Summary
El hawaiensis anfípodo Parhyale es un organismo modelo prometedor para los estudios de embriología y desarrollo de artrópodos crustáceos comparativa y evolución. Este protocolo describe un método para la extracción manual de blastómeros individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Parhyale.
Abstract
El hawaiensis anfípodo Parhyale es un pequeño crustáceo que se encuentra en los hábitats marinos intermareales de todo el mundo. Durante la última década, Parhyale ha convertido en un organismo modelo prometedor para los estudios de laboratorio de desarrollo, proporcionando una comparación exogrupo útil al organismo bien estudiado modelo artrópodo Drosophila melanogaster. En contraste con las divisiones sincitiales de Drosophila, las primeras divisiones de Parhyale son holoblástica. Suerte de cartografía utilizando colorantes trazadores inyectados en primeros blastómeros han demostrado que las tres capas germinales y la línea germinal se establecen por la etapa de ocho células. En esta etapa, tres blastómeras están destinados a dar lugar a el ectodermo, tres están destinados a dar lugar al mesodermo, y los dos restantes blastómeros son los precursores de la línea de endodermo y el germen respectivamente. Sin embargo, los experimentos de ablación de blastómeros han demostrado que los embriones Parhyale también poseen capabiliti reglamentaria significativaes, de tal manera que el destino de los blastómeros ablación en la fase de ocho células pueden ser asumidas por los descendientes de algunos de los blastómeros restantes. La ablación de blastómeros ha sido previamente descrito por uno de dos métodos: la inyección y la posterior activación de colorantes fototóxicas o ablación manual. Sin embargo, fotoablación mata blastómeros, pero no elimina el cuerpo de células muertas del embrión. Eliminación física completa de blastómeros específicos puede por lo tanto ser un método preferido de la ablación para algunas aplicaciones. Aquí se presenta un protocolo para la extracción manual de blastómeros independientes, desde la fase de ocho células de embriones Parhyale, ilustrando los instrumentos y procedimientos manuales necesarias para la eliminación completa del cuerpo de la célula, manteniendo las restantes blastómeros vivo e intacto. Este protocolo se puede aplicar a cualquier célula Parhyale en la fase de ocho células, o para blastómeros de otras etapas de escisión temprana. Además, en principio, este protocolo podría ser aplicable a CLEA tempranaVåge embriones de otros invertebrados marinos holoblastically escisión.
Introduction
El Parhyale hawaiensis crustáceo anfípodo ha surgido en la última década como un organismo modelo prometedor con un gran potencial para su uso en la investigación evolutiva biología del desarrollo 1. Entre los artrópodos, la mayoría de los sistemas de modelos son insectos, y las más estudiadas de ellas es la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster es un miembro de la orden de insectos Diptera, y, como tal, muestra muchas características embriológicas que se derivan con respecto a los de los insectos basalmente ramificación 2. Por otra parte, los insectos se anidan dentro del suborden Pancrustacea 3, lo que significa que los insectos tienen sus parientes más cercanos en el grupo desde hace mucho tiempo "natural" llamados pancrustaceans, y que este grupo es parafilético. Esto sugiere que además de ramificaciones basales modelos de insectos, se requieren estudios de otros crustáceos de obtener una visión más amplia del historia de la evolución de los rasgos del desarrollo de unamecanismos moleculares nd que han sido tan bien estudiados en D. melanogaster. Sin embargo, son muy pocos los crustáceos han sido bien establecidos para el análisis de laboratorio experimental de desarrollo. El anfípodo P. hawaiensis es un sistema de modelo de laboratorio altamente manejable, susceptible de una serie de técnicas experimentales. Anfípodos muestran muchas características únicas dentro de su superorder padre Peracarida (tolvas de playa, scuds, y camarones así), y por lo tanto se cree que están relativamente derivada dentro de este grupo de crustáceos. Sin embargo, la relativa facilidad de la manipulación genética embriológico y funcional que ofrece Parhyale hacen de este anfípodo una valiosa adición al inventario actual de organismos modelo.
Como un animal de laboratorio, P. hawaiensis ofrece muchas ventajas. Los animales son tolerantes a