Summary
Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d'utiliser le système pour une large gamme d'applications.
Abstract
Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Cette technologie a démontré un potentiel dans le traitement des demandes auparavant difficiles, y compris, la livraison de cellules primaires du système immunitaire, la reprogrammation cellulaire, nanotubes de carbone, et la prestation de point quantique. Cette plate-forme microfluidique indemne de vecteurs repose sur une rupture mécanique de la membrane de la cellule pour faciliter la délivrance cytosolique de la matière cible. Nous décrivons ici la méthode détaillée de l'utilisation de ces dispositifs microfluidiques, y compris, le montage du dispositif, de la préparation cellulaire, et le fonctionnement du système. Cette approche de livraison nécessite un bref optimisation du type d'appareil et les conditions d'exploitation pour les applications non signalés précédemment. Les instructions fournies sont généralisables à la plupart des types de cellules et des matières de livraison, ce système ne nécessite pas des tampons spécialisés ou des étapes de modification chimique / d'orthographe. Ce travail permet également des des recommandations sur la façon d'améliorer les performances de l'appareil et dépanner les problèmes potentiels liés à l'obstruction, l'efficacité de la prestation faibles, et la viabilité cellulaire.
Introduction
Délivrance de macromolécules vers le cytoplasme de la cellule est une étape critique dans les applications thérapeutiques et de recherche. Nanoparticules médiation livraison, par exemple, a montré un potentiel en thérapie génique 1,2, tandis que la prestation de protéine est un moyen prometteur d'affecter la fonction cellulaire à la fois clinique et de laboratoire 3 4 paramètres. D'autres matériaux, tels que les médicaments à petites molécules, des points quantiques, ou des nanoparticules d'or, sont d'un intérêt dans des applications allant de la thérapeutique du cancer de 5,6 à 7,8 marquage intracellulaire, et seule molécule de suivi 9.
La membrane cellulaire est en grande partie imperméable aux macromolécules. De nombreuses techniques existantes utilisent des nanoparticules polymériques 10,11 liposomes 12, ou des modifications chimiques 13 à faciliter la rupture de la membrane ou de la livraison d'endocytose. Dans ces procédés, l'efficacité d'administration et de la viabilité des cellules est souvent dépendante de la structure de the molécule cible et du type de cellule. Ces méthodes peuvent être efficaces à la livraison de produits de structure uniforme, tels que les acides nucléiques, mais sont souvent mal adaptés pour la livraison de plus structurellement divers matériaux, tels que les protéines et les nanomatériaux 14,15 7. En outre, le mécanisme de rupture d'endosome que la plupart de ces méthodes s'appuient sur est souvent inefficace, cela laisse donc beaucoup de matériel piégé dans les structures vésiculaires 16. Enfin, les méthodes qui sont souvent développés pour une utilisation avec des lignées cellulaires établies ne se traduisent pas bien de cellules primaires.
Membrane de poration méthodes telles que l'électroporation, 17,18 et 19 sonoporation, sont une alternative intéressante dans certaines applications, mais ils sont connus pour provoquer une faible viabilité des cellules et peut être limitée par la charge du matériau de fourniture de cible.
Déformation mécanique rapide des cellules, une approche microfluidique à la livraison, a récemment demonstrés ses avantages par rapport aux techniques actuelles, dans le contexte de la reprogrammation de la cellule 20 et la livraison de nanomatériau 21. Cette méthode repose sur la rupture mécanique o la membrane de la cellule pour faciliter la délivrance cytosolique de matériaux présents dans le tampon environnant. Le système a démontré un potentiel permettant de contester auparavant types de cellules (cellules immunitaires primaires et les cellules souches par exemple) et les matériaux (par exemple des anticorps et des nanotubes de carbone). Ici, le mode opératoire général d'utiliser ces dispositifs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules cibles est décrite. La procédure est généralisable à la plupart des types de cellules et de matériaux de livraison, mais il est recommandé que l'on mener une brève optimisation des conditions, comme indiqué dans nos directives de conception signalés précédemment 20, pour les applications non signalés précédemment. A ce jour, le système a été utilisé avec succès pour la fourniture de l'ARN, de l'ADN, des nanoparticules d'or, des points quantiques, des nanotubes de carbone, des protéiness, et des polymères de dextrane 20,21.
