Abstract
जैसा कि प्रतिगामी लेबलिंग रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) साइटों मरने से RGCs somata अलग कर सकते हैं, यह RGCs अस्तित्व और उत्थान प्रयोगों में RGCs गिनती के लिए सोने के मानक बन गया है. कई अध्ययनों से ऑप्टिक तंत्रिका चोट के बाद RGCs अस्तित्व अनुसंधान करने के लिए स्तनधारी पशुओं में प्रदर्शन किया गया है. कुछ वैकल्पिक तरीकों रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परतों (RGCL) में सेल नंबर भरोसा कर सकते हैं, हालांकि हालांकि, वयस्क zebrafish में RGCs के प्रतिगामी लेबलिंग अभी तक रिपोर्ट नहीं दी है. वयस्क zebrafish खोपड़ी के छोटे आकार और खोपड़ी पर ड्रिलिंग के बाद मौत के उच्च जोखिम को देखते हुए, हम एसिड नक़्क़ाशी की मदद से खोपड़ी खुला और काफी जीवित रहने की दर में सुधार सकता है जो एक प्रकाश इलाज बंधन, साथ छेद सील. 5 दिनों के लिए रंगों को अवशोषित करने के बाद, लगभग सभी RGCs लेबल रहे हैं. इस विधि ऑप्टिक तंत्रिका आड़ा काट की जरूरत नहीं है के रूप में, यह वयस्क zebrafish में ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने के बाद RGCs अस्तित्व के अनुसंधान में अपूरणीय है. यहाँ, हम परिचयइस विधि कदम से कदम और प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं.
Introduction
वयस्क zebrafish गिनती करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका चोट के बाद 1 axons पुनर्जीवित करने के लिए एक मजबूत करने की क्षमता, एक उचित तरीका है के रूप में पूरी RGCs RGCs अस्तित्व और उत्थान 2 का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है. स्तनधारी और सुनहरी 3 में प्रतिगामी लेबलिंग RGCs के तरीकों के आधार पर - 5, हम वयस्क zebrafish में tectum से RGCs लेबल करने के लिए विधि निर्माण किया. वयस्क zebrafish के लिए, दो महत्वपूर्ण तकनीकी चिंताओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए: वयस्क zebrafish की खोपड़ी 6 बहुत छोटा है; वे एक पानी के वातावरण में रहते हैं. यहाँ, हम 5 ड्रिलिंग से जुड़े खतरों को कम करता है जो एचेंट साथ खोपड़ी का इलाज. फिर, हम सर्जरी के बाद पशु अस्तित्व में सुधार जो प्रकाश इलाज बांड के साथ छेद सील.
इससे पहले, कई अन्य तकनीकों अप्रत्यक्ष तरीके में RGCs संख्या गिनने के लिए अपनाया गया. महामहिम रेटिना वर्गों में धुंधला RGCL 7 में कोशिकाओं के सभी प्रकार के लेबल. पूरे r में एंटीबॉडी लेबलिंगऐसे आइलेट -1 के रूप में etina, भी amacrine कोशिकाओं 8 लेबल कर सकते हैं. ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप से पतित लेबल रेटिना में सभी RGCs लेबल कर सकते हैं हालांकि यह ऑप्टिक तंत्रिका अतिरिक्त चोट के कारण है, क्योंकि यह क्रश मॉडल में अपनाया नहीं जा सकता. Tectum से पतित लेबल का लाभ उठाते हुए, हम ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने में RGCs अस्तित्व और उत्थान शोध किया है. परिणाम लगभग सभी RGCs बच गया और RGCs के 90% से अधिक कुचलने मॉडल 9 में पहले सप्ताह में tectum को पुनर्जीवित करता है.
