In utero mesure de la fréquence cardiaque chez la souris par M mode non invasive échocardiographie

Summary

Ultra-haute ultrasons de fréquence est un outil d'imagerie en temps réel puissant pour examiner les anomalies cardiaques chez les petits animaux. Son caractère non invasif permet de maintenir l'état physiologique de l'embryon. Ici, nous montrons l'utilisation du mode M ultrasons pour mesurer les taux d'embryons de coeur à -18,5 in utero.

Abstract

Cardiopathie congénitale (CHD) est la cause non infectieuse la plus fréquente de décès à la naissance. L'incidence de la maladie coronarienne varie de 4 à 50/1 000 naissances (maladie et les estimations régionales des blessures, de l'Organisation mondiale de la Santé, 2004). Chirurgies qui compromettent souvent la qualité de vie sont nécessaires pour corriger des malformations cardiaques, nous rappelant l'importance de trouver les causes de la maladie coronarienne. Modèles de souris mutantes et de la technologie de l'imagerie en direct sont devenus des outils essentiels pour étudier l'étiologie de cette maladie. Bien que les méthodes avancées permettent l'imagerie en direct de cœur anormaux chez les embryons, les états physiologiques et hémodynamiques de ces derniers sont souvent compromises en raison de procédures chirurgicales et / ou longs. L'imagerie par ultrasons non invasive, cependant, peut être utilisé sans exposition chirurgicale des embryons, en maintenant ainsi leur physiologie. Ici, nous utilisons simplement l'échographie en mode M pour évaluer les taux d'embryons de coeur à -18,5 in utero. La détection de taux anormaux de coeur est en effet un bon indicateurteur de la dysfonction du cœur et constitue donc une première étape dans l'identification des défauts de développement pouvant conduire à une insuffisance cardiaque.

Introduction

CHD est la cause non infectieuse la plus fréquente de décès à la naissance ^1. Chirurgies multiples sont souvent nécessaires pour corriger les défauts structurels dans les sujets dont la qualité de vie peut rester compromis ^1. Les enfants atteints de cardiopathies congénitales développent fréquemment des troubles neurologiques, même si elles n'ont pas subi une intervention chirurgicale, indiquant importante des conséquences sur le développement in utero ^2,3. Les facteurs génétiques et environnementaux, tels que l'exposition à des virus ou des produits chimiques (alcool) pendant la grossesse, cause CHD. Étudier les contributeurs génétiques est encore à sa phase initiale, mais en croissance rapide. Pour identifier ces contributeurs et de comprendre leur rôle dans le développement du cœur, le phénotypage des souris mutantes avec un outil simple et puissant sera très bénéfique.

La souris est en effet un modèle animal de choix pour étudier CHD, et la plupart des cas humains peut être reproduite chez la souris ^4,5. Par conséquent, le phénotypage cardiaque de fœtus de souris est devenu increasingly important d'étudier l'étiologie de la maladie coronarienne humaine et nécessite des outils adéquats. Bien que des études histologiques sur des échantillons fixés sont inestimables, l'imagerie en temps réel des animaux vivants est essentiel de comprendre la physiologie du cœur. microscopie vidéo offre imagerie en temps réel. Cependant, elle nécessite une laparotomie pour exposer les embryons, ce qui compromet leur état physiologique et hémodynamique. Récemment, l'échocardiographie est devenue la technique d'imagerie standard pour l'évaluation cardiaque de la clinique ainsi que chez les souris.

Souris échocardiographie foetale est effectuée en utilisant des systèmes à ultrasons cliniques standard ainsi que des systèmes d'échographie ultra-haute fréquence. Ces derniers fournissent 30 MHz ou supérieur transducteurs de fréquences qui génèrent des images bidimensionnelles et permettent l'évaluation des premiers stades embryonnaires. Ces capteurs ont une profondeur relativement faible de pénétration (~ 13 mm), ce qui est, cependant, suffisante pour obtenir des plans d'imagerie adéquats et déterminer fondamental coeur paramètres, tels que la fréquence cardiaque, le diamètre interne du ventricule gauche et à droite à la diastole et la systole et la cloison et l'épaisseur de la paroi, sans effectuer une laparotomie.

