Summary
Это видео демонстрирует простой и надежный стратегию подготовки чистых культур эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга в течение 10-12 дней и будет полезна для исследования сосредоточены на многие аспекты мозговой ангиогенеза.
Abstract
Эмбриональные мозг эндотелиальные клетки могут служить в качестве важного инструмента в изучении ангиогенеза и развития нервно-сосудистого и взаимодействий. Два сосудистые сети эмбрионального переднего мозга, мягкой мозговой оболочки и Перивентрикулярная, пространственно отличительные и имеют различное происхождение и динамику роста. Эндотелиальных клеток из мягкой мозговой оболочки и перивентрикулярных сосудистых сетей имеют уникальные профили экспрессии генов и функции. Здесь мы представляем шаг за шагом протокол для изоляции, культуры и проверки чистых популяций эндотелиальных клеток из перивентрикулярном сосудистой сети (PVECs) эмбрионального переднего мозга (конечный мозг). При таком подходе конечный мозг лишен пиальных мембраны, полученной из эмбриональных день 15 мышей фарш, расщепляли коллагеназы / диспазы, и диспергировали механически в суспензии отдельных клеток. PVECs очищают от клеточной суспензии с использованием позитивного выделение anti-CD-31/PECAM-1 антитела, конъюгированного с микросферы с помощью сильного магнитногометод разделения. Очищенные клетки культивируют на коллаген 1 покрытых чашек для культивирования в эндотелиальной клеточной культуральной среды, пока они не сливаться и далее субкультивировали. PVECs получены с этого протокола выставочная булыжник и шпинделя форме фенотипов, как визуализируется фазового контраста световой микроскопии и флуоресцентной микроскопии. Чистоту PVEC культур был создан с маркеров эндотелиальной клетки. В наших руках, этот метод надежно и последовательно дает чистые популяции PVECs. Этот протокол принесет пользу исследований, направленных на получение механистические понимание переднего мозга ангиогенеза, понимая PVEC взаимодействия и перекрестные переговоры с нейронных типов клеток и имеет огромный потенциал для терапевтического ангиогенеза.
Introduction
Ангиогенеза, нейрогенез и миграция нейронов являются важнейшими событиями в центральной нервной системе (ЦНС) развития, восстановления и регенерации. Несколько элегантные исследования показали, что эндотелиальные клетки стимулируют пролиферацию нейронов и наоборот посредством выпуска растворимых факторов и при непосредственном контакте. Мы обнаружили, что любопытно, что в большинстве этих исследований 1-3, в то время как нейронные предшественниках / нервные стволовые клетки выделяют из эмбрионального мозга, они культивировали совместно с эндотелиальных клеток из мозга взрослого человека, других источников для взрослых тканей или с эндотелиальных клеточных линий. Это может быть частично из-за технических трудностей, связанных с ОД и культивирования чистые популяции эндотелиальных клеток из эмбриональных мозга. Однако, ангиогенез, нейрогенез и миграция нейронов являются одновременно события, происходящие в порядков более надежной в эмбриональном мозге, чем в нормальном взрослом мозге. Перивентрикулярная сосудистая сеть из embryoniс переднего мозга (конечный мозг) происходит от судна, расположенного в базальных ганглиев зачатка и развивается в виде упорядоченной градиентом от вентральной спинного конечного мозга на эмбриональный день 11 (Е11) 4,5. Это сплетение сосудов перивентрикулярном сосудистой сети отличаются от мягкой мозговой оболочки сосудов на основе происхождения, анатомического расположения, характер роста, и регулирование развития 4,5. Направление распространения перивентрикулярном ангиогенеза градиента соответствует конечного мозга поперечную нейрогенного градиент. В конечном мозге, перивентрикулярная ангиогенез градиент и градиент ГАМК нейронов мигрируют по касательной перекрывает пространственно, а 6. Что касается сроков, ангиогенез градиент в преддверии нейрогенного градиента и ГАМК нейронов градиентом примерно на сутки. Таким образом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки в пространстве и времени и возможности для предоставления критических сигналы для поддержки конечного мозга нейрогенез имиграции нейронов 4,6. Таким образом, использование эмбриональных перивентрикулярных эндотелиальных клеток в сокультивирования экспериментов с нейронных клеток-предшественников и / или нейронов обеспечит более благоприятные модель для изучения нейроваскулярные взаимодействия и разработки новых путей для лечения нейродегенеративных заболеваний или ишемического / черепно-мозговой травмой.