सफलतापूर्वक सभी RGCs लेबल करने के लिए, DiI पेस्ट कई अन्य वाणिज्यिक रंजक 10 के साथ तुलना के बाद चुना गया था. सबसे पहले, यह विशेष रूप से vivo में ऊतक लेबलिंग के लिए बनाया गया है. दूसरे, यह पानी में फैलाना नहीं कर सकते हैं जो एक lipophilic डाई है. साथ ही, यह प्रतिदीप्ति यह RGCs अस्तित्व अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाती है, जो एक लंबे समय के लिए बच सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. सर्जरी उपकरण का निर्माण
नोट: के दौरान और आपरेशन, ड्रिप संज्ञाहरण समाधान एथिल 3 aminobenzoate methanesulfonate (एमएस 222, या Tricaine) मछली के मुंह के माध्यम से 1 बूंद / सेकंड की एक वेग के साथ एक आधा एकाग्रता (0.015%) में बाद मछली जिंदा रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए चित्र 1 में दिखाया गया है एक homebuilt ड्रिप प्रणाली का उपयोग कर.
- चित्रा 1 ए में दिखाया गया है एक बॉक्स (लंबाई चौड़ाई ऊंचाई 5 सेमी है, 10 सेमी है, 28 सेमी है), बीच में (लम्बाई चौड़ाई 9 सेमी, ऊंचाई 4 सेमी है, 6 सेमी है) एक स्पंज डाल दिया है और एक खोलने इस पर खाई.
- फिर मछली के मुंह में डाला जाएगा जो प्रकाश इलाज बांड (चित्रा 1 बी) के साथ सुई के अंत पर एक चिकनी गोलाकार सतह बनाओ. सुई की सतह क्षतिग्रस्त होने से मछली के मुंह को रोकने के लिए चिकनी है कि सुनिश्चित करें.
- एमएस-222 (बाएँ कक्ष, लंबाई 6 सेमी है की आधा एकाग्रता जोड़ें, चौड़ाई 10 सी हैमीटर, ऊंचाई 8 सेमी) और चित्रा 1C रूप में दिखाया गया जलाशयों को खारा (सही चैम्बर, लंबाई ऊंचाई 8 सेमी, चौड़ाई 10 सेमी है, 4 सेमी है) है. नोट: ताजा एमएस-222 की सिफारिश की है.
- 2 मिनट के लिए 0.03% एमएस-222 में मछली anesthetize.
- स्पंज के अंतराल में मछली प्लेस और छाती पर का कवच पंख के पीछे और क्रमशः cloacal ताकना, 11 के बगल में डाला पिन के दो जोड़े, साथ मछली को ठीक.
- चित्रा 1C में दिखाया गया है एक टी प्रकार ट्यूब के साथ मछली के मुंह, एमएस-222, और पालन पानी से कनेक्ट करें.
- एमएस 222 से जुड़ा ट्यूब पर स्विच करें.
राइट Tectum से 2. प्रतिगामी लेबल RGCs
नोट: पहले शुरुआत करने के लिए, कोई इथेनॉल रहता है यह सुनिश्चित करना कि 70-75% इथेनॉल के साथ सभी apparatuses कीटाणुरहित.
- Rossing: थोड़ा sclerectome साथ पूरे खोपड़ी पर त्वचा को हटाने (खोपड़ी के पृष्ठीय देखें आंकड़े 2A और 2 बी में दिखाया गया है
- क्लियरिंग: नमक के साथ खोपड़ी धोने और फिर कान धोने बल्ब के साथ शुष्क.
- प्रारंभिक जंग: 10 सेकंड के लिए एचेंट साथ खोपड़ी खुरचना.
- क्लियरिंग: पूरी तरह से एक कपास झाड़ू के साथ एचेंट दूर पोंछ और फिर नमक के साथ क्षेत्र धो और सूखी.
- संरक्षण: अतिरिक्त जंग से सही tectum को छोड़कर अन्य क्षेत्रों में खोपड़ी की रक्षा के लिए, प्रकाश इलाज बांड के साथ इन क्षेत्रों को कवर किया और फिर पोर्टेबल रोशन के साथ नीले रंग की रोशनी के संपर्क से यह इलाज.
- पूरा जंग: 2 मिनट के लिए पूरा नक़्क़ाशी के लिए फिर से सही tectum के मध्य क्षेत्र में एचेंट डाल दिया. नोट: पुराने मछली की खोपड़ी calcified हैं, जंग में लंबा समय लग जाएगा.
- क्लियरिंग: पूरी तरह से एक कपास झाड़ू के साथ एचेंट दूर पोंछ और फिर नमक के साथ क्षेत्र धो लें और फिर यह शुष्क.