Dans notre étude, nous avons utilisé un système à ultrasons ultra-haute fréquence pour évaluer les taux d'embryons de souris cardiaques à jour embryonnaire -18,5. Nous avons choisi un transducteur de 30 MHz qui fournit une représentation de domaine de 20 mm x 20 mm, optimal compte tenu de la taille du fœtus, avec une distance focale de 12,7 mm. Cependant, un transducteur de fréquence plus élevée peut être choisie pour analyser les premiers stades de développement. Le M-mode sélectionné permet la visualisation des tissus en mouvement grâce à une haute résolution temporelle de 1 000 images / sec. La procédure complète est simple et doit être effectué le plus rapidement possible afin d'éviter toute perturbation des états physiologiques et hémodynamiques du fœtus. L'analyse d'environ 8 embryons nécessite environ 1 h.

Protocol

Toutes les procédures indiquées dans ce protocole ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l'IRCM.

Une. Système à ultrasons et préparation station

1. Démarrer le système d'imagerie par ultrasons et de connecter la tête de balayage ainsi que l'unité de commande de la physiologie selon les instructions du fabricant (figure 1). Choisir le programme de mesure cardiaque et la tête de balayage qui correspond au transducteur de 30 MHz.
2. Remplir l'embout de la tête de balayage avec de l'eau désionisée. Éviter les bulles d'air où ils interfèrent avec la résolution d'image. Placer la tête de balayage avec le côté de la poignée vers le haut sur ​​son support à proximité de la plate-forme d'imagerie (Figure 1A).
3. Désinfecter la plate-forme d'imagerie et la zone de travail.
4. Remplir complètement la bouteille de gel pour ultrasons afin d'éviter la formation de bulles et le placer à l'envers dans son ensemble de récipient de préchauffage à 37 ° C (figure 1B).
5. Vérifiez les niveaux d'oxygènegen et de l'isoflurane et le système de tuyauterie pour l'anesthésie. Une expérience avec ~ 8 embryons consommerait environ 15-20 L d'oxygène.
6. Placer les flacons de baume ophtalmique, crème dépilatoire et un gel d'électrode à proximité de la plate-forme de formation d'image (figure 1B).
7. Vérifiez que les fonctions infrarouge de lampe de chaleur. Pendant la formation, régler le niveau de la chaleur, la position de la lampe et de la distance de la lampe à des souris afin de maintenir constante la température du corps et le rythme cardiaque.
   Remarque: Une bonne préparation du système et le matériel est essentiel. La lenteur des procédures peuvent affecter les caractéristiques physiologiques et hémodynamiques du fœtus tant anesthésie déprime la fonction cardiaque en réduisant la fréquence cardiaque, la pression artérielle et le niveau de sang-oxygénation. Le temps de traitement pour ~ 8 fœtus (de taille moyenne de la portée de C57BL / 6) doit être d'environ 1 heure. D'autres souches de souris peuvent fournir un plus grand nombre de fœtus, peut-être avec une femelle de taille plus grande. La formation est essentielle pour optimiser la Processitemps ng.

2. Préparation de souris

1. Anesthésier la femme enceinte dans une chambre avec apport continu de 2% d'isoflurane dans de l'oxygène (200 ml / min), jusqu'à ce qu'il devienne non dynamique.
2. Placez la souris sur la plate-forme d'imagerie en position couchée, ajuster le tube pour inhalation continue de 1,5% d'isoflurane dans de l'oxygène (200 ml / min), et fixer le tube d'inhalation avec du ruban adhésif (figure 2A). Anesthésie suffisantes devraient être confirmés au cours de la procédure par la posture détendue de la souris et l'absence de toute réponse à la queue et les orteils pincées.
3. Gel Lieu d'électrode que en haut à gauche et à droite les électrodes de fond (à droite avant la jambe et la jambe arrière gauche, également appelé position II plomb) pour l'électrocardiographie. Position II plomb offre une meilleure onde P défini verticale positive et complexe QRS pour déterminer la fréquence cardiaque. Fixez les quatre pattes à chaque pad en utilisant du ruban (figure 2A). Pour éviter la sécheresse des yeux, appliquer une goutte d'baume ophtalmique dans chaque œil.
4. Raser l'abdomen, de la poitrine de la vessie avec une tondeuse à cheveux. Appliquer ensuite une crème dépilatoire pendant 2 minutes et essuyer avec une gaze et / ou un coton-tige pour enlever soigneusement les cheveux restants. Veillez à ne pas couper les mamelons.
5. Insérer le thermomètre prélubrifiée avec du gel d'électrode dans le rectum de la femme de surveiller la température du corps (devrait être maintenue à 37 ± 0,5 ° C en ajustant une lampe chauffante infrarouge placé au-dessus de la plate-forme). La fréquence cardiaque doit être de 450 ± 50 battements / min (bpm). La température et la fréquence cardiaque sont affichées sur l'unité de commande de la physiologie (figure 1B).
   Remarque: anesthésie Long, la perte de cheveux et gel à ultrasons (bien préchauffé) peuvent conduire à l'hypothermie, ce qui peut affecter le rythme cardiaque de la femelle. Si la température du corps descend en dessous de 36,5 ° C, arrêter la procédure et de modifier la position de la lampe de chauffage pour ajuster la température et la fréquence cardiaque. Attendez quelques minutes avminerai de procéder à nouveau.