Мы подчеркиваем важность устранения пиальных мембрану, не только для ограничения загрязнения эпителиальных клеток, но и отделить пиальных эндотелиальные клетки, которые на молекулярном уровне и функционально отличается от эндотелиальных клеток перивентрикулярном сосудистой сети 4,6 (называемые PVECs отличить от пиальных ECS) . Здесь мы описываем метод, который мы обычно используем в нашей лаборатории, чтобы получить богатый и чистый выход PVECs. Эти эндотелиальные клетки получают из эмбриональных переднего мозга, выделенных из одного тайм-беременной мыши. Они могут быть расширены, субкультивировали, и замораживали успешно для использования в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов и решения
- Покрытие 35 мм чашки для культивирования: Коллаген типа 1 раствор подается в виде водного раствора в 20 мМ уксусной кислоты (~ 100 мг белка / пробирку). Развести соответствующий объем раствора коллагена в рабочей концентрации 0,01% с использованием стерильной культуральной ткань класса воду. Coat блюда с 1 мл раствора коллагена в течение 3-4 ч при комнатной температуре (RT) или 37 ° С, или в течение ночи при 2-8 ° С. Удалите излишки раствора из чашки, покрытой и дайте ему высохнуть в течение ночи. Промойте блюдо с класса тканевой культуры водой или PBS перед добавлением СМИ. Покрытые блюда можно хранить при температуре 4 ° С в течение одного месяца.
- Подготовить всю Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM). Дополнение в DMEM (500 мл) с добавлением 10% FBS и антибиотиками противогрибковое раствора (концентрация 1x; 1 мл/100 мл). Полный DMEM можно хранить при температуре 4 ° С в течение двух месяцев.
- Подготовка аликвоту (50 мл) DMEM с ДНКазой I (0,001 мг / мл), (именуемые DMEM-ДНКазы I).
- Подготовка другой аликвоты (10 мл) в DMEM с коллагеназой и диспазы (1 мг / мл) (именуемые DMEM-collagenase/dispase).
- Подготовка эндотелиальных клеток культуральной среде (ECCM, 500 мл) с добавлением EGF (5 мкг), ECGS (100 мг) и 5 мкл антибиотической-противогрибковое раствора. ECCM можно хранить при температуре 4 ° С в течение двух месяцев.
- Prewarm все средства массовой информации перед использованием.
- Получают буфер Очистка: PBS, рН 7,2 с 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА. Держите буфер холодной (2-8 ° С).
2. Удаление эмбрионов и Препарирование мозге
Все эксперименты с использованием лабораторных животных утверждаются по уходу за животными и использование комитетов больнице Маклина и соответствовать NIH принципов для ухода и использования лабораторных животных.
- Используйте приуроченные беременных мышей CD1 (эмбриональный день 15). День влагалища открытия плагина считается эмбриональных день 0 (E0). CD1 плотины обычно производят большие пометы, поэтому 10-12 эмбрионс, как ожидается, от беременной плотины.
- Для гистеротомии, анестезию беременных мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) / Ксилазина (5 мг / кг). Для мышей примерно 20-30 г, доставить 0,3 мл раствора анестетика 10 мл / кг кетамина / ксилазина и убедитесь, что боль и страдания минимальна во внутрибрюшинных инъекций анестетика. Используйте руки сдержанность для инъекций.
