Abstract
Etichettatura cellule gangliari della retina come retrograde (RGCs) in grado di isolare RGC somata di morire siti, è diventato il gold standard per il conteggio RGC nella sopravvivenza RGCs ed esperimenti di rigenerazione. Molti studi sono stati condotti negli animali mammiferi per ricercare la sopravvivenza RGC dopo la lesione del nervo ottico. Tuttavia, marcatura retrograda di RGCs in zebrafish adulto non è ancora stato segnalato, anche se alcuni metodi alternativi possono contare il numero di cellule negli strati della retina cellule gangliari (RGCL). Considerando le piccole dimensioni del cranio adulto zebrafish e l'alto rischio di morte dopo la foratura sul cranio, apriamo il cranio con l'aiuto di acido-incisione e sigillare il foro con un legame fotopolimerizzazione, che potrebbero migliorare significativamente il tasso di sopravvivenza. Dopo aver assorbito le tinture per 5 giorni, quasi tutti i RGC sono etichettati. Dato che questo metodo non ha bisogno di transetto il nervo ottico, è insostituibile nella ricerca della sopravvivenza RGC dopo schiacciamento del nervo ottico in zebrafish adulto. Qui, vi presentiamoquesto metodo passo passo e fornire risultati rappresentativi.
Introduction
Come zebrafish adulto ha una forte capacità di rigenerare gli assoni dopo la lesione del nervo ottico 1, un metodo corretto per contare tutto il RGC è essenziale per valutare la sopravvivenza RGCs e rigenerazione 2. Sulla base dei metodi di RGCs marcatura retrograda in mammiferi e pesci rossi 3-5, abbiamo costruito il metodo per etichettare RGCs dal Tectum in zebrafish adulto. Per zebrafish adulto, due problemi tecnici critici devono essere notato: il cranio di zebrafish adulto è molto piccolo 6; vivono in un ambiente acquatico. Qui, trattiamo il cranio con mordenzante che riduce al minimo i rischi associati alla perforazione 5. Poi, abbiamo sigillare il foro con vincolo di polimerizzazione luce che migliora la sopravvivenza degli animali dopo l'intervento chirurgico.
In precedenza, sono state adottate diverse altre tecniche per contare il numero RGCs in modi indiretti. HE colorazione in sezioni retina etichetta tutti i tipi di cellule nel RGCL 7. Etichettatura anticorpo in tutta rEtina, come isolotto-1, può anche marcare cellule amacrine 8. Anche se l'etichetta retrogrado dal moncone del nervo ottico può etichettare tutti RGCs nella retina, non può essere adottato nel modello calca perché provoca lesioni più al nervo ottico. Approfittando di etichetta retrogrado dal Tectum, abbiamo ricercato la sopravvivenza RGC e il rinnovamento nelle schiacciamento del nervo ottico. I risultati mostrano che quasi tutti RGCs sopravvissero e oltre il 90% di RGCs rigenerati al Tectum alla prima settimana nel modello calca 9.
Al fine di etichettare correttamente tutti RGC, pasta DII è stato scelto dopo un confronto con diversi altri coloranti commerciali 10. In primo luogo, è stato appositamente progettato per l'etichettatura tessuto in vivo. In secondo luogo, è un colorante lipofilo che non può diffondere in acqua. Inoltre, questa fluorescenza può persistere per lungo tempo che gli rende un candidato ideale per RGC ricerca sopravvivenza.
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Protocol
1. Costruire l'Apparato Chirurgia
NOTA: per garantire il pesce rimane vivo durante e dopo l'operazione, l'anestesia gocciolamento soluzione etile metansolfonato 3-amminobenzoato (MS-222, o Tricaine) a mezzo di concentrazione (0,015%) con una velocità di 1 goccia / sec attraverso la bocca del pesce utilizzando un sistema autocostruito gocciolamento illustrato nella Figura 1.