3. Embryon d'identification

1. Appuyez doucement sur l'abdomen nu pour localiser les embryons. Lentement et légèrement les étaler pour avoir plus d'embryons en une seule couche sous la surface abdominale. Dans chaque corne utérine, les sacs sont linéairement reliées les unes aux autres. Essayez de respecter cet ordre lors de l'épandage.
2. Mark chaque embryon sur l'abdomen nu de la femme avec un marqueur permanent avec leur antérieur / postérieur et directions ventrales dorsales /. Connaissant l'orientation facilite la localisation du coeur avec la sonde. Nombre des embryons dans le droit et les cornes de gauche à partir du col (1, 2, 3 ... et 1 ', 2', 3 'respectivement ...; figure 2B).
   Note: (i) Éviter de répandre les embryons avec une force excessive. Esquisser leurs emplacements sur une feuille de papier pour les suivre (figure 2C). (Ii) C57BL / 6 femelles ont ~ 8 foetus par portée. Toutefois, 0-2 embryons dans chaque portée sont litué sous les autres, ce qui leur imagerie impossible. Exclure ces embryons à partir de l'analyse et d'évaluer plus portées si nécessaire.

4. Fréquence cardiaque Mesure

1. Placer une petite quantité de gel à ultrasons préchauffé sur le ventre nu et répartir uniformément. Éviter la formation de bulles. Ajouter une plus grande quantité de gel (~ 5 ml) sur la zone spécifique de l'image.
2. Tenir la sonde en contact avec la couche de gel épais (10 mm) et passer progressivement la sonde vers la peau tout en regardant pour le cœur battant. Une fois que le coeur battant est visualisée sur l'écran, de régler l'angle de la sonde d'avoir les deux ventricules dans leur plus grande dimension dans le plan de formation d'image (figure 2D).
3. Commencer à acquérir l'image. Avec l'avant-bras reposant sur ​​la station, de placer le transducteur sur le gel d'ultrasons pour obtenir une image en direct sur ​​l'écran de visualisation (figure 2D). Le maintien de la crête du transducteur sur le dessus et en cliquant sur le orientatio tête de balayagen marqueur (dans le coin supérieur gauche de l'image) permet la coordination du mouvement de la main et de la zone visualisée sur l'écran.
4. À partir du col, passer à l'embryon le plus proche marquée (1 ou 1 'à droite ou à gauche corne utérine, respectivement) pour visualiser le cœur battant à l'écran. Parce que la profondeur focale est fixe, déplacez doucement la sonde vers le haut / bas et latéralement sans perdre le contact avec le gel pour obtenir le plan de l'image souhaitée.
5. Placez le cœur battant dans le centre de l'écran dans la région indiquée par la ligne en pointillé jaune représentant la zone focale pour une meilleure acquisition de données.
6. Acquérir l'enregistrement en direct. Obtenir l'image de scout et reprendre l'enregistrement (figure 3A). Une fois un minimum de 10 secondes de l'enregistrement stable est obtenue, arrêter l'enregistrement et sauvegarder.
7. Passez à la prochaine embryon.
8. Une fois que tous les embryons sont analysés, appuyez sur "Parcourir" sur le clavier pour afficher la liste des enregistrements. Jouez chaque Traci mode M enregistréeng et effectuer de multiples mesures (au moins 5 par traçage) de la distance entre les sommets adjacents (cycle temps / flux) pour obtenir la fréquence cardiaque moyenne (figure 3B).
   Remarque: Certains protocoles suggèrent d'utiliser un support fixe pour la tête de balayage pour éviter une agitation. Cependant, il retient l'angle de l'analyse, ce qui rend l'observation des embryons latérales difficile. Il ralentit également l'analyse, comme le stand doit être ajustée pour chaque embryon. Tenir la tête de balayage tout en réglant l'avant-bras sur la station minimise efficacement secouer. Formation avec 5-10 femelles enceintes est recommandée pour optimiser le résultat.

