Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Устранение одну клетку от Восемь клеток эмбрионов из амфипод ракообразных Published: March 16, 2014 doi: 10.3791/51073
Automatic Translation
1, 1
1Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University

Summary

Амфипода Parhyale hawaiensis является перспективным модельным организмом для изучения ракообразных эмбриологии и сравнительной развития членистоногих и эволюции. Этот протокол описывает способ ручного удаления отдельных бластомеров из ранних эмбрионов на стадии дробления из Parhyale.

Abstract

Амфипода Parhyale hawaiensis небольшой рачок найдено в приливных морских мест обитания по всему миру. За последние десять лет, Parhyale стала перспективный модельный организм для лабораторных исследований развития, обеспечивая полезное сравнение аутгруппе к хорошо изученной членистоногих модельного организма дрозофилы. В отличие от синцитиальных расколов дрозофилы, ранние расколы из Parhyale являются holoblastic. Отображение Судьба использованием индикаторных красителей внедрен в начале бластомеров показали, что все три зародышевых листка и зародышевой линии устанавливаются на стадии восьми клеток. На данном этапе, три бластомеры суждено привести к эктодермы, три суждено привести к мезодермы, а остальные две бластомеры являются предшественниками в энтодермы и зародышевой линии соответственно. Тем не менее, бластомера эксперименты абляции показали, что эмбрионы Parhyale также обладают значительной нормативной capabilitiэс, например, что судьбы бластомеров удалена на стадии восьми клеток может быть передана потомкам некоторые из оставшихся бластомеров. Бластомер абляция была описана ранее одним из двух способов: инъекции и последующей активации фототоксических красителей или ручного удаления. Тем не менее, фотоабляцию убивает бластомеры но не удаляет мертвое тело клеток из эмбриона. Поэтому Полное физическое удаление конкретных бластомеров может быть предпочтительным методом абляции для некоторых приложений. Здесь мы приводим протокол для ручного удаления отдельных бластомеров от стадии восьми клеток эмбрионов Parhyale, иллюстрирующие инструменты и ручные процедуры, необходимые для полного удаления тела клетки, сохраняя при этом оставшиеся бластомеры жив и нетронутыми. Этот протокол может быть применен к любой клетке Parhyale на стадии восьми клеток, или к бластомеров других этапах рано спайности. Кроме того, в принципе этот протокол может быть применимо к ранней CleaВаге этап эмбрионы других holoblastically расщепляющих морских беспозвоночных.

Introduction

Амфипода ракообразное Parhyale hawaiensis которая сформировалась в течение последнего десятилетия в качестве перспективного модельного организма с большим потенциалом для использования в эволюционной биологии развития исследований 1. Среди членистоногих, большинство модельных систем являются насекомые, и наиболее изученным из них является плодовой мухи дрозофилы D.. MELANOGASTER является членом отряда насекомых двукрылых, и как такие дисплеи многих эмбриологических особенностей, которые являются производными по отношению к тем из базально ветвящихся насекомых 2. Кроме того, насекомые вложены в Подтип Pancrustacea 3, а это означает, что насекомые имеют своих ближайших родственников в давней «естественной» группы под названием pancrustaceans, и что эта группа парафилетическими. Это говорит о том, что в дополнение к базально ветвления модели насекомых, исследования других ракообразных обязаны получить более широкий взгляд на эволюционной истории черт развитияй молекулярные механизмы, которые были так хорошо изучены в D. MELANOGASTER. Однако, очень немногие ракообразные были хорошо известны для экспериментального лабораторного анализа развития. Амфипода П. hawaiensis является весьма сговорчивым лабораторная модель системы, поддаются диапазоне экспериментальных методик. Амфиподы отображения много уникальных особенностей в их родительской надотряда Peracarida (пляж бункеры, бокоплавы и креветки а), и, следовательно, считается, относительно полученных в рамках этой группы ракообразных. Тем не менее, относительная легкость эмбрионального и функциональной генетической манипуляции, предлагаемых Parhyale сделать это амфипода ценным дополнением к текущей инвентаризации модельных организмов.