- Проверьте глубокого наркоза на носок крайнем случае. Удалить эмбрионы из глубоко под наркозом мышей. Обезглавьте каждый эмбрион сразу же после снятия с матерью. Поместите эмбриональных головы в стерильные чашки Петри в лед холодной PBS.
- Следуйте гистерэктомии путем немедленного эвтаназии с анестезиологической передозировки (130 мг / кг пентобарбитала, ф), способ эвтаназии, которая согласуется с AVMA принципов для эвтаназии животных: 2013 Edition.
- Под стереомикроскопом, удалить мозг из головы с мелкими ножницами микроострийных и тонких щипцов. Примечание: высокое качество рассекатьионный необходимо успешно удалить мягкой мозговой оболочки мембраны из эмбрионального мозга. Это достигается за счет практике. Изобразительное щипцы и микронаконечник ножницы также являются ключевыми инструментами для получения хорошего рассечение.
- Используйте пинцет, чтобы получить уверенный захват на мозг и микроострийных ножницами, чтобы очистить от мягкой мозговой оболочки мембраны. Снимите среднего мозга и задний мозг и изолировать конечного мозга. Трансфер пиальных без конечного мозга от всех эмбрионов в 35 мм культуры блюдо с 2 мл PBS в лед.
3. Выделение клеток
- Фарш конечного мозга в 1-2 фрагментов мм с лезвием скальпеля и собирать ткани в 15 мл Сокол пробирку, содержащую 2 мл полной DMEM.
- Диссоциируют ткани осторожно, но тщательно с 1 мл пипетки до сгустки не исчезнут и молочно подвеска достигается.
- Центрифуга диссоциирован клетки при 800-1000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок в DMEM-аз I. Аккуратно отделить сеLLS еще раз, используя 1 мл пипетки и центрифуги в 800-1000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Ресуспендируют гранул в теплой полной DMEM. Фильтр клетки через стерильный нейлоновое сито 70 мкм. Сбор отфильтрованные клетки и держать на льду.
- Соберите сотовых части нераспределенной на сетке и переварить далее с DMEM-collagenase/dispase (2 мл) в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки 3 раза в DMEM-ДНКазы I через центрифугирования при 800-1000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре. Бассейн эти клетки с отфильтрованным клеток, собранных на стадии 3.5. Вымойте всего клетки один раз с полной DMEM. Продолжать определить количество клеток и магнитные шаги маркировки. Примечание: Важно, чтобы получить один-клеточной суспензии перед магнитной маркировки.
4. Магнитный Маркировка
- Этот протокол показывает магнитный маркировки 10 7 клеток. Для количества клеток ниже 10 7, использовать тот же объем реагента и количества клеток больше, чем 10 7, расширить масштабы всех объемов реагентов и общие объемысоответственно (например, в течение 2 х 10 7 общего числа клеток, используйте удвоенного объема всех указанных реагентов). Держите все реагенты и клетки в лед.
- Определение количества клеток с гемоцитометре.
- Центрифуга клеточной суспензии при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант полностью.
- Добавить 90 мкл/10 7 клетки буфера очистки к осадку клеток после чего 10 мкл CD31 микрошарики. В микросферы, предоставляемые производителем сопряжены с моноклональными анти-CD31 мыши антитела.
- Все хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин в холодильник. Примечание: Более высокие температуры и / или более длительное время инкубации во время магнитных маркировки может привести к неспецифическое связывание.
- Промыть клеток путем добавления 1-2 мл/10 7 клетки буфера очистки и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера очистке. Перейдите к магнитной сепарации или стадии очистки.
5. Пуrification
- Поместите колонку MS в магнитном поле MACS Сепаратор.
- Промыть колонку 500 мкл буфера очистки.
- Применение клеточной суспензии на колонку. Загрузите соответствующее количество клеток в колонну MS как большее число клеток может засорить столбец. Внимание: Каждый столбец MS может вместить максимальное количество 2 х 10 7 клеток, для большего числа клеток, используйте несколько столбцов.