5. Génotypage

1. Avec des ciseaux et des pinces chirurgicales propres, inciser longitudinalement la peau et la couche musculaire de l'abdomen. Repérez les sacs dans chaque corne utérine et correspondre aux numéros. Couper ouvrir le sac jaune pour exposer l'embryon dans l'ordre utilisé ci-dessus. Si ce n'est pas dans un agencement linéaire, l'esquisse des positions de l'embryon sur un morceaude papier sera indispensable une fois que les marques sur la peau ne sont plus visibles.
2. Couper seulement ~ 4 mm de queue pour génotypage de l'ADN génomique est très efficace extrait de queues embryonnaires.
   Note: (i) La procédure chirurgicale peut être effectuée dans un endroit séparé de la chambre d'imagerie. Cependant, il est important de ne pas déplacer la souris et ont la procédure chirurgicale sur la plate-forme de formation d'image afin de garder la trace des embryons numérotés. Consultez le gestionnaire de l'animalerie afin d'optimiser la procédure chirurgicale. (Ii) La femme enceinte meurt rapidement en raison de la perte de sang que les fœtus sont enlevés pour le génotypage après imagerie. Après queue coupée, les fœtus sont placés 3 min sur la glace pour l'anesthésie par hypothermie puis décapités avec des ciseaux, tel que recommandé par notre Comité de protection des animaux.

Representative Results

Le procédé ci-dessus a été utilisée pour évaluer l'impact de la présence ou de l'absence de la furine de sérine protéase dans des cellules endotheliales sur le taux d'embryons de souris de coeur à -18,5 in utero. Furine appartient à la famille des proprotéines convertases (PC) que précurseurs de protéines clivent après résidus basiques. Furine et ses substrats sont des protéines sécrétoires et le clivage peut se produire dans l'appareil de Golgi, les endosomes ou à la surface de la cellule. Substrats clés de la furine comprennent TGFß, et les facteurs TGFb-comme, comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) qui jouent un rôle important dans le développement du cœur. D'autres membres de la famille de PC peuvent également activer des substrats typiques de la furine par clivage in vitro ^6. Le rôle clé et unique de la furine au cours du développement est mise en évidence par la mort précoce des embryons de furine déficient à jour embryonnaire 11 ^7.

Parce que beaucoup de défauts présentés par les embryons de furine déficient suggéré un rôle important defurine dans les cellules endothéliales, le rôle de l'enzyme a été étudiée dans l'endothélium KO spécifique des cellules des souris (Ecko). ^{/ souris flox} Furin ^flox qui portent des alleles de flox conditionnelle du gène de la furine ⁸ ont été croisées avec furine ^{flox / +} souris portant un transgène dans où l'expression de la recombinase Cre est entraîné par l'spécifique des cellules endotheliales Tie2 promoteur ^9. Dans les cellules endotheliales, Cre recombine les deux sites loxP flanquant l'exon 2 du gène de la furine, qui code pour le peptide signal et une partie de prosegment, et génère de ce fait des alleles inactivés furine. nouveau-nés meurent Ecko peu après la naissance, ce qui confirme le rôle essentiel de la furine dans le traitement des précurseurs de cellules endothéliales.

Dans l'analyse de l'utérus de la fréquence cardiaque chez les embryons à -18,5 montré que les homozygotes, mais pas hétérozygote, les embryons Ecko souffert de tachycardie (rythme cardiaque élevé; Figure 4 10.

Figure 1. Vue d'ensemble de système mis en place. (A) échographe ultra-haute fréquence à la tête de balayage dans son support est affiché. (B) La station comprend un système d'anesthésie, l'unité et le matériel de contrôleur de la physiologie. Cliquez k ici pour agrandir l'image.