В лабораторных животных, P. hawaiensis дает много преимуществ. Животные толерантны в широком диапазоне температур и солености, а также хорошо выживают в больших культур искусственной морской воде 1. Легко отличить межосевомEEN мужчины и женщины, основанные на четких морфологических различий, в первую очередь, крупных, крючковатый, передних магистральных придатков, что мужчины используют, чтобы понять самок во время спаривания. Для эмбрионального и развития работы, П. hawaiensis имеет несколько очень привлекательных черт. Эмбриогенеза длится примерно 10 дней, а время до половой зрелости примерно через шесть недель на 28 º C (но учтите, что Parhyale хорошо выживает при температуре от примерно 20-30 ° С, и что подробная развития информация постановка доступен для эмбрионов, поднятых на 18 º C 4 , 25 º C 4, и 26 º C 5,6). Взрослые спариваться круглый год в лаборатории, так эмбрионы доступны в любое время года. Самки откладывают 2-20 (в зависимости от возраста женщины) оплодотворенных яиц в брюшной выводковой сумке, расположенной между первым нескольких пар ног (1А и 1В), а можно собрать эти эмбрионы очень ранней стадии развития, не убивая самку или повреждения эмбрионов (рис. 1в). Эмбрионы выжить в фильтрованной искусственной морской воде до вылупления, могут быть зафиксированы для последующего экспрессии генов или гистологического анализа 7, и подробное промежуточная таблица позволяет точно идентифицировать прогресс через развитие 5. Прочные протоколы были использованы для выполнения анализа экспрессии генов путем в гибридизация 8-15 или иммунного окрашивания 4,16,17, функциональный нокдаун РНК-интерференции 13,15 или 12, Morpholinos и стабильной зародышевой линии трансгенеза 18. Использование трансгенеза систему, индуцируемой экспрессии 14 и энхансерной ловушку 19 методы также могут быть использованы для изучения функции генов в P. hawaiensis. В то время как в открытом доступе последовательность генома в настоящее время недоступен, транскриптома содержащие стенограммы производится во время оогенеза и эмбриогенеза пчелн заново собран и аннотированный 20, и хранение в базе данных для поиска 21, облегчая обнаружение генов. В общем, P. hawaiensis является весьма сговорчивым модель организма подходит для нескольких экспериментальных и генетических подходов к пониманию развития.

В отличие от ранних синцитиальных сколах D. MELANOGASTER, П. эмбрионы hawaiensis расщеплять holoblastically следующие оплодотворение (рис. 2а). Анализ трассировки Lineage показал, что по третьему расщепления, каждый из бластомеров третьей расщепления специально суждено привести к одному из трех зародышевых листков или зародышевой линии 6 (фиг. 2В). Эти данные вместе с микрочипов данных 22, клеточной линии анализирует 6,23 и изоляции бластомеров эксперименты 4 предположили, что потенциалы развития сегрегированны по меньшей мере некоторым третьим бластомеров расщеплению асимметричного наследования челл судьба детерминанты. Соответственно, в бластомеров абляции экспериментов, в которых зародышевой линии предшественник (называется "г" в Parhyale клеточных клонов номенклатуре 6) удаляли на этапе восемь клеток, эмбрионы не было половых клеток на более поздних стадиях развития 4, как показано отсутствие клеток выражая белка Vasa, который является маркером зародышевой линии в большинстве многоклеточных 24. В противоположность этому, соматические бластомера эксперименты абляции показал, что П. эмбрионы hawaiensis также обладают значительными нормативные возможности, такие, что судьбы мезодермы или эктодермы бластомеров предшественников удалена на стадии восьми клеток может быть передана потомкам некоторые из оставшихся бластомеров 25. Как регулятивный замена судьба клетки может произойти, и степень автономного принятия клеточных судеб соматическими бластомеров, остается неизвестным. Экспериментальные эмбриологические методы, такие как бластомеров абляции может быть полезно в understanдинь относительная автономия и nonautonomy из клеточных судеб решений 26,27 и поэтому интерес к изучению P. hawaiensis эмбриогенеза.

В экспериментах, которые продемонстрировали регулятивный замену эктодермальных и мезодермальных линий, бластомер абляция была выполнена в виде инъекций 28 и последующего возбуждения фототоксических красителей 25. Хотя этот метод является эффективным средством уничтожения введенного бластомера (ы), он не полностью удалить труп клеток из эмбриона. Кроме того, различия наблюдались между данными клеточной линии, собранных до гаструляции стадиях эмбриогенеза путем введения бластомеров с люминесцентными клона индикаторов 28,29 и данных, собранных следуя невозмущенные бластомеры через развитие тех же эмбриональных стадиях 23. Поэтому Полное физическое удаление конкретных бластомеров может быть предпочтительным методом абляции для некоторых приложений.