- Fare una scatola come mostrato in Figura 1A (la lunghezza è di 28 centimetri, la larghezza è di 10 cm, l'altezza è di 5 cm), mettere una spugna (lunghezza di 6 cm, larghezza è di 9 cm, altezza 4 cm) nel mezzo e aprire una gap su di esso.
- Fai una superficie liscia globulare sulla fine l'ago con vincolo polimerizzazione (Figura 1B), che sarà poi inserito nella bocca del pesce. Assicurarsi che la superficie dell'ago è liscia per evitare bocca del pesce venga danneggiato.
- Aggiungi la metà concentrazione di MS-222 (camera di sinistra, la lunghezza è di 6 centimetri, la larghezza è di 10 cm, l'altezza è di 8 cm) e soluzione salina (camera destra, lunghezza di 4 cm, larghezza è di 10 cm, l'altezza è di 8 cm) per i serbatoi come mostrato in Figura 1C. Nota: Fresco MS-222 è raccomandato.
- Anestetizzare il pesce in 0,03% MS-222 per 2 min.
- Mettere il pesce nella fessura della spugna e fissare il pesce con due coppie di perni, inseriti dietro la pinna pettorale e accanto il poro cloaca, rispettivamente, 11.
- Collegare bocca del pesce, MS-222, e acqua allevamento con un tubo di tipo T, come mostrato nella Figura 1C.
- Accendere il tubo collegato alla MS-222.
2. RGCs Label retrogradi dal Tectum Destra
NOTA: Prima di iniziare, disinfettare tutti gli apparati con il 70-75% di etanolo, assicurando che non l'etanolo rimane.
- Rossing: rimuovere leggermente la pelle su tutta cranio con sclerectome (vista dorsale del cranio è mostrata nelle figure 2A e 2B
- Clearing: lavare il cranio con soluzione salina e poi asciugare con orecchio lampadina lavaggio.
- Corrosione iniziale: corrodere il cranio con il mordenzante per 10 sec.
- Clearing: completamente spazzare via il mordenzante con un batuffolo di cotone e poi lavare la zona con soluzione fisiologica e asciugare.
- Protezione: al fine di proteggere il cranio in altre zone, tranne il Tectum destro da eccesso di corrosione, coprire queste zone con vincolo indurimento luce e poi curarla per esposizione a luce blu con illuminante portatile.
- Corrosione Completa: mettere il mordenzante nella zona centrale del Tectum ancora a destra per l'incisione completa per 2 min. Nota: Poiché crani di pesci anziani sono calcificate, corrosione richiederà più tempo.
- Clearing: completamente spazzare via il mordenzante con un batuffolo di cotone e poi lavare la zona con soluzione fisiologica e asciugare di nuovo.
- Apertura del cranio: rimuovere con attenzione il cranio Malacic (Figura 2C) con una pinza per esporre il 2D Tectum destra (Figura
- Clearing: pulire il muco e effusing sangue dal buco con pezzi di Gelfoam e lavarlo con soluzione fisiologica fino a quando l'emorragia si è fermata.
- Posizionamento Dye: mettere il colorante (pasta di tessuto-etichettatura) su tutta la Tectum destra e coprire con Gelfoam.
- Segregare: coprire il buco con una scala sterile dallo stesso animale.
- Tenuta: legame polimerizzazione posto luce sulla bilancia e poi curare con la luce blu ancora per 40 sec.
- Revival: lavare la superficie del vincolo e rilanciare l'animale con soluzione fisiologica.
- Nursing e l'allevamento: Tenere il pesce in 28,5 ° C di media embrione (ZFIN) per 5 giorni ed alimentare 2 volte / die. Non includere pesce il cui colorante non riesce a rimanere in Tectum per 5 giorni durante l'esperimento. Nota: soluzione a medio Embryo (EM) è vitale per la sopravvivenza dei pesci e la temperatura è il fattore chiave per l'etichettatura DII.
3. Wholemounting Retina e Imaging
- Mettere il pesce in un campo scuro per 2 ore prima di retina chelemount.
- Anestetizzare il pesce con acqua ghiacciata.