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Protocol
Une. Stockage
- Stocker les réservoirs, supports, joints toriques et des dispositifs microfluidiques dans 70% d'éthanol. Utilisation d'un récipient (par exemple, bocal ou bécher) muni d'un couvercle pour empêcher l'évaporation et la contamination par des particules de poussière ou à l'extérieur. Placez les appareils dans un récipient (1), les réservoirs et les joints toriques dans un second récipient (2), et les détenteurs de la troisième (3).
Remarque: L'utilisation d'éthanol à 70% pour le stockage est de maintenir la stérilité. Si les seuls composants de la solution sont l'éthanol et de l'eau (pas de des agents de dénaturation), tous les composants du système doivent être totalement compatibles et ne se dégradent pas au fil du temps.
- Changer solution d'éthanol dans des récipients (2) et (3) avant chaque utilisation pour éviter la contamination croisée entre les expériences et minimiser la présence de particules indésirables qui peuvent causer l'obstruction.
2. Expérience Préparation
- Placer les récipients (2) et (3) dans un bain à ultrasons for 10.5 min avant chaque utilisation. Cela permet de supprimer toutes les particules contaminantes à partir des expériences précédentes.
- Propre espace de travail en matière de biosécurité armoire avec une solution d'éthanol à 70%.
- Pulvériser tous les matériaux (3 conteneurs, et pinces à épiler) avec une solution d'éthanol à 70% avant de les placer à l'intérieur du poste de sécurité microbiologique.
3. Assemblage
- Fixées 2-3 lingettes faible charpie dans la zone de travail.
- Retirer les réservoirs en matière plastique à partir de leur récipient avec des pinces et les mettre sur les lingettes pour faciliter l'évaporation de la solution d'éthanol à partir de surfaces intérieures. Tapoter doucement les réservoirs sur la surface ou souffler de l'air à travers eux pour faciliter l'élimination de la solution de l'éthanol.
- Insérer les joints toriques dans leur emplacement approprié sur les réservoirs.
- Retirez le support et les jetons de conteneurs respectifs et permettre à l'éthanol s'évapore (~ 1-2 min).
- Utilisez des pinces pour placer la puce face-up désirée (c.-à-trous d'accès haut) dans le support. Soulevez le supportavec la puce à Eyelevel pour s'assurer que la puce est bien à plat dans le support et ajuster si nécessaire avec la pince à épiler. IMPORTANT: Si l'appareil ne s'adapte pas correctement dans son support, il ya un risque que ça casse lors des étapes ultérieures.
- Ensuite, placez doucement les réservoirs sur le support et les aligner sur les clips. Veillez à ce que les joints toriques ne tombent pas de leurs logements pendant ce processus.
- Appuyez doucement sur les réservoirs jusqu'à ce qu'ils s'enclenchent. Veiller à ce que les deux côtés des réservoirs sont en sécurité et que la puce semble être dans la bonne position.
4. Préparation cellulaire
- Pour les cellules adhérentes (lignes primaires ou établies): les cellules des plaques de 1 à 2 jours avant l'expérience, de telle sorte qu'ils ne sont plus que 80% de confluence le jour de l'expérience.
- Placez les cellules en suspension (dans du PBS ou support approprié) et viser une concentration d'exploitation de 1,0 x 10 6 cellules / ml à 1,0 x 10 7 cells / ml. NOTE: Nous n'avons pas observé de modifications significatives de la performance de livraison dû à la concentration cellulaire.
- Mélanger les cellules et le matériau de libération souhaité dans un tube séparé pour obtenir la concentration désirée de matière pour l'expérience. IMPORTANT: En raison de la méthode de livraison décrit repose sur la diffusion de faciliter la livraison, une concentration de matière supérieur donnera livraison ultérieure. Si possible, il est recommandé d'utiliser une solution de 1 pM de la matière désirée pour les premiers essais. Cette concentration peut alors être augmentée dans de futures expériences en tant que de besoin. La concentration la plus faible signalée utilisée avec cet appareil est de 10 nM 21.
5. Opération
- mélange de pipette de cellules et le matériel de livraison dans un réservoir (conception actuelle a un max capacité de 150 pi). REMARQUE: La plupart des modèles d'appareil sont totalement réversibles donc direction d'écoulement dans les canaux n'a pas d'importance. Des échantillons peuvent être chargés dans l'un des deux réservoirs. Fixer le tube de pression dans le réservoir rempli et serrez l'écrou pour assurer une bonne étanchéité (à la main est souvent suffisante).