Figure 2. Souris mis en place. (A) La souris enceinte est placée en position couchée avec alimentation isoflurane et retenu sur la plate-forme avec du ruban adhésif. (B) Après élimination abdominale de cheveux, l'emplacement de l'embryon est marqué sur l'abdomen ou (C) esquissé sur un papier. (D) Le plan de formation d'image souhaitée est obtenue par déplacement de la tête de balayage qui reste en contact avec le gel pour ultrasons. L'avant-bras est correctement placé sur la station pour éviter une agitation. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 3. Évaluation représentative de la fréquence cardiaque. (A) Une image en deux dimensions d'une échocardiographie cardiaque embryonnaire à -18,5 a été obtenu en le positionnant dans la zone focale centrée sur la ligne en pointillé jaune. Les deux ventricules sont indiqués par des flèches. LV, ventricule gauche; RV, le ventricule droit. (B) La fréquence cardiaque est calculée à partir de mesures répétées entre les cycles d'écoulement adjacents en mode M traçage. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4. Représentant l'analyse des données de la fréquence cardiaque. In utero échocardiographie (mode M) de 9 WT et 7 Ecko embryon coeurs à -18,5 été réalisée en utilisant un transducteur de 30 MHz. Ces embryons were obtenu en 3 portées indépendants. P <0,0005 (***) a été déterminée par le test t et barres de Student bilatéral représentent la moyenne + SEM. WT, transgène négatif Furine ^{Flox / +} ou souris ^{flox / flox de} furine;. Ecko, Furine ^{flox / flox} Tg (Tie-2-cre) ^{+ / 0} souris Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Mode M échocardiographie est une méthode simple et efficace pour mesurer des taux cardiaques in utero d'embryons de souris. Transducteurs disponibles dans le commerce offrent une résolution suffisante pour visualiser petits cœurs qui battent. Ainsi, ils permettent une mesure très précise de la fréquence cardiaque, en comparaison avec d'autres méthodes telles que la mesure d'impulsion, et peuvent se substituer à haute résolution vidéo-microscopie. Cependant, les outils actuels ne permettent pas l'analyse simultanée de tous les embryons, ce qui implique une procédure fastidieuse de visualiser chacun des embryons. En outre, le champ relativement étroit de vue et l'absence de profondeur domaine (2D-image) de besoin d'un réglage manuel seulement atteint par des mains expertes. En effet, une bonne formation peut considérablement accroître l'efficacité de cette méthode.

Des mesures in vivo de fréquences cardiaques embryonnaires (de -18,5) propose une évaluation physiologique de la fonction cardiaque par une imagerie en temps réel non invasif, différente des méthodes précédentes, il nepas nécessiter une laparotomie. Au lieu de cela, le marquage de la position des embryons sur l'abdomen de la femelle enceinte assure un alignement correct et préserve leur état physiologique. Ainsi, la procédure de surmonter la principale faiblesse d'autres technologies d'imagerie, comme la tomodensitométrie et l'imagerie par résonance magnétique. Last but not least, cette méthode est moins coûteuse.

Quelques étapes critiques dans ce procédé comprennent en maintenant la température corporelle et le rythme cardiaque de la souris enceinte stable en ajustant la position de la lampe de chauffage et de génération d'un taux convenable de l'isoflurane à maintenir l'état physiologique de l'embryon et l'acquisition de données fiables. En procédant de manière cohérente et dans les plus brefs délais est essentielle. Par conséquent, en gardant la procédure simple et pratique avant de procéder est fortement recommandé.

En conclusion, en mode M échocardiographie est une méthode efficace pour évaluer le rythme cardiaque embryonnaires in utero. Anomaliesles fréquences cardiaques mal indiquent un dysfonctionnement cardiaque et la méthode décrite permettront spécialistes, ainsi que des non-spécialistes, pour dépister les anomalies de développement menant à l'insuffisance cardiaque dans des modèles murins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406v2	1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic Clear
Electrode gel	Parker Laboratories Inc.	Spectra 360
Ophthalmic gel	Novartis	Tear-Gel
Depilatory cream	Church Dwight Co., Inc.	Nair
Hair clipper
Gauze/cotton swap	Q-tips
Permanent marker
High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System	Visual Sonics	Vevo770
30 MHz Transducer	Visual Sonics	RMV707B
Imaging platform and physiology controller unit	Visual Sonics
Anesthetic System	Cyprane North America Inc.	312462
Infrared heating lamp