Мы ранее были опубликованы результаты клеточной линии анализирует эмбрионов, в которых отдельные клетки вручную удалена 23. Тем не менее, тонкие операции, необходимые для удаления отдельных бластомеров от ранней стадии эмбрионов расщепления до сих пор не полностью описаны. Здесь мы приводим протокол для сбора P. эмбрионы hawaiensis и руководство абляция одной бластомера от стадии эмбриона восьми клеток. Цель этого метода состоит в достижении полного удаления тела клетки от эмбриона, что позволяет наблюдать сотовых поведения и клеточных судеб компетенции остальных клеток во время эмбриогенеза и постэмбрионального развития. Наш протокол показывает удаление зародышевой линии предшественника г (рис. 2в), но могут быть применены к любой клетке на стадии восьми клеток, или к бластомеры ранних стадиях дробления. В принципе, этот протокол может применяться для удаления отдельных клеток из ранних эмбрионов на стадии дробления на флористикуг holoblastically расщепления морских беспозвоночных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Комментарии, которые могут быть полезными при выполнении определенные шаги выделены курсивом.

1. День 1: Получение материалов

  1. Подготовьте следующие материалы (см. таблицу материалов и оборудования):
    • 15 см и 22 см Пипетки Пастера
    • Алмазный писец
    • фильтруют искусственной морской воде (соленость между 0.0018-0.0020), содержащий 1 мг / мл амфотерицина В (1:100 из 100 мг / мл маточного раствора), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина (1:50 исходного раствора содержащий 5000 единиц / мл пенициллина и 5000 мг / мл стрептомицина)
    • фильтруют искусственный морской воды (соленость между 0.0018-0.0020) без добавок
    • большой пластиковый контейнер для жилищных пары (не менее 15 см х 15 см х 5 см)
    • маленькие (3 см или 5 см) чашки Петри выложены Sylgard
    • маленькие (3 см или 5 см) чашки Петри
    • часовое стекло или стекло мульти-луночный планшет
    • щипцы (мы используем тупые щипцы получены сюдам старый Дюмон # 5 щипцы, которые были случайно повреждены в других лабораторных процедур, которые мы многократно использовать с помощью щипцов точильный камень для того, чтобы концы щипцами гладкие, что оба зубья имеют одинаковую длину, и что они больше не имеют острые моменты. Чрезвычайно тонкий пинцет, такие как новые Дюмон # 5 щипцами, нежелательны, поскольку они могут повредить эмбрионов и / или женщины.)
    • пипетки Пастера с конца расширились (см. шаг 1.2 ниже)
    • эмбрион инструмент поиска, состоящий из тонкой проволоки, изогнутой вольфрама, введенного в тонком конце пипетки Пастера (можно заменить альтернативы реализации, см. ниже 1,3)
    • рот пипеткой с небольшим отверстием (см. шаг 1.4 ниже)
    • стакан игла сделана из вытащил стеклянный капилляр (см. шаг 1.5 ниже)
    Ни один из материалов токсичные для человека не используются в данном протоколе. Тем не менее, исследователи должны гарантировать, что они носить перчатки или другую защитную одежду в соответствии с требованиями Guidel управления рискамиИнес их учреждения.
  2. Чтобы расширенной пипетки Пастера, первый счет примерно в 15 см пипетки Пастера в точке, где начинается пипетки, чтобы сузить с алмазным надрезе, обернуть набрал область пипетки в Kimwipe или бумажным полотенцем, чтобы защитить пальцы, а затем тщательно прекращаться чаевые в счет линии. Держите сломанный конец пипетки над пламенем горелки Бунзена в течение нескольких секунд, чтобы сгладить края. Открытие должна быть немного уже, чем максимальная ширина пипетки.
  3. Чтобы проволочную инструмент рассекает вольфрама, вставить вольфрамовой проволоки в конце 15 см стекло пипетки Пастера и кратко держать над пламенем горелки Бунзена, чтобы расплавить стекло, фиксации провода на месте. Используйте пинцет, чтобы аккуратно кривая конец провода в крючковатым форме. См. Рисунок 3 для примера соответствующего форме для этого инструмента.
  4. Чтобы сделать небольшое отверстие для рта пипетки, потяните тонкий конец 22 см пипетки Пастера на две части О.В.э пламя, и разорвать кончик маленьком конце. Вставка в конце держателя пипетки рта.
  5. Сделать стеклянную иглу, которая будет использоваться для прокола бластомеров интересов во время процедуры абляции с помощью иглы съемник. Соответствующей формы игла показано на рисунке 4. Эта игла была разобрана на Саттер P97 иглы съемник с помощью программы с параметрами 2x (тепло = 566, потяните = 100, скорость = 20, время = 250) + 1X (тепло = 566, потяните = 100, скорость = 100, время = 250). Конкретная программа и инструмент, используемый, чтобы сделать иглу может варьироваться, но игла должны быть тонкий момент, но также может быть достаточно крепким, чтобы не сломать, когда толкнул хориона зародыша.