- Régler la pression au niveau désiré sur le régulateur. Ce contrôle la vitesse à laquelle les cellules se déplacent à travers le dispositif. Notez que les flux de cellule ne démarre pas tant que le bouton est pressé.
REMARQUE: Dans des travaux antérieurs, de l'azote ou de l'air comprimé ont travaillé aussi bien comme gaz porteur.
- Dispositif pour élever le niveau des yeux et de l'orienter de sorte que le liquide dans le réservoir est facilement visible. NOTE: Suivre la colonne de liquide pour éteindre le système avant que le réservoir est vidé.
- Appuyez sur le bouton pour mettre sous pression le réservoir et commencer flux de cellules.
- Lorsque le niveau du liquide se trouve à environ 2 mm du fond du réservoir, tourner rapidement le régulateur à 0 psi pour arrêter l'écoulement. IMPORTANT: Si l'on ne parvient pas à arrêter l'écoulement avant que le réservoir est vide, on risque d'éjecter l'échantillon de la collection réservoir. Notez aussi que si la colonne de fluide ne se déplace pas à un rythme appréciable, ou a ralenti sensiblement par rapport à son débit initial (par exemple 3x plus lent), le dispositif monté est probablement bouché et doit être échangée. Fonctionnement d'un dispositif bouché peut conduire à la mort cellulaire plus élevé.
- Recueillir les cellules traitées à partir du réservoir approprié et placez-les dans le tube de collecte / plaque désirée. IMPORTANT: Ne pas diluer les cellules recueillies dans tous les tampons à ce stade que les cellules porée continueront d'absorption matériau jusqu'à 10 min 20. Après cette fenêtre a passé, diluer les cellules dans les médias / tampon désiré.
- Pour recueillir des cellules traitées plus ou essayez conditions expérimentales alternatives, répétez les étapes 5.1 à 5.7 selon les besoins. Rappelons que les puces sont réversibles, par conséquent, les échantillons peuvent être montées dans les deux réservoirs. Assurez-vous d'échanger les jetons au besoin si ils bouchent. Jeter dispositifs obstrués.
6. Démontage
- Placez chaque partie dans le récipient de stockage approprié (décrit dans la section 1).
- Placez puces utilisées dans un récipient séparé pour l'élimination.
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Representative Results
La figure 1 contient un schéma descriptif du système de délivrance microfluidique. Figures 2a-b illustrent des résultats représentatifs de traitement de cellules HeLa avec différents modèles d'appareil en présence de fluorescence conjugué dextrane 20 3 kDa. Si la procédure est correctement suivie, la performance du système sera sensible à type d'appareil et la vitesse de fonctionnement. Par conséquent, il faut optimiser ces conditions pour une application donnée avant de procéder à des expériences plus complexes. Dans la gamme des conditions opératoires illustrées dans la figure, la viabilité cellulaire reste au-dessus de 80%, cependant, il faut noter que les paramètres optimaux de livraison (type de puce par exemple inapproprié) pourrait conduire à viabilités en dessous de 30%. Ainsi la viabilité et l'efficacité de la livraison doivent être optimisés simultanément pour n'importe quel type de cellule précédemment non déclarée. Si une conception de l'appareil n'est pas approprié pour le type de cellule cible, on verra des résultats allant de pas de livraison à haute cell mort (par exemple 10% de viabilité). Si les conditions expérimentales étaient inappropriées, par exemple le matériau de la cible liée à la surface cellulaire, ne peut pas être capable de mesurer avec précision la livraison en tant que signal de liaison de surface peut masquer le signal cytoplasmique.
Figures 2c-d illustrent notre méthode préférée pour mesurer l'efficacité de la livraison dans la population de cellules vivantes. Le boîtier de commande de la figure 2c est destiné à refléter toute surface de liaison et les effets d'endocytose dans les cellules sont exposées à la matière de délivrance pour au moins aussi longtemps que les cas traités. La population de cellules délivré est définie comme la région non ombrée de telle sorte que seulement 1-5% de la population de contrôle est comprise dans cette région. Notez que des travaux antérieurs ont établi que la livraison de cette approche n'est pas médiée par endocytose 20. La distribution à double pic observé dans l'exemple livré n'est pas nécessairement caractéristique du système que nous avons have observée plus ou moins uniformes distributions pour différentes conditions expérimentales.
