da det er den smalleste funktion på enheden. Tilstopning kan være forårsaget af beskadigede celler eller ved miljøbelastende stoffer. Sidstnævnte effekt kan minimeres ved at sikre en ren, støvfri omgivelser til betjening af enheder (fx en velholdt biosikkerhed kabinet). For cellelinjer, anbefaler vi passaging celler 1-2 dage før levering for at minimere forekomsten af ​​cellen vragrester i den resulterende suspension. Ved brug af enheden, skal man være opmærksom på volumenstrømmen af ​​væsken i reservoiret. Hvis flowhastigheden falder til under en tredjedel af den oprindelige sats, kan enheden være årsag overdreven celledød og bør udveksles, eller flowretningen vendes. Potentielle tilstopning spørgsmål kan også mitigated ved at lede cellesuspensionen gennem en 40 um cellefilter mesh. Denne proces sikrer en enkelt celle suspension hvorved potentielle træsko fra formning i de bredere, lave flow dele af chippen.

Ved udformningen af ​​eksperimenter for forskellige levering materialer, skal man tage højde for størrelsen af ​​målet materiale og dets koncentration. Da denne teknologi beror på passiv diffusion af materialet over det afbrudte cellemembranen, vil den molære koncentration gradient og den hydrodynamiske radius af leveringen materiale regulerer hastigheden af ​​massetransport - under forudsætning af forstyrrelser membran er store nok til at rumme materialet. Det er således tilrådeligt at bruge høje molære koncentrationer (fx 1 uM) store målmaterialer i forhold til deres mindre counter dele. Teknikken har vist effektiv levering ved koncentrationer så lave som 10 nM i tilfælde af kvantepunktet levering ^21.. Endvidere er teknikken not menes at være begrænset af arten af det mållevering materiale bortset fra i forbindelse med materiale, størrelse og diffusivitet (dvs. lave diffusivitet materialer vil have lavere levering effektivitet og væsentlig større end størrelsen af de forstyrrelser, sandsynligvis ikke kan trænge ind i cytoplasmaet).

Studier i celle omprogrammering og kvantepunktet levering illustreret de stærke sider af cellen klemme tilgang i forhold til elektroporation. Baseret på den nuværende forståelse af membransprængning mekanismer i disse to teknikker, ser det ud til, at celle klemme har en betydelig fordel i applikationer, der omfatter proteiner, små molekyler, og nanomaterialer ^20,21. Kontrasten mellem de to metoder, som involverer nukleinsyrer (som er stærkt ladede i forhold til de førnævnte materialer) er uklar.

Denne mikrofluid tilgang til levering afhængig mekanisk sprængning af cellemembranen tillette passiv diffusion af materialet i cellen, og har vist sig at være anvendelig til en række celletyper ^20. Systemet er således i princippet egnet til cytosoliske levering af næsten ethvert materiale til næsten enhver celletype. Vi tror, ​​at systemets fordele er mest udtalte i sager, der involverer traditionelt svært at transfektere primære celler (f.eks immun og stamceller), og konventionelt udfordrende materialer (f.eks proteiner, kvantepunkter, kulstof-nanorør, og RNA). Den førnævnte potentiale i immun-og stamcelle-applikationer understreges af manglerne i de traditionelle levering metoder i løsningen af ​​disse celletyper. Imidlertid kan systemet kræve yderligere forbedres for at lette gen-levering af plasmidvektorer som disse anvendelser kræver levering til kernen. Sammenfattende mener vi mikrofluid deformation tilgang til levering potentielt kan løse mange eksisterende udfordringer til intracellulær levering. Den system uafhængighed fra kemiske vektorer eller elektriske felter giver sin robuste ansøgning til en række undersøgelser. Instruktionerne heri bør sætte alle interesserede forskere til at betjene et sådant system selvstændigt og tilpasse det til deres forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Holder & Plastic reservoir	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa Analyzer	Becton Dickinson	N/A	Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device	SQZ Biotechnologies	Cell Squeeze
O-Rings	McMaster	9452K311
Pressure system to operate device	SQZ Biotechnologies	Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath