Abstract
Ensaios de adesão celular / partículas são fundamentais para a compreensão das interações bioquímicas envolvidas na fisiopatologia da doença e têm aplicações importantes na busca pelo desenvolvimento de novas terapias. Os ensaios com condições estáticas não conseguem captar a dependência da adesão em cisalhamento, limitando a sua correlação com o ambiente in vivo. Câmaras de fluxo de placas paralelas que quantificam a adesão sob fluxo de fluido fisiológico precisar de vários experimentos para a geração de um mapa de adesão ao cisalhamento. Além disso, elas não representam a escala in vivo e morfologia e requerem grandes volumes (~ ml) de reagentes para os experimentos. Neste estudo, demonstramos a geração de mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento usando uma rede microvascular baseado dispositivo micro, SynVivo-SMN. Este dispositivo recria o complexo na vasculatura vivo incluindo escala geométrica, elementos morfológicos, as características de fluxo e interações celulares em umin vitro formato, proporcionando assim um ambiente biologicamente realista para pesquisa básica e aplicada no comportamento celular, distribuição de medicamentos, e descoberta de drogas. O ensaio foi demonstrada pelo estudo da interacção das partículas de 2 um revestido com biotina com as superfícies revestidas com avidina da microplaca. A gama inteira de corte observada na microvasculatura é obtido com um único ensaio permitindo adesão versus mapa de cisalhamento para as partículas sob condições fisiológicas.
Introduction
Os ensaios correntes para estudar a célula-célula e as interacções célula-partículas tipicamente envolvem formato bem prato estático, em que as partículas ou as células são incubadas em matrizes de proteínas ou células aderentes. No final do tempo de incubação específico, o número de partículas aderentes ou células são quantificados usando microscopia 1. Mesmo que estes ensaios fornecem um panorama significativo para os processos bioquímicos por trás dessas interações, uma limitação importante é a falta de fluxo de fluido fisiológico (típico da microcirculação) e seu impacto sobre a adesão de partículas.
Para superar esta limitação, na câmara de fluxo in vitro têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Um elemento comum destas câmaras de fluxo é um aparelho transparente perfundidos a baixo número de Reynolds para combinar taxas de cisalhamento de parede observadas nos vasos sanguíneos in vivo 2. A parede do vaso é modelado por qualquer revestimento de biomoléculas ou crescimento de células numa superfície do fluxo cHamber 3. Partículas 4-7 ou células 8-16 são então fluiu na faixa desejada de taxas de fluxo para quantificar o número de aderir partículas sob várias taxas de cisalhamento.
No entanto, a utilização de câmaras de fluxo de placa paralelas para estudar e validar os fenómenos bioquímicos é bastante dispendioso e moroso. Isto é principalmente devido ao fato de que as múltiplas experiências devem ser conduzidas para gerar um mapa de cisalhamento de fluidos em relação ao número de partículas / células aderidas. Além disso, as câmaras de fluxo de placa requerem grandes volumes de reagentes, devido ao seu grande tamanho (altura> 250 um e largura de> 1 mm),. Finalmente, estes dispositivos não modelar de forma precisa (por exemplo, características geométricas, bifurcações) e as condições de fluxo (por exemplo, contra os fluxos divergentes convergentes) que estão presentes in vivo.
Os recentes avanços na litografia baseada microfabricação 17-19 aceleraram o campo de lab-on-a-chipdispositivos 20-21. Estes dispositivos têm sido fundamentais para o desenvolvimento de uma versão em miniatura da câmara de fluxo de placas paralelas com dimensões no regime micrômetro. A redução da dimensão também produz benefícios significativos em termos de volumes de reagentes, células ou partículas necessária para os experimentos. No entanto, uma limitação chave dos dispositivos actualmente disponíveis é a utilização de canais lineares para modelar microvasos, que não mimetizam a microvasculatura complexo observada in vivo.
Recentemente, desenvolveu uma nova metodologia para a recriação de redes microvasculares sobre substratos de plástico descartáveis, resultando em representação sintética das condições in vivo. Estes dispositivos denominado Redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SMN) são desenvolvidos utilizando PDMS processo soft-litografia baseia. Dispositivos SynVivo-SMN pode ser usado para obter mapa de adesão ao cisalhamento de celular / partícula adesão 22, o estudo direcionado a entrega da droga e 23 have foi validado contra dados in vivo 24-25. Neste artigo, apresentamos um protocolo que permite a geração do mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento em volumes tão pequenos quanto 1-5 mL, assim, resultando em significativa economia de recursos e tempo.