2. День 1: сбор Parhyale Спаривание Пары

  1. Используйте расширенную пипетки Пастера (шаг 1.2 выше), чтобы собрать спаривания P. hawaiensis пары от большого культуры контейнере, и передавать их на отдельном контейнере, содержащий сопираться искусственный морской воды. Это не обязательно, что эта морская вода фильтруется. Лучше всего собирать спаривания пар в поздним днем ​​и оставить пары при комнатной температуре (20-23 º C) в течение ночи, таким образом, чтобы на следующее утро, большинство эмбрионов будет были недавно оплодотворенная и хранение, и, таким образом на ранней стадии расщепления подходит для абляции. Соберите по крайней мере 20 спаривания пар для того, чтобы некоторые женщины будут нести ранней стадии эмбрионы расщепления к следующему утру.

3. День 2: Сбор Parhyale Эмбрионы

  • На следующее утро, настоять отфильтрованный искусственный морской воды (FASW) с CO 2. Некоторые из женщин будет плавал свободный от своих мужчин в течение ночи; собирать эти разделенные самок и обезболить их в FASW / CO 2. Остальные непарные самцы могут быть удалены из спаривания пары контейнера и возвращается в большой культуры. Остальные пары спаривания могут быть сохранены для получения эмбрионов спустяв тот же день или на следующий день.
  • Переместить единичный анестезированы женщина, перевозящих эмбрионов часовым стеклом в FASW / CO 2. Все самки, разделенных скорее всего сдали на хранение яйца, которые будут видны невооруженным глазом в виде бледно-розовый или фиолетовый сфероидов через прозрачные коксальных пластинок самок (рис. 1А). Чтобы определить, эмбрионы на ранних стадиях дробления и таким образом подходит для бластомеров абляции, исследователь придется удалить эмбрионов от выводковой сумке и изучить их под микроскопом.
  • Просмотр процедуру при вскрытии микроскопом, понять коксальные пластины, а одной стороне тела щипцами. Эмбрионы будет виден в вентральной выводковой сумке между этими коксальных пластинок (рис. 1б).
  • Вставьте тонкий, изогнутый провод инструмента (фиг.3; шаг 1,3 см. выше) в заднем конце выводковой сумке, и осторожно поднимите провод к переднему концу выводковой камеры, чтобы отделить выводоксумка покрытия (они изменяются брюшной придатков называемые оостегитами 30), открывая сумку и ослабив эмбрионов. Эмбрионы, которые в течение первого часа или около того, чтобы быть заложены все заключены в очень тонкой, прозрачной мембраны, которая будет легко нарушается инструментом проволоки; эта мембрана исчезает примерно на 2-3 часа после откладки яиц, и эмбрионы не связаны друг к другу или к самке в любом случае, с этой точки и далее во всем эмбриогенеза. Если исследователи находят его неудобным или трудно маневрировать изогнутый инструмент проволоки, чтобы удалить эмбрионов от выводковой сумке, альтернатива реализации могут быть использованы, пока движения нежны и никаких жестких давление не применяется к эмбрионов или выводковой сумке. Другие инструменты, подходящие для удаления эмбрионов от выводковой сумке включают притупилось щипцов или стеклянного капилляра с герметичной и сглаженной конца.
  • Используйте неизмененный 15 см пипетки Пастера, чтобы смыть воду через открытый выводковой сумке, выталкивая тон эмбрионов, которые должны располагаться в нижней части часовым стеклом. Трансфер самку к чистой FASW (без СО 2), чтобы позволить восстановлению до повторного ее основной культуры. Несколько самок могут быть размещены в том же самом блюде восстановления, но позволяют самки полностью восстановить перед их возвращением в основной культуры, поскольку они могут быть съеден с помощью других животных, если они все еще частично под наркозом.
  • Использование неизмененный 15 см пипетки Пастера перенести эмбрионы в чашку Петри с чистой FASW и просматривать под микроскопом, чтобы определить их эмбриональной стадии. Отдельные эмбрионы, которые на третьем расщепления (стадия 4 5), которые подходят для этой процедуры. Она также должна быть возможность применять этот протокол для любой стадии расщепления до формирования зародышей диска (стадии 7-8 5).