- Соберите и выбросьте проточные, содержащий немеченые клетки.
- Промывной колонны с 500 мкл буфера очистки три раза. Во время промывания, убедитесь, что резервуар колонка пуста, прежде чем добавлять последующие буферных очистки аликвоты.
- Удалить столбец из сепаратора MACS и поместите его на 15 мл трубки Сокол.
- Плунжер подается вместе с колонки MS. Внесите 1 мл буфера очистки на колонку MS и сразу же избавиться от магнитно меченых клеток, крепко нажимая на поршень в колонну.
- Тарелка челлс на 35 мм чашку для культивирования, предварительно покрытый коллагеном типа 1 и расти клетки в ECCM в инкубатор на 37 ° С с 95% О2 и 5% CO 2.
- Изменение среды каждые четыре дня. Используйте PVECs для экспериментов или субкультуры через 10-12 дней, когда блюдо конфлюентно.
6. Субкультура PV ECS
- Снимите ECCM и промойте монослоя PVECS с 1-2 мл стерильного PBS.
- Осторожно добавьте 1,5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клеточный монослой.
- Верните чашку в инкубатор. В 5-7 мин, клетки будут отделяться от поверхности чашки.
- После того как клетки были отделены, сразу же добавить равный объем ингибитор трипсина и растереть несколько раз.
- Передача клеток в стерильную 15 мл сокола трубки. Центрифуга трубки при 500 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл нагретого ECCM.
- Семенной клеток для расширения культуры, И. М.старения или другие анализы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фенотипическое характеристика PVECs от дня 1-12 показана фазового контраста световой микроскопии (рис. 2). Клетки, прикрепленные к блюду на день 1 показать морфологии характеристики клеточного деления (рис. 2а). Между 5-8 дней, PVECs переход от булыжник на шпиндель образный морфологию, характерную для эндотелиальных клеток и больше похоже на его в естественных условиях состояние (рис. 2В и 2С). По 12-й день культуры PVEC достигает полного слияния (рис. 2D). PVECs можно субкультивировали легко расширить колонию (Цифры 2E-G). Чистоту культур эндотелиальных клеток была создана с эндотелиальных клеточных маркеров - Isolectin B4, CD-31/PECAM-1, фактор Виллебранда (ФВ) и VE-кадгерина и был полон решимости быть на сто процентов после субкультуры (рис. 2Н-K).
Высокое увеличение изображения PVECs получали из эмбрионов CD1, а также рулевойЭмбрионы 2-GFP 4 (которого эндотелиальные клетки выразить GFP) показаны (рис. 3). В дополнение к общей булыжник и шпинделя формы морфологии (3А-С), полигональные морфологии с тонкими процессами наблюдались также в isolectin B4-маркированы и Tie-2-GFP + ве PVECs (рис. 3D и 3E). В некоторых наших коллагеновых покрытием чашек для культивирования (в отсутствие Матригель), PVECs формируется решетки узоры, напоминающие уникальным свойством в естественных условиях перивентрикулярном сосудистой сети (рис. 3F). Это отражает высокий ангиогенную потенциал PVECs. Ангиогенеза Анализ проводили в котором PVECs (2 х 10 4 клеток) добавляли в культуральные чашки, покрытые Matrigel матрицы. PVECs показал образование надежную трубки в 18 часов (рис. 3G). Эти результаты убедительно доказывают, что эта система может быть использована в качестве пробирке модель эндотелиальных клеток в. PVECs изолированныеиз эмбрионов CD1 можно быстро помечены Qdot нанокристаллов (рис. 3Н), которые обеспечивают интенсивный стабильную флуоресценции в цитоплазму живых клеток и могут быть использованы для долгосрочных исследований живых PVECs, включая миграцию, подвижность, морфология, клеточной функции анализов как а также естественных условиях экспериментов в. PVECs можно трансфицировать клеток индикаторов, таких как сотовый Light ПЛАЗМАЛЕММЫ-RFP, BacMam 2.0 (рис. 3I) в соответствии с указаниями изготовителя для четкой визуализации морфологии клеток в живых экспериментов изображений клеток.