- Perforare un buco nel margine di cornea e di fare un oculare rimuovendo la cornea con le forbici venus.
- Rimuovere la lente e poi svuotare il centro della retina con ghiaccio freddo 1x PBS.
- Lavare il divario tra la retina e la sclera con ghiaccio freddo 1x PBS fino a quando non pigmento viene lasciato.
- Tagliare il nervo ottico al disco.
- Mantenere lo strato RGC verso l'alto e tenere la retina con un cucchiaio vetro self-made (Figure 3A e 3B). Un contagocce può anche essere utilizzato per trasferire la retina.
- Mettere la retina in una goccia di ghiaccio 30% glicerina su un vetrino con lo strato RGC verso l'alto (Figura 3C).
- Rimuovere la glicerina e poi appiattire la retina sul vetrino prima di tagliare retina in quattro quadranti (Figura 3D). Mantenere la retina dispiegato con RGC strato alto sarà utile per appiattire la retina.
- Gocciolare gelido 50% glicerina su tegli retina per lavare via i frammenti di pigmento.
- Rimuovere la glicerina e poi cadere 20 ml di ghiacciata 75% glicerina sulla retina.
- Coprire il campione con un 1,8 centimetri x 1,8 centimetri coprioggetto quadrati.
- Sigillare il coprioggetto con smalto. Si raccomanda di imaging immediato della retina.
- Un'immagine non interlacciata tutta la retina sotto una lente oggetto 20X (NA = 0,70) con DP72 CCD (ogni immagine è 1360 x 1024 pixel). Ogni campo ha tre diversi obiettivi.
- Estendere la profondità di ogni campo con lo strumento di "profondità di campo esteso" del software.
- Assemblare una retina virtuale con la funzione di Photomerge.
- Selezionare tre settori di 680 x 512 pixel (area effettiva è di 350 micron da 264 micron, 0,092 millimetri 2) in ciascun orientamento della retina per analizzare densità media di RGC (Figura 4A).
- Avere la zona con la funzione di misurazioni - creare un poligono nell'immaginesoftware.
- Calcolare il numero totale di RGC dall'equazione "numero RGC = destino x zona" 9.
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Representative Results
Come figure 4B-D mostra, il numero di cellule + Dii è di due terzi dei DAPI + cellule RGCL. In una retina normale, un'immagine montaggio di tutta una retina (Figura 4E) mostra che DII + RGC sono distribuiti su tutta la retina ma in una retina rigenerato (Figura 4F), come RGC nella zona centrale non hanno rigenerato alla loro destinazione a la prima settimana, non potevano essere etichettati.
Figura 1. Apparecchiatura chirurgia usato per la marcatura retrograda di RGC. (A) Utilizzare una spugna (a) per fissare il pesce. La piattaforma operativa (la lunghezza è di 28 centimetri, la larghezza è di 10 cm, l'altezza è di 5 cm) e il tubo di infusione sono collegati tramite un ago di metallo (b). L'acqua in eccesso viene immagazzinata nella cavità (c). (B) Un primo piano per l'ago metallico. La testa del dell'ago è avvolto con vincolo polimerizzazione (d). (C) serbatoi sono utilizzati per la memorizzazione di MS-222 (e, lunghezza di 6 cm, larghezza è di 10 cm, l'altezza è di 8 cm) e soluzione salina (f, la lunghezza è di 4 cm, larghezza è di 10 cm, l'altezza è di 8 cm), rispettivamente. Il tubo di infusione (g) collega il serbatoio e l'ago metallico.
Figura 2. Vista dorsale del cranio di zebrafish adulto. (A) cranio intatto prima Rossing. La linea tratteggiata gialla segna il Tectum; la linea tratteggiata rossa segna il telencefalo; e la linea tratteggiata verde segna il cervelletto. (B) del cranio dopo pelle rimossa. (C) Dopo la corrosione con etchant, il cranio è Malacic e una zona concava viene sottolineato dal forcipe (bianco *). (D) tectum destro è esposto dopo il cranio è rimosso. La scala è 500 & #956; m.