- खोपड़ी उद्घाटन: ध्यान से सही tectum (चित्रा 2 डी को बेनकाब करने के लिए संदंश के साथ malacic खोपड़ी (चित्रा -2) को हटाने
- क्लियरिंग: gelfoam के टुकड़े के साथ छेद से बलगम और खून effusing पोंछे और खून बह रहा बंद कर दिया है जब तक खारा से धो.
- डाई नियुक्ति: पूरे अधिकार tectum पर डाई (ऊतक लेबलिंग पेस्ट) रख दिया और gelfoam के साथ कवर.
- Segregating: एक ही पशु से एक बाँझ पैमाने के साथ छेद को कवर किया.
- पैमाने पर जगह रोशनी इलाज बांड और फिर 40 सेकंड के लिए फिर से नीले प्रकाश के साथ इसे इलाज: सीलिंग.
- रिवाइवल: बांड की सतह धोने और नमक के साथ पशु पुनर्जीवित.
- नर्सिंग और प्रजनन: 5 दिनों के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस भ्रूण मध्यम (ZFIN) में मछली रखने और 2 बार / दिन खिलाओ. जिसका डाई प्रयोग में 5 दिनों के लिए tectum में रहने के लिए विफल रहता मछली शामिल न करें. नोट: भ्रूण मध्यम (ईएम) समाधान मछली के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है और तापमान DiI लेबलिंग के लिए महत्वपूर्ण कारक है.
3. Wholemounting रेटिना और इमेजिंग
- रेटिना से पहले 2 घंटे के लिए एक अंधेरे क्षेत्र में मछली जो जगहlemount.
- बर्फ के पानी के साथ मछली anesthetize.
- कॉर्निया के मार्जिन में एक छेद पंचर और वीनस कैंची से कॉर्निया को निकाल कर एक आंख कप बनाते हैं.
- लेंस निकालें और फिर ठंडा 1x पीबीएस के साथ रेटिना के केंद्र फ्लश.
- कोई रंग छोड़ दिया है जब तक रेटिना और ठंडा 1x पीबीएस के साथ श्वेतपटल के बीच की खाई को फ्लश.
- डिस्क में ऑप्टिक तंत्रिका कट.
- ऊपर की ओर RGC परत रखें और एक स्वयं बनाया कांच चम्मच (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के साथ रेटिना पकड़. एक dropper भी रेटिना स्थानांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- ऊपर की ओर RGC परत (चित्रा -3 सी) के साथ एक स्लाइड पर बर्फीले 30% ग्लिसरीन की एक बूंद में रेटिना रखो.
- ग्लिसरीन हटाने और फिर चार quadrants (चित्रा 3 डी) में रेटिना काटने से पहले गिलास स्लाइड पर रेटिना समतल. RGC परत के साथ सामने आया रेटिना रखते हुए ऊपर की ओर रेटिना सपाट करने के लिए उपयोगी हो जाएगा.
- टी पर बर्फीले 50% ग्लिसरीन ड्रिपवह वर्णक के टुकड़े दूर धोने के लिए रेटिना.
- ग्लिसरीन हटाने और फिर रेटिना पर बर्फीले 75% ग्लिसरीन की 20 μl ड्रॉप.
- एक 1.8 सेमी x 1.8 सेमी वर्ग coverslip के साथ नमूना कवर.
- नेल पॉलिश के साथ coverslip सील. रेटिना के तत्काल इमेजिंग की सिफारिश की है.
- गैर जिल्द छवि DP72 सीसीडी (प्रत्येक छवि 1360 x 1024 पिक्सल है) के साथ एक 20X वस्तु लेंस के तहत पूरे रेटिना (एनए 0.70 =). प्रत्येक क्षेत्र में तीन अलग केंद्रित है.
- सॉफ्टवेयर में "क्षेत्र की विस्तारित गहराई" के उपकरण के साथ प्रत्येक क्षेत्र की गहराई का विस्तार.
- Photomerge के समारोह के साथ एक आभासी रेटिना को इकट्ठा करो.