Мы культивировали PVECs не только в ECCM, а также в головном мозге крыс эндотелиальных клеток ростовой среде (RBECGM) и DMEM среде F12. Оба фазового контраста (фиг. 4A, 4C, и 4E) и isolectin B4 помечены изображений (фиг. 4B, 4D, и 4F) из PVECs, культивированных в ECCM (фиг.4А и 4В), RBECGM (фиг. 4C и
Рисунок 1. Схема изоляции PVEC. Протокол, используемый для выделения и рurification из PVECs из эмбриональной мозге резюмируется в схему. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Фенотипическая характеристика PVECs. (АГ) Фаза контрастные изображения PVEC культуры в различные моменты времени после посева. (A) PVEC культура в день 1. Клетки приложил и показать разделительные морфологии. (B) PVEC культура на 5-й день и (С) на 8 день Переход от булыжник, чтобы шпиндель формы морфологию. (D) PVEC культура достигли слияния на 12-й день. (E) PVECs после субкультуры в день 1, (F) 5 день (G (HJ) иммунного из PVECs использованием эндотелиальные маркеры ячейки: Isolectin B4 (Н), фактор Виллебранда (Я), CD31/PECAM (J) и VE-кадгерина (К). Масштабные бары:, 100 мкм (применяется BJ), К, 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Морфологии PVECs. (AE) большом увеличении изображения isolectin B4-маркированы и Tie-2-GFP + ве PVECs показывающие булыжник и шпинделя формы морфологию (AC), а также многоугольной морфологию с тонкими длинными расширений (D, E). (<сильные> F) PVECs показывают высокую ангиогенную потенциал в блюдо культуры даже в отсутствие Матригель. (G) PVECs показать формирование надежной трубки в ангиогенеза анализа на Матригель. (H) PVECs меченные Qdot нанокристаллов. (I) PVECs трансфектированные Cell Light ПЛАЗМАЛЕММЫ-RFP, BacMam 2.0. Масштабные бары: A, 50 мкм, В, 15 мкм (применяется CE), F, 100 мкм (применяется G, H), я, 50 мкм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 4. PVECs, выращенные в различных питательных сред показать вариант морфологии. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PVEC являются более физиологически актуальным, чем взрослых эндотелиальных клетках головного мозга и ЭК из других источников тканей для исследований, посвященных сосудисто-нервных взаимодействий, а также имеют терапевтический потенциал. Для подготовки PVEC, очень важно начало с рассечения работать быстро, чтобы добиться хорошего жизнеспособность, так как мертвые клетки могут связывать неспецифически к CD31 микросферы. Кроме того, если одной клеточной суспензии не достигается до магнитной маркировки шаг, это приведет к устранению неисправностей с клеточные скопления будет забивать колонну. Преимущество этого способа в том, что нет необходимости в инкубации трипсином, чтобы отделить клетки от магнитных шариков, отнимает много времени и часто трудно шаг использованы в других магнитных борта на основе методов разделения для подготовки EC 4,7. Кроме того, этот метод изоляции не требует больших количеств эмбриональной ткани головного мозга. PVEC можно последовательно подготовлен с использованием одного таймерной беременной мыши в окoximately 12 дней, пересевают, и использованы в широком разнообразии в пробирке и в естественных экспериментов.