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Protocol
1. Priming o dispositivo micro-SynVivo SMN
- Cada porta (entrada / saída) do dispositivo é constituída por duas portas paralelas - uma para fluir em porções de revestimento de superfície (moléculas de adesão, as matrizes de crescimento, etc) e / ou de células de sementeira e o outro para a execução do ensaio (Figura 1A ).
- Completamente submergir o dispositivo de microfluidos SynVivo-SMN (Figura 1B) em uma placa de Petri contendo estéril desionizada (DI) e colocar o prato num exsicador de vácuo. Permitir que o exsicador para rodar até que todo o ar foi removido dos circuitos do dispositivo. Isso deve levar cerca de 15 min.
- Antes de retirar o dispositivo da água, coloque tubos Tygon (OD de 0,06 "e ID de 0,02") preparado com água em cada porta do dispositivo com uma pinça de ponta fina. O tubo deve ser de aproximadamente 1 cm em comprimento. O dispositivo pode agora ser removido a partir da água. Figura 1C mostra uma imagem do multenviar um e com o tubo.
2. Revestimento do dispositivo micro com proteína desejada (por exemplo, Avidin)
- Usando uma pipeta, colocar uma gota de água (cerca de 100 ul) à volta da base do tubo de uma porta de entrada. Remova cuidadosamente o tubo usado para preparar o dispositivo. A gota de água vai impedir que o ar que entra no dispositivo.
- Prepara-se uma seringa de 1 ml carregada com avidina a uma concentração de 20 ug / ml. Conecte a seringa a uma agulha de aço inoxidável 24 G e tubos. Inserir o tubo a uma das portas de entrada do dispositivo. Prenda a porta de entrada não está sendo utilizada com uma braçadeira da mandíbula.
- Injectar avidina a uma taxa de fluxo de 1 mL / min durante 10 min para permitir a perfusão completa do dispositivo. No final do tempo de escoamento, apertar o tubo com o grampo de mandíbula e colocar o dispositivo a 4 ° C durante a noite.
3. Fluindo o Biotinylated Partículas para experimentos de adesão
- Permitir que o dispositivovoltar à temperatura ambiente. Colocar o dispositivo sobre um microscópio invertido de fluorescência equipado com um estádio motorizado e uma câmara de alta performance.
- Prepara-se uma solução de 2 mM partículas biotinilados numa concentração de 5 x 10 6 / ml, em partículas de Tampão Fosfato Salino (PBS). Carregar as partículas numa seringa de 1 ml. Prepara-se uma segunda seringa de 1 ml de PBS apenas. Coloque cada seringa em uma bomba de seringa e se conectar a agulha e tubos.
- Usando uma pipeta, colocar uma gota de água (cerca de 100 ul) à volta da base do tubo da porta de entrada. Cuidadosamente remover a tubagem utilizada para o revestimento do dispositivo. A gota de água vai impedir que o ar que entra no dispositivo.
- Insira com cuidado o tubo de partículas para biotinilados e PBS a partir do passo 3.2 em cada uma das portas de entrada. Figura 2A mostra imagem do set-up.
- Começam a injectar partículas biotinilados a um caudal de 2,5 mL / min. Monitorar a porta de entrada no microscópio. Ao primeiro sinaldas partículas, começa a contagem regressiva e continuar o fluxo por 3 min.
- No final dos 3 minutos, parar o fluxo de partículas biotinilados enquanto simultaneamente encarando o fluxo de PBS a uma taxa de fluxo de 2,5 mL / min. Permitir PBS a fluir no dispositivo por 3 min para lavar partículas livres.
4. Aquisição de Imagens e tornando a área de interesse (AOI) Medidas Usando Software Imaging (NIKON Elements)
- Use a função "imagem grande varredura" no software de imagem para obter a imagem de todo o dispositivo.
- Número sequencialmente as bifurcações do dispositivo e criar uma AOI circular com duas vezes o diâmetro dos canais. Neste caso, definir o diâmetro AOI a 200 um, uma vez o diâmetro do canal é de 100 um.
- Use a função de contagem automática no software de imagem para exportar o número de partículas em cada AOI para uma folha de MS Excel.