- RGCs के औसत घनत्व (चित्रा -4 ए) का विश्लेषण करने के लिए रेटिना के प्रत्येक अभिविन्यास में 680 x 512 पिक्सल के तीन क्षेत्रों (वास्तविक क्षेत्र 0.092 मिमी 2, 264 माइक्रोन से 350 माइक्रोन है) का चयन करें.
- माप के समारोह के साथ क्षेत्र प्राप्त करना - छवि में एक बहुभुज सुविधा बनानेसॉफ्टवेयर.
- समीकरण द्वारा RGCs की कुल संख्या की गणना करें "RGCs संख्या = भाग्य एक्स क्षेत्र" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
आंकड़े 4 बी डी शो के रूप में, DiI + कोशिकाओं की संख्या RGCL में DAPI + कोशिकाओं का दो तिहाई है. एक सामान्य रेटिना में, एक पूरे रेटिना (चित्रा 4E) की एक असेंबल छवि DiI + RGCs केंद्रीय क्षेत्र में RGCs में अपने लक्ष्य को पुनर्जीवित नहीं किया है के रूप में पूरे रेटिना से अधिक लेकिन एक पुनर्जीवित रेटिना (चित्रा 4F), में वितरित कर रहे हैं पता चलता है कि पहले हफ्ते, वे लेबल नहीं किया जा सका.
चित्रा 1. RGC की प्रतिगामी लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया सर्जरी उपकरण. (ए) (क) मछली तय करने के लिए एक स्पंज का प्रयोग करें. संचालन मंच और निषेचन ट्यूब एक धातु सुई (ख) के माध्यम से जुड़े हुए हैं (लंबाई चौड़ाई ऊंचाई 5 सेमी 10 सेमी, है, 28 सेमी है). धातु सुई के लिए अतिरिक्त पानी गुहा (ग) में संग्रहीत किया जाता है. (बी) के एक बंद हुआ. सुई के सिर प्रकाश इलाज बांड (डी) के साथ लिपटे है. (सी) जलाशयों एमएस 222 के भंडारण के लिए इस्तेमाल किया (ई, लंबाई ऊंचाई 8 सेमी, चौड़ाई 10 सेमी है, 6 सेमी है) और नमकीन (एफ, लंबाई 4 है कर रहे हैं सेमी, चौड़ाई क्रमश:) ऊंचाई 8 सेमी है, 10 सेमी है. आसव ट्यूब (G) जलाशय और धातु सुई से जोड़ता है.
चित्रा 2. वयस्क zebrafish की खोपड़ी के पृष्ठीय देखें. Rossing से पहले (एक) बरकरार खोपड़ी. पीले बिंदीदार रेखा tectum के निशान; लाल बिंदीदार रेखा telencephalon के निशान; और हरी बिंदीदार रेखा सेरिबैलम के निशान. (बी) खोपड़ी निकाल दिया त्वचा के बाद. (सी) एचेंट साथ जंग के बाद, खोपड़ी malacic है और एक अवतल क्षेत्र संदंश (सफेद *) से बाहर बताया है. (डी) सही tectum सामने आ रहा है खोपड़ी निकाल दिया जाता है के बाद. स्केल 500 & # है956, एम.
चित्रा 3. रेटिना wholemounting की महत्वपूर्ण कदम. रेटिना scooping के लिए (ए) Homebuilt गिलास चम्मच, नीचे छवि पूरे दृश्य दिखाता है. (बी) (बिंदीदार रेखा से चिह्नित) "चम्मच" के साथ रेटिना पकड़ो. (सी) ठंडा 30% ग्लिसरीन में रेटिना परिवहन. ( डी) 4 तिमाहियों में रेटिना कट; तीर काटने के उन्मुखीकरण को इंगित करता है. स्केल सलाखों (a) 1 मिमी; (बी) 500 माइक्रोन.