Чистоту PVECs после выделения составляет более 90%, но чистота PVECs после субкультуры на 100%. В дополнение к эндотелиальных клеток, РЕСАМ-1 находится на поверхности моноцитов / макрофагов. Микроглия, макрофагов население ЦНС, однако, очень низко в эмбриональном мозге мыши по сравнению с послеродовой или взрослом мозге 8. Моноциты / микроглии нужно среду, дополненную 10% эмбриональной телячьей сыворотки и специфических факторов роста, чтобы расти, они вымрут в конечном итоге в ECCM и не будет длиться после субкультуры PVECs. Когда чистота 100% PVECs необходимы немедленно после выделения (например, для тестирования экспрессии генов), мы используем клеток с возбуждением флуоресценции сортировки методом (FACS). PVECs которые затем выделяют из эмбрионов Tie2GFP (в котором только эндотелиальные клетки выразить GFP) и строго сортируются по двойной анализа FACS. Чистоту отсортированного эндотелиил клеток обеспечивается коллекции клеток, которые являются дважды положительными по GFP и CD31/PECAM-1 6.
Культуры также тесно наблюдается в первую неделю изоляции за загрязнение типы клеток, такие как перицитами. С перицитами клетки имеют неправильную форму и никогда не будет формировать сливающийся монослой в отличие от эндотелиальных клеток, которые состоят из шпинделя в форме или многоугольной, связался клеток, которые растут как колонии, они легко распознать, если присутствуют. Если загрязнение перицитов обнаружен, более низкая концентрация трипсина (0,05%) с последующей быстрой процедуры обработки трипсином (2-3 мин) используется для субкультуры PVECs. Перициты требуют более длительного времени трипсинизации (7-10 мин) и будет оставаться прилагается. Кроме того, покрытие эффективность трипсинизировали перицитами (если таковые имеются) очень плохое. Эти шаги ликвидации загрязнения перицитов и убедитесь, что субкультивировали PVECs чисты.
ECCM среда является низкий средний сыворотки, содержащей гидрокортизон,гепарин и 2% фетальной бычьей сыворотки и дополняется эпидермальный фактор роста (EGF) и эндотелиальных дополнения клеточного роста (ЭКГ). PVECs выращенные в ECCM показал веретенообразную форму морфологию последовательно. ECGM мозга крысы содержит 10% фетальной бычьей сыворотки, факторы роста, и VEGF. PVECs выращенные в этом СМИ имеют очень вытянутые морфологию и займет больше времени, чтобы достичь слияния. DMEM-F12 среду с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамаксом и эндотелиальной добавки для роста клеток и индуцирует пролиферацию больше, чем в других средах. Хотя PVECs выращенные в этом СМИ показали очень быстрый рост и достиг слияния в 4 дня, их морфологии были плоскими или многоугольной только. Мы выросли PVECs в ECCM на срок до трех проходов без потери фенотипа и функции. Поэтому ECCM это средство, которое мы предпочитаем для PVEC культуры.
PVECs совместно культивировали с нейрональных предшественников этим протоколом, вероятно, стимулируют нейрогенез и миграцию нейронов в фаг-большие экстенты чем эндотелиальных клеток из мозга взрослого человека или из других источников и могут быть полезными для помощи восстановления неврологических функций в инсульта, черепно-мозговой травмы или нейродегенеративные. Нейрональных предшественников пересаженные во взрослом мозге часто отмечаются тормозить и не мигрировать в регионах, которые требуют новых нейронов. Эта проблема объясняется отсутствием субстратах, которые облегчают миграцию нейронов, как радиальных глиальных направляющих 9. Сосудистой все чаще оценили в качестве подложек для миграции нейронов 6,10,11. PVECs может предложить решение для этих тупик нейрональных предшественников в трансплантации сайтов. Coimplantation из PVECs и нейронов в поврежденные областях мозга может способствовать руководствуясь миграцию нейронов клетками эндотелия и помочь в достижении функционального восстановления. Тесная связь эндотелиальных клеток с мигрирующих нейронов также делает их уникально подходит для доставки факторы роста и морфогены непосредственно и выборочно вмиграции нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным альянсом по изучению шизофрении и депрессии (NARSAD) премия для молодых следователь и Национальных Институтов Здоровья предоставляют R01NS073635 к AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