- Da mesma forma, usar o recurso de contagem automática para exportar o número de partículas em toda adispositivo.
5. Partículas Análise de Fluxo Utilizando Dinâmica dos Fluidos Computacional (CFD) Modelos
- Simulações de CFD são executados através de software disponível comercialmente (CFD-ACE +, ESI Inc.) para a topologia dispositivo SynVivo-SMN. Os resultados são armazenados numa base de dados para a análise de observações experimentais. Os resultados da simulação armazenar informações sobre as taxas de cisalhamento de parede, velocidade, fluxo de partículas e de adesão no dispositivo.
- Os resultados de simulação são usados para determinar o número de partículas que entram cada AOI com base em uma dada concentração de partículas de entrada.
6. Geração de cisalhamento Adesão Mapa
- Calcular% de adesão através da divisão das partículas aderentes na bifurcação das partículas que fluem na bifurcação, como mostrado na equação 6.1.
em que o número de partículas aderidas e as partículas fluem são obtidos a partir de protocolo os passos 4.3 e 5.2, respectivamente. - Traçar o mapa de adesão ao corte com base na taxa de cisalhamento em cada bifurcação das redes obtidas a partir da base de dados na etapa (5.1) e os valores de aderência% obtidos a partir da equação 6.1.
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Representative Results
A Figura 1A mostra uma de uma imagem de campo brilhante e esquemática do dispositivo SynVivo-SMN. Figura 1B mostra o dispositivo SynVivo-SMN montado sobre uma lâmina de vidro. Figura 1C mostra o dispositivo com tubo seguinte priming com água num exsicador de vácuo.
A Figura 2A mostra uma imagem do experimental-configurado. Figura 2B mostra um típico dispositivo revestido de avidina SynVivo-SMN após a ligação de 2 mM partículas biotinilados. Note-se que as partículas aderem preferencialmente perto das bifurcações na rede.
A Figura 3A mostra as bifurcações numerados na rede SynVivo-SMN. Figura 3B mostra o mapa de cisalhamento da amostra gerada pelo modelo de CFD do dispositivo. A taxa de corte varia no dispositivo que varia a partir de 250 seg -1 a 15 s -1, como observado na microvasculatura in vivo. Note-se que estes variandotaxas de corte não pode ser obtida, simultaneamente, em canais de microfluidos lineares que proporcionam uma taxa de corte constante, para cada taxa de fluxo. Figura 3C mostra um gráfico dos valores da velocidade de corte em cada uma das bifurcações da rede. Os dados mostram que os padrões de velocidade de corte são complexos e não podem ser obtidas com um relacionamento analítico simples ao contrário de canais de fluxo linear. Além disso, várias bifurcações (AOIs) estão presentes na rede que caem no mesmo compartimento de cisalhamento, adicionando à confiança estatística dos dados.
A Figura 4A mostra os resultados da amostra de análise de CFD para fluxos de partículas na rede, que são utilizados para calcular os fluxos de partículas nos ramos e bifurcações da rede experimental. Figura 4B mostra o mapa de adesão corte calculado a partir de uma única experiência SynVivo-SMN. Os mapas de adesão ao cisalhamento segue a relação inversa, como observado a partir do mapa de adesão ao cisalhamento obtidos a partir deexperiências de canais lineares. No entanto, em contraste, utilizando um ensaio SynVivo, uma única experiência permite a geração do mapa de cisalhamento, ao contrário de vários ensaios experimentais necessários dos canais lineares, resultando em poupanças significativas de tempo e recursos. Note-se que as experiências são executados em triplicata para análise estatística máxima.
Figura 1. Dispositivos SynVivo-SMN. Painel esquerdo (Figura 1A) mostra um diagrama esquemático do dispositivo. Imagem de campo brilhante do dispositivo de painel direito (Figura 1A) mostra. Figura 1B mostra o dispositivo SynVivo-SMN montado na lâmina de vidro do microscópio. Figura 1C mostra o dispositivo com um tubo de Tygon ™ ligados às portas de entrada / saída seguintes priming com água.
Figura 2. Ensaio de adesão típica em SynVivo-SMN. Figura 2A mostra uma imagem do experimental set-up. Figura 2B mostra partículas biotinilados após a ligação no dispositivo. Note-se que a adesão de partículas é encontrado para ser localizado perto de bifurcação em comparação com os ramos da rede.