4. День 2: абляции отдельных клеток

  1. Заполните Sylgard-выстроились чашки Петри с тонким слоем FASW. Используйте неизмененный 15 см Пастера пиPette для передачи одного эмбриона к пластине.
  2. Использование тупых щипцы, осторожно сверните эмбрион, чтобы определить ячейку быть удалена (фиг.2А и 2В). Зародышевой линии предшественника г могут быть определены как самый маленький микромеров, который сидит на вершине маленького macromere Mav. Кроме того, г не напрямую связаться ячейку ан, который является микромеров прямо через дорогу от него, как микромеров мезодерма предшественники мл и г-н акцию клетка границы в середине зародыша. Господин является бластомер справа от г, и мл является микромеров слева от г. Сестра макромеров г, мл, и еп эктодермы предшественники Er, Эл, и Ep соответственно.
  3. С щипцов в ЛЕФт рука, если исследователь правша (или в правой руке, если исследователь левша), ориентироваться эмбрион с клеткой, представляющей интерес для правой (или влево, если исследователь левша), и мягко понять эмбрион между щипцами, чтобы стабилизировать его.
  4. Использование вытащил стеклянную иглу (шаг 1.5 выше, рисунок 4), мягко проколоть ячейку интересов. Не вставляйте иглу слишком далеко, чтобы не толкать иглу в клетки соседних или ниже ячейки интерес. Игла имеет только проколоть хориона и основной клеточной мембраны, и не нужно продлить глубоко в клетки, которые будут абляции.
  5. Обменять игла используется для прокола зародыш для стеклянной конце рот пипеткой со штрафом вытащил пипетки Пастера (шаг 1.4 выше). Держите кончик пипетки близко к дыре, созданной в ячейке интерес, и применять очень нежный всасывание.
  6. Очень аккуратно сожмите эмбрион с пинцетом. Как содержанию blastoпросто выталкивается из хориона через отверстие, созданный на шаге 4.4, сосать его в рот пипеткой, чтобы позволить свободный вид эмбриона. Если отверстие достаточно большой, ядро ​​проколотой клетки можно рассматривать появляться также. Это хорошая проверка, чтобы убедиться, все содержимое ячейки были удалены и не могут быть восстановлены.
  7. Тщательно соблюдайте эмбрион как бластомер интерес удаляется. Граница проколотой клетки отступит к отверстию в хориона, делая пересечения основных клеток видимых. Продолжить оказывать давление, пока все бластомера интереса не была удалена. Используйте пинцет, чтобы бросить эмбрион из стороны в сторону и визуально подтвердить, что все бластомера интереса нет.
  8. Использование неизмененный 15 см пипетки Пастера, передача эмбриона очистить FASW + (FASW + 1 мг / мл амфотерицина В, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина).
  9. Поднимите бластомера-абляции эмбрионов в отдельных скважинахиз чистого 48-луночный планшет в FASW +, изменив 50% антибиотик дополнена FASW + ежедневно. В наших руках эмбрионы выжить и развиваться хорошо, даже следующий абляции, в диапазоне температур от 18-28 º C. Исследователи должны поднять эмбрионов при температуре, для которых они имеют чистую (но не обязательно стерильную) поверхность, на которой поднять эмбрионов с минимальным нарушением. Для того, чтобы сравнить время событий развития в бластомера-абляции эмбрионов с элементами управления, мы отсылаем читателя к подробному развития информации промежуточной, которая доступна для эмбрионов, поднятых на 18 º C 4, 25 º C 4, и 26 º C 5,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После успешной абляции один третий расщепления P. hawaiensis микромеры как описано в данном протоколе, остальные микромеры постепенно перенести свои позиции немного для того, чтобы частично занимают пространство ранее занимаемую абляцированную бластомера. Например, когда г удаляется, соседняя бластомеров Мистер и мл слегка смещаться и пришел разделить боковые границы ячеек, которые раньше были в непосредственном контакте с г (ср. рис 2А и 2С). После успешной абляции, остальные бластомеры могут отображаться с небольшой задержкой (менее одного часа) до ввода четвертый расщепление, но они должны затем возобновить те же закономерности расщепления и времени, что бы они отображаются в unmanipulated эмбрионов по крайней мере, до гаструляции стадии 23 . После удаление из любого из четырех микромеров, потомки оставшихся blastoМерес должны также показать нормальную времени расщепления и клеточные поведения, в том числе образованию характерной сотовой договоренности назвал "розетка" и начало гаструляции движений 23. Доля эмбрионов, которые выживают процедуру абляции и полное эмбриогенеза до штриховкой может первоначально быть порядка около 10% для исследователя к новой технике, но с опытом должны в среднем около 50%, и может быть выше, чем 75% с практикой и неусыпной заботой эмбрионов следующих бластомеров абляции. Таблица 1 показывает примеры количества эмбрионов абляции и выживаемости для серии последовательных экспериментов абляции выполняемых же исследователя, показывая, что выживаемость, как правило, не менее 80% для самых первых дней после абляции, и что выживаемость до вылупления рост с увеличением опыта исследователя.