एफ igure 4. आभासी रेटिना में गिनती RGCs के नमूने. (ए) रेटिना के योजनाबद्ध दृश्य चार क्षेत्रों (एन, डी, वी, टी क्षेत्र) है और इनमें से प्रत्येकएक सफेद बॉक्स में दिखाया गया है जो तीन क्षेत्रों. ऑप्टिक डिस्क आमतौर पर उदर अस्थायी अभिविन्यास (काले डॉट) में स्थित है नोटिस. (बी) DiI RGCs लेबल. RGCs और नाभिक (सी) DAPI लेबल नाभिक. (डी) विलय तस्वीर. पूरे रेटिना (ई) असेंबल छवि सामान्य zebrafish में. (एफ) ऑप्टिक तंत्रिका चोट के बाद पुनर्जीवित रेटिना दिखा असेंबल छवि. RGCs पहले हफ्ते में अपने लक्ष्य को पुनर्जीवित नहीं किया है के रूप में रेटिना के मध्य क्षेत्र लेबल नहीं है. लघुरूप: एन = नाक, डी = पृष्ठीय, वी = उदर, टी = अस्थायी. स्केल सलाखों: 30 माइक्रोन (बी); 500 माइक्रोन (ई, एफ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RGCs के प्रतिगामी लेबलिंग स्तनधारी पशुओं में RGCs अस्तित्व अनुसंधान करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह zebrafish में इस्तेमाल नहीं किया गया. वैकल्पिक तरीकों, वह 7 धुंधला और एंटीबॉडी धुंधला 8, RGCs संख्या की गणना के लिए सोने के मानक, और लेबल सभी RGCs के साथ ट्रांसजेनिक लाइनें हैं अभी तक 12, 13 का निर्माण नहीं किया गया है. इस वीडियो में, हम वयस्क zebrafish के रेटिना में लेबल RGCs प्रतिगामी के एक विधि परिचय. Axons के बारे में 1% घ्राण बल्ब या अन्य क्षेत्रों से 14 परियोजना हालांकि, इस विधि रेटिना में लगभग सभी RGCs लेबल कर सकते हैं.
Zebrafish स्केलपेल चीरा 3 या एक ड्रिल 5, 15 के साथ वयस्क zebrafish की खोपड़ी खोलने, शारीरिक चोट सहन करने के लिए बहुत ही कमजोर कर रहे हैं के रूप में मौत का कारण बन सकता है. एचेंट साथ खोपड़ी नरमी मस्तिष्क को नुकसान को कम कर सकते हैं. एक प्रकाश इलाज बांड के साथ छेद सील और नीले रंग की रोशनी के तहत यह तय करके,सबसे मछली सर्जरी के बाद जीवित रहते हैं. यह केवल चूहा और अन्य स्तनधारी जानवरों 5 के साथ तुलना में अधिक सुविधाजनक और कुशल है, जो कुशल अभियान के तहत सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए 12-15 मिनट लगते हैं.
DiI ऊतक लेबलिंग पेस्ट एक lipophilic डाई है. DiI क्रिस्टल या केंद्रित समाधान के microinjection की तुलना में, इस पर दोनों और सतह के नीचे axons लेबलिंग, ऊतक में डाई की पहुंच में सुधार. इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति एक लंबे समय अवधि 10 के लिए बच सकते हैं. दूसरी ओर, इस डाई निष्क्रिय परिवहन मार्ग द्वारा अवशोषित है, तो यह पूरी लेबलिंग के लिए कम से कम 5 दिनों के लिए tectum में डाई छोड़ने के लिए आवश्यक है.
zebrafish दृश्य उत्थान का एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है. ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने के बाद 7 दिन में, लगभग सभी RGCs tectum को पुनर्जीवित एक्जॉन, लेकिन RGCs के केवल आधे ऑप्टिक तंत्रिका कटौती मॉडल 9 में पुनर्जन्म. इस विधि RGC अनुसंधान के लिए एक आदर्श तरीका हैऑप्टिक तंत्रिका पर अतिरिक्त चोट से बचने के सकता जो ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने के बाद अस्तित्व और उत्थान.
हम वयस्क zebrafish और एक wholemount रेटिना में RGCs संख्या मापने में सफलतापूर्वक प्रतिगामी लेबलिंग RGCs लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. इसके अतिरिक्त, एक प्रकाश इलाज बंधन का उपयोग करके, हम इस पद्धति को और अधिक प्रभावी बनाने के लिए जो zebrafish के जीवित रहने की दर में वृद्धि.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