Figura 3. Análise de cisalhamento em SynVivo-SMN. Figura 3A mostra todas as bifurcações numeradas na rede e uma vista ampliada de bifurcações dos experimentos. Figura 3B mostra o mapa de corte na parede qualitativa nas bifurcações na rede. Figura3C mostra a informação quantitativa sobre corte nos ramos da rede. Note-se que os padrões de corte na rede são complexos e abrangem os intervalos fisiológicos de taxas de cisalhamento (0-240 seg -1) encontrados in vivo.
Figura 4. Geração de mapa de adesão ao cisalhamento. Figura 4A destaca as trajetórias de partículas (mostradas em branco) nas redes obtidos a partir da simulação CFD. Essas trajetórias são pós-processados para obter fluxos de partículas nos diferentes ramos e as bifurcações. Figura 4B mostra o mapa de adesão ao cisalhamento obtida a partir de um único experimento SynVivo-SMN.
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Discussion
Câmaras de fluxo de placas paralelas, proporcionando insights significativos sobre as interacções célula-célula e célula-partículas, sofrem de várias limitações, tais como o elevado consumo de reagentes e a necessidade de vários ensaios experimentais para gerar um mapa de adesão de cisalhamento. O uso de redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SynVivo-SMNs) permite a geração de um mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento em condições que imitam as condições in vivo. Além disso, uma economia significativa (> 95%) em reagentes também é obtida.
O passo mais importante na execução de experimentos de adesão de partículas com SynVivo-SMN é garantir condições de liberdade bolha no chip antes da experimentação. Introdução de bolhas levaria a fluir instabilidade e falta de acesso a "ar bloqueado" regiões do chip. Por isso, muito cuidado deve ser tomado durante inserções e extrações de tubulações a partir dos portos do dispositivo. No caso de uma bolha encontrado em podispositivo de e durante o passo de iniciação, pode-se repetir o passo de iniciação de novo para remover as bolhas. Alternativamente, pode-se fluir em media / reagentes em um baixo índice de fluxo (0,1 mL / min ou menos) para assegurar livre de bolhas de iniciação do dispositivo.
A principal limitação do protocolo é o chip ser inutilizado após a presença de uma bolha que não pode ser removido. No entanto, com a prática de cuidado pode-se realizar experimentos com perto de 100% de sucesso. Além disso, a geração de mapa de adesão ao cisalhamento requer informações a partir de modelos de CFD. No entanto, uma base de dados pré-calculado de resultados de CFD para diferentes condições de escoamento pode facilmente ultrapassar a necessidade de realizar as simulações de CFD.
Embora, a metodologia apresentada aqui utilizado o sistema de avidina-biotina para facilidade de demonstração, qualquer combinação de ligando-receptor em partículas ou células pode ser usada para ser estudo de partículas na superfície ou as interacções da superfície celular em tempo real no dispositivo. Além disso, as células podem ser cultured no dispositivo para estudar as interacções célula-partículas e célula-célula. Cultura de células necessitará de revestimento dos canais do dispositivo de matriz adequados para tipos de células desejadas. Por exemplo, as células endoteliais podem ser cultivadas em canais revestidos de fibronectina. Após a confluência, as células endoteliais podem ser activadas com TNF-α ou outras citocinas relevantes. Glóbulos brancos (leucócitos) pode ser injetado e suas interações sobre as células endoteliais ativadas pode ser estudado em tempo real. Semelhante ao protocolo demonstrado neste estudo, um mapa de adesão de cisalhamento de glóbulos brancos podem ser facilmente gerados a partir de uma única experiência.
O protocolo mencionado no presente documento pode ser utilizada para estudar o efeito da morfologia da rede na adesão de partículas / célula, como um modelo de condições in vivo. Além disso, o efeito do fluxo sobre a adesão de partículas / célula e o comportamento celular para modelar condições fisiológicas pode também ser prontamente avaliada. Por fim, o protocolo pode ser-nosed para estudar a entrega da droga e eficácia para entrega direcionados para populações celulares desejados.
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Disclosures
Taxa de publicação deste artigo patrocinado pela CFD Research Corporation.
Acknowledgments
Tecnologia SynVivo foi desenvolvido sob concessão # 2R44HL076034 do NHLBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
References
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