Неполное удаление бластомер будетсвидетельствует видя остатки бластомера, которые должны были абляции, которые могут включать мембранные компоненты, цитоплазму, или желток гранулы, еще находящиеся в хориона зародыша. Задержка в четвертом расщепления более двух часов, или нерегулярной расщепления или клеточных поведения потомков остальных бластомеров, может также указывать неудачную абляции. Эти явления могут быть следствием ущерб, причиненный другим бластомеров во время процедуры абляции. Если, кроме того, целевой для абляции отображения морфологических аномалий или распадется, то снова повредить бластомеры, скорее всего, было вызвано другим бластомеров во время процедуры абляции.

Если судьба клеток маркеры доступны для обозначения потомков конкретных бластомеров третий расщепления чьи судьбы не подлежат регулятивного замены, то дополнительным подтверждением успешной абляции может быть получено маркировки манипулировать эмбрионов с этими маркерами Фоллокрыло абляция. Маркеры некоторых мезодермальных и эктодермальных территорий были описаны в середине-конце стадиях эмбриогенеза 8,14,15. Однако, поскольку оба этих зародышевых листков могут пройти регулятивный замену при потере одного из своих учредителей бластомеров 25, эти маркеры могут не однозначно определить, действительно ли бластомера успешно абляция. В случае зародышевой линии предшественника г, все его потомки отмечены выражения васа стенограммы 12 и белка 4 всей эмбриогенеза, и эмбрионы, в которых г была удалена отсутствие половых клеток, по крайней мере до раннего зародышевой полоски стадии 4. Успешное абляция г, таким образом, быть подтвержден путем исследования выражение Vasa следующие абляции в поздних стадиях эмбриогенеза (рис. 5).

Рисунок 1 й = "5 дюймов" FO: Пребывание "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" Первоначально "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />
Рисунок 1. Взрослый Parhyale hawaiensis женщин и эмбрионы. (А) Боковой вид взрослой женщины П. hawaiensis, показывая коксальные пластины (стрелки), грудные придатки (стрелки) и эмбрионы видимые, как розовые или фиолетовые сфероидах через прозрачную коксальных пластинок (синий пунктирной линией). Передний находится слева. (В) Брюшной вид взрослой женщины П. hawaiensis показывая эмбрионов, видимые в выводковой сумке (синий пунктирной линией). Передний находится слева. (C) Эмбрионы, освобожденные из выводковой сумке развиваются нормально в FASW. Различные этапы, начиная от S1 через штриховкой показаны, поставленный в соответствии с Браун и др. 5 шкалы = 1 мм (А) и (В);. 500 мкм в (С).51073/51073fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Восемь клеточной стадии эмбрионов P. hawaiensis. (А) Жить этап восемь-клеток (стадия S4 5) unmanipulated эмбрион, состоящий из четырех микромеров (мелкие клетки) и четыре макромеров (крупные клетки). (В) Схема с стадии эмбриона восемь клеток, показывая клеточных судеб обозначения всех бластомеров в дикого типа эмбриона как показали линии трассировки на основе флуоресцентных маркеров 6. (C) Жить S4 стадии эмбриона, что была в г бластомера удалены с использованием настоящего протокола. Кружил область показана область ранее занятую г бластомера;Остальные микромеры перешли позицию немного в результате абляции г. Шкала бар = 250 мкм в (А) и (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Провод инструмент используется для удаления эмбрионов от маточного сумке. Инструмент, показанный здесь было сделано путем вставки вольфрамовой проволоки в узкий конец пастеровской пипетки и осторожно плавления стекла, чтобы запечатать провод на месте, то с помощью щипцов ввести мягкий изгиб в провод. Другие инструменты, подходящие для удаления эмбрионов от выводковой сумке включают притупилось щипцов или стеклянного капилляра с герметичной и сглаженной конца. Южная Каролинаэль бар = 1 см.