Figure 1. S Chematic de l'ensemble du système et de son interface pour les dispositifs microfluidiques. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Les résultats représentatifs avec des cellules HeLa 20. A) l'efficacité de la livraison et b) la viabilité cellulaire des cellules HeLa traitées par 3 conceptions différentes de l'appareil en présence de bleu cascade conjugué 3 kDa dextran (0,2 mg / ml). Dans ces expériences, la cellule solution était à une concentration de 10 6 cellules par ml dans du PBS contenant 3% de sérum de veau fœtal et 1% de Pluronic F68. La viabilité a été mesurée par l'iodure de propidium coloration des cellules mortes et des résultats de livraison sont indiqués pour les cellules vivantes seulement. Tous les points de données ont été effectuées en triple exemplaire, et des barres d'erreur représentent 2 DS. C) Un histogramme représentant pour un contrôle expérimental où les cellules HeLa ont été exposés à cascade bleu conjugué 3 kDa dextran pendant au moins la même quantité de temps comme un cas de dispositif traités. d) Le cas correspondant où les cellules ont été passés à travers le dispositif pour faciliter la livraison. La fraction de la population de cellules vivantes qui se trouve dans la région non ombrée de l'histogramme est défini comme la population «livré». Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Peuvent avoir besoin d'être optimisé en fonction du type cellulaire et de matériau de libération du système est appliqué à certains aspects de la procédure expérimentale décrite (à savoir les facteurs autres que la conception de la puce et de la vitesse de fonctionnement). La discussion qui suit aborde certaines des facteurs les plus communs à considérer lors de la conception des expériences.
Pour améliorer le signal de livraison pour les composés marqués par fluorescence, il faut s'attaquer aux causes des fluorescence de fond. Surface de liaison et l'endocytose, par exemple, peuvent être traités par lavage des cellules 5-10 min après l'accouchement pour éliminer les matières en excès avant la culture ou à la transformation. Si l'élection de renoncer à une étape de lavage, il serait préférable de diluer les cellules traitées par 5-10x dans le support souhaité pour abaisser la concentration de matériau cible dans la solution environnante et donc de réduire les taux d'endocytose. Dans certains cas, pour la livraison par exemple des protéines, on peut juger nécessaire de bloquer activement la surfa cellulaireCe (par exemple en utilisant non marqué de l'albumine de sérum bovin) pour minimiser la liaison non spécifique de la matière de distribution. Dans une application donnée, si l'intensité de fluorescence de l'affaire traitée, tel que mesuré par cytométrie de flux, est plus d'une décennie plus bas que le contrôle de l'endocytose alors la surface de liaison / endocytose peut être un problème. Notez que des problèmes avec le signal de fond ne sont pertinentes que pour la détection par fluorescence directe du matériau de livraison, des essais fonctionnels (par exemple de reprogrammation cellulaire) sont généralement affectés comme endocytose ou matériau lié de surface sont souvent inactifs.
Afin d'améliorer la viabilité des cellules après le traitement, on a besoin de réduire au minimum la quantité de post-traitement de la livraison. Il est recommandé que l'on éviter centrifugation excessive ou des étapes de lavage et les cellules de transfert dans leur support souhaité dans un incubateur 5-10 min après la livraison est complète. Dans les lignes adhérentes, les cellules sont souvent entièrement respectées et en divisant dans les 24 heures après le traitement. Comme discuté previously 20, nous n'avons pas observé de long terme des effets secondaires de l'utilisation de cette technique.
Les dispositifs microfluidiques utilisés dans le présent système de délivrance ont tendance à encrasser le temps. Sabots forment souvent à la constriction comme il est la caractéristique la plus étroite de l'appareil. Le colmatage peut être provoquée par les cellules endommagées ou les contaminants environnementaux. L'effet de ce dernier peut être réduite au minimum en assurant un environnement propre, sans poussière pour faire fonctionner les appareils (par exemple une armoire de biosécurité bien entretenu). Pour les lignées cellulaires, il est recommandé de passages des cellules de 1-2 jours avant l'accouchement de façon à minimiser la présence de débris cellulaires dans la suspension résultante. Lors de l'utilisation de l'appareil, il faut être conscient de la vitesse volumique du fluide dans le réservoir. Si le débit tombe à moins d'un tiers de sa vitesse initiale, le dispositif peut être à l'origine la mort cellulaire excessive et devrait être échangé, ou le sens de l'écoulement inversé. Problèmes de colmatage potentiels peuvent également être mitigés par passage de la suspension de cellules à travers un tamis de maille 40 um cellule. Ce procédé assure une suspension de cellules uniques en empêchant ainsi la formation de sabots éventuels dans les sections de débit faible, plus larges de la puce.