Figura 3. Fasi principali di wholemounting retina. (A) vetro cucchiaio Homebuilt per scavare retina, l'immagine in basso mostra l'intera vista. (B) Tenere la retina con il "cucchiaio" (contrassegnato da linea tratteggiata). (C) Trasportare la retina in ghiaccio-freddo del 30% glicerina. ( D) Tagliare la retina in 4 trimestri; freccia indica l'orientamento del taglio. Barre di scala (A) 1 millimetro; (BD) 500 pm.
F igure 4. Il campionamento delle RGC conteggio in retina virtuale. (A) Rappresentazione schematica della retina ha quattro campi (N, D, V, campo T) e ciascuno di essi hatre campi, che sono indicati in una scatola bianca. Notare il disco ottico si trova di solito l'orientamento ventrale-temporale (punto nero). (E) immagine Montaggio di tutta la retina (B) DII etichettato RGC. (C) DAPI nucleo marcato. (D) immagine a video di RGCs e nucleo. in zebrafish normale. (F) immagine in sequenza che mostra retina rigenerato dopo la lesione del nervo ottico. La zona centrale della retina non è etichettato come RGC non hanno rigenerato ai loro obiettivi nella prima settimana. Abbreviazioni: N = nasale, D = dorsale, V = ventrale, T = temporale. Bar Scala: 30 micron (BD); 500 micron (E, F).
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Discussion
Marcatura retrograda di RGC è importante per ricercare sopravvivenza RGC in mammiferi, ma non è stato usato in zebrafish. I metodi alternativi, HE macchiava 7 e colorazione anticorpale 8, non sono gold standard per il conteggio numero RGC, e le linee transgeniche con tutti RGCs etichettati non ha ancora stati costruiti 12, 13. In questo video, vi presentiamo un metodo per retrograda RGCs etichette nella retina di zebrafish adulto. Anche se circa l'1% degli assoni proiettano al bulbo olfattivo o di altri settori 14, questo metodo può etichettare quasi tutti RGCs nella retina.
Come zebrafish sono troppo fragili per sopportare il danno fisico, aprendo il cranio di zebrafish adulto con bisturi un'incisione 3 o un trapano 5, 15 MAG causare la morte. Ammorbidendo il cranio con mordenzante può minimizzare i danni al cervello. Sigillando il foro con un legame polimerizzazione e fissaggio sotto la luce blu,maggior parte dei pesci sopravvivono dopo l'intervento chirurgico. Ci vogliono solo 12-15 minuti per eseguire l'intervento in funzionamento abile, che è più conveniente ed efficiente rispetto al ratto e altri animali mammiferi 5.
DII pasta tessuto etichettatura è un colorante lipofilo. Rispetto a cristalli DII o microiniezione di soluzioni concentrate, questo migliora la penetrazione del colorante nel tessuto, etichettatura assoni dentro e sotto la superficie. Inoltre, la fluorescenza può persistere per un lungo periodo di tempo 10. D'altra parte, questo colorante viene assorbito da pathway trasporto passivo, quindi è necessario liberare il colorante nel Tectum per almeno 5 giorni per etichettatura completa.
Lo zebrafish è un organismo modello eccellente di rigenerazione visiva. Al 7 giorni dopo schiacciamento del nervo ottico, quasi tutti RGC Axon rigenerare il Tectum, ma solo la metà di RGCs rigenerano nel modello di taglio nervo ottico 9. Questo metodo è un modo ideale per ricercare RGCs sopravvivenza e la rigenerazione dopo schiacciamento del nervo ottico, che potrebbe evitare lesioni supplementare sul nervo ottico.
Abbiamo presentato un protocollo completo per RGC etichettatura successo retrograde in zebrafish adulto e misurando il numero di RGC in una retina wholemount. Inoltre, utilizzando un legame fotopolimerizzazione, aumentiamo il tasso di sopravvivenza di zebrafish, che rendono questo metodo più efficace.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
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