Рисунок 4
Рисунок 4. Стекло иглы используются для прокалывания бластомеров во время процедуры абляции. Игла показано здесь был разобран на Саттер P97 иглы съемник с помощью программы с параметрами 2 х (тепла = 566, тянуть = 100, скорость = 20, время = 250) + 1 х (тепло = 566, потяните = 100, скорость = 100, время = 250). Другие инструменты или программы могут быть использованы для тянуть иглы, подходящие для абляции тех пор, пока они имеют ту же общую форму, как показано здесь. Шкалы = 1 см.

Рисунок 5
Рисунок 5. Оценивая итоги бластомеров аblation во время эмбриогенеза. (А) Гонада область дикого типа этап S29 эмбриона незадолго до вылупления, показывая зародышевые клетки помечены анти-Васа иммуноокрашивания (наконечники стрел). Анти-Васа антитело, используемое здесь специфичен для P. hawaiensis Васа (Linsler, Alwes и Extavour, неопубликованные данные). (В) Гонада область этапе S29 эмбриона, у которого был г бластомера удален на стадии восьми клеток, показывая отсутствие половых клеток как показали отсутствие конкретного сигнала анти-Васа в гонад области (стрелки). Бар Масштаб в (А) = 100 мкм и распространяется также на (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Абляция круглый # Абляции # (%) Выжилна развитие 50% # (%) Выжил в развитие 90-100%
1 49 41 (83,7) 6 (12.2)
2 48 46 (95,8) 17 (35,4)
3 31 25 (80,6) 22 (71,0)
4 97 72 (74,2) 56 (57,7)
5 108 100 (92,6) 65 (60,2)
6 50 36 (72,0) 37 (74,0)
ИТОГО 383 320 (83,6) 203 (53,0)

Таблица 1. Представитель выживание абляциястатистика. После микромеров абляции, выживание был забит как в первых 50% развития (5-6 дней при 25 ° С), а затем на развитие 90-100% (10-12 дней при 25 º C). Абляция округляет 1-6 характерные примеры экспериментов, выполненных на одной исследователя (АР Nast) в хронологическом порядке в течение восьмимесячного периода. Исследователи должны найти, что, как показано здесь, выживаемость в 90-100%-ное увеличение развития с опытом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы опишем протокол для ручного абляции и полного физического удаления отдельных бластомеров из ранних стадиях расщепление амфипод P. hawaiensis. Мы демонстрируем использование этого протокола путем удаления одного зародышевой линии клеток предшественник г от стадии эмбриона восьми клеток, и показывают, что удаление успешно, подтвердив отсутствие г 'ы дочерних клеток в позднем эмбриогенезе. Этот протокол может быть использован для удаления любого из микромеров из эмбриона на ранних стадиях дробления. Чтобы использовать этот протокол для удаления макромеров на данном этапе, или бластомеров на первой или второй стадиях дробления, пользователи могут просто применить незначительные изменения создания из немного большего отверстие в хориона на этапе 4.4, и применяя давление и всасывание в течение длительного времени удалить больший объем содержимого ячейки на этапе 4.6. Мы обнаружили, что после использования этого протокола, развитие остальных бластомеров после абляции является ООНвлияние по отношению к спайности и движение клетки узоров по крайней мере до момента гаструляцией 23.

Этот протокол может быть полезным для дальнейшего расследования развития потенциала ранних бластомеров расщепления в этом амфипод. Многие вопросы остаются без ответа в этой области, в том числе, почему некоторые клетки, но не другие могут изменить судьбу, чтобы заменить те из ABLATED бластомеров, и точные сроки и механизмы этих нормативных изменений. Протокол также может быть изменена, чтобы приспособить абляции более одной ячейки, просто повторяя шаги 4,2-4,7 подряд на бластомерах интерес.

Важно использовать высококачественный стереомикроскоп с соответствующим освещением, чтобы просматривать и правильно определить ранние бластомеры расщепления. Мы считаем, что боковая инцидент белый свет от волоконно-оптического источника холодного света является наиболее полезным для этой цели. Падающий свет непосредственно над specimан создает отражения, которые могут затенять сотовой морфологии и границы, в то время как в проходящем свете не в состоянии проникнуть в плотную желток эмбрионов и бластомеров поэтому их трудно различить. Это наиболее полезно для часового стекла или чашки Петри, содержащую эмбрионы, которые будут размещены на черной поверхности, а не белой или прозрачной стеклянной поверхности, так как это обеспечивает лучший контраст для бледно эмбрионов.