Lors de la conception des expériences pour différents matériaux de livraison, il faut tenir compte de la taille de la matière de la cible et de sa concentration. Comme cette technologie repose sur la diffusion passive de la matière à travers la membrane de cellules rompues, le gradient de concentration molaire et le rayon hydrodynamique de la matière de livraison régissent la vitesse de transfert de masse - en supposant que les ruptures de membranes sont suffisamment grand pour recevoir le matériau. Il est donc conseillé d'utiliser des concentrations molaires élevées (par exemple 1 uM) de grandes matériaux cibles par rapport à leurs homologues plus petites. La technique a démontré une prestation efficace à des concentrations aussi faibles que 10 nM dans le cas de la prestation de point quantique 21. De plus, la technique est npensé ot à être limitée par la nature du matériau de fourniture de cible sauf dans le contexte de la taille matériau et de la diffusivité (c. matériaux de diffusivité basses auront efficacités de dévidage inférieures et les matières plus grande que la taille des ruptures ne peut probablement pas pénétrer dans le cytoplasme).
Études dans la reprogrammation cellulaire et la livraison des points quantiques ont illustré les forces de l'approche compression de cellule par rapport à l'électroporation. Sur la base de la compréhension actuelle des mécanismes de rupture de la membrane de ces deux techniques, il semblerait que la compression de la cellule présente un avantage important dans des applications impliquant des protéines, de petites molécules, et les nanomatériaux 20,21. Le contraste entre les deux méthodes dans des applications impliquant des acides nucléiques (qui sont fortement chargées par rapport aux matériaux mentionnés ci-dessus) n'est pas claire.
Cette approche microfluidique pour la livraison dépend de rupture mécanique de la membrane cellulaire àfaciliter la diffusion passive de la matière dans la cellule et qui a été montré pour être applicable à une gamme de types de cellules 20. Le système est donc approprié à principale pour la livraison cytosolique de presque n'importe quel matériau à presque n'importe quel type de cellule. Nous croyons que les avantages du système sont plus prononcées dans les cas impliquant traditionnellement difficiles à transfecter des cellules primaires (par exemple immunitaire et cellules souches) et matériaux classiquement difficiles (par exemple des protéines, les points quantiques, nanotubes de carbone, et de l'ARN). Le potentiel précité dans des applications de cellules immunitaires et souches est souligné par les lacunes des méthodes de prestation traditionnels dans la lutte contre ces types de cellules. Cependant, le système peut exiger de nouvelles améliorations pour faciliter la délivrance de gènes par des vecteurs plasmidiques que ces applications nécessitent livraison au noyau. En résumé, nous croyons que l'approche de déformation microfluidique à la livraison peut potentiellement répondre à de nombreux défis existants à la délivrance intracellulaire. Le systel'indépendance de m vecteurs chimiques ou des champs électriques permet son application robuste pour une série d'études. Les instructions fournies dans ce document devraient permettre des chercheurs intéressés à l'exploitation d'un tel système de façon indépendante et de l'adapter à leurs besoins de recherche.
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Disclosures
Les auteurs Armon sharei, Robert Langer, et Klavs F. Jensen sont actionnaires de Société SQZ Biotechnologies qui produit les dispositifs microfluidiques utilisés dans cet article.
Acknowledgments
Nous remercions T. Shatova de discussion utile sur la conception expérimentale et l'analyse de données. L'assistance et l'expertise de G. Paradis, le personnel de la cytométrie de flux noyau à l'Institut Koch, et le personnel du Laboratoire de la technologie Microsystems au Massachusetts Institute of Technology grandement appréciée. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de subventions à la santé RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, et en partie par l'Institut national du cancer Cancer Center de soutien (de base) Subventions P30-CA14051 et député-09Call-Langer-60.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
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