Одним из ограничений для этого протокола является то, что бластомер интерес должен быть правильно и однозначно определены перед началом процедуры. Методы фотоабляцию было бы более полезным для исследователей знакомы с системой, так как эмбрионы можно оставить для разработки в течение нескольких циклов расщепления после инъекции флуоресцентного красителя 28, и личность закачиваемой бластомера подтвердил после инъекции, но до фотоабляцию, на основе анализа моделей сотовых потомков, которые были хорошо описанных в предыдущей клеточной линиивозраст анализирует 6,23. После того, как исследователи знакомы с P. hawaiensis эмбрион и может определить все бластомеры с уверенностью, руководство абляция описано здесь могут быть использованы для приложений, где полное физическое удаление бластомера, а не убивая клетку, не снимая мертвое тело клеток из эмбриона, является желательным.

Эта процедура в принципе может быть применен к удалить отдельные бластомеры от стадии дробления эмбрионов других holoblastically расщепляющих ракообразных и других морских или пресноводных беспозвоночных, чьи хорионов или оплодотворения мембраны не могут быть легко удалены. Модификации могут включать использование инкубационный СМИ с соответствующими характеристиками солености и изменения формы иглы для размещения более тонкие мембраны (длинные, тонкие иглы) или более надежные эмбриональные покрытия (короткие, быстро сужается иглы).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Райхан Арифа и Хассан Shahawy за операторскую работу, Tripti Гупта и Фредерике Alwes за помощью уточнения технику клеток абляции и Extavour членов лаборатории для обратной связи на данных, видео и рукописи. Эта работа была частично поддержана Гарвардского института стволовых клеток (Seed число Грант SG-0057-10-00) Эллисон Медицинский фонд (Нью-Академия премии число AG-NS-07010-10), чтобы КГЭ, и награды программы колледжа Исследование Гарвардского ARN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 cm Pasteur pipette Wheaton 53499-630 VWR For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish.
22 cm Pasteur pipette Wheaton 53499-632 VWR For making mouth pipette tips.
3 cm Petri dishes Thermo Scientific 25382-334 VWR Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations.
48-well Plates Greiner Bio-One 82051-004 VWR For culturing embryos following ablation.
Bottle top filters 0.2 µm Nalge Nunc International 28199-296 VWR For creating FASW (See below).
Bunsen burner VWR 89038-530 VWR For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette.
Diamond scribe Musco Sports Lighting 52865-005 VWR For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples.
Forceps Fine Science Tools 11050-10 Fine Science Tools For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here.
Fungizone-Amphotericin B Sigma A2942 Sigma Aldrich Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) World Precision Instruments 1B100-4 World Precision Instruments For making needles for puncturing the blastomere to be ablated.
Glass watchglass 300 mm diameter Electron Microscopy Sciences 70543-30 Electron Microscopy Sciences For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females.
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) Instant Ocean IS160 Aquatic EcoSystems Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024.
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) Instant Ocean IS160 Aquatic EcoSystems Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed.
Kimwipes Kimberly-Clark 21905-026 VWR For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples.
Mouth pipette adaptor Drummond Labware A5177-5EA Sigma Aldrich Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure.
Mouth pipette tubing Aldrich Z280356 Sigma Aldrich Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure.
Needle Puller Sutter Instrument Company P97 Sutter Instrument Company For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated.
Penicillin-Streptomycin Solution Mediatech 45000-650 VWR Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Rubber bulb Electron Microscopy Sciences 100488-418 VWR For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish.
Sylgard 184 K. R. Anderson, Inc. NC9659604 Fisher Scientific Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations.
Tungsten wire 0.004 inches diameter A-M Systems 719000 A-M Systems Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Chapter 3. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , CSHL Press. 373-404 Forthcoming.
  2. Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
  3. Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
  4. Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
  5. Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
  6. Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
  7. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
  8. Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
  9. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
  10. Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
  11. Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
  12. Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
  13. Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
  14. Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
  15. Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
  16. Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
  17. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
  18. Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
  19. Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
  20. Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
  21. Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
  22. Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
  23. Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
  24. Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
  25. Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
  26. Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
  27. Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
  28. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
  29. Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
  30. Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).

Tags

Биология развития выпуск 85 Амфиподы экспериментальной эмбриологии микромеров зародышевой линии абляция потенциал развития,
Устранение одну клетку от Восемь клеток эмбрионов из амфипод ракообразных<em&gt; Parhyale hawaiensis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nast, A. R., Extavour, C. G.… More

Nast, A. R., Extavour, C. G. Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis. J. Vis. Exp. (85), e51073, doi:10.3791/51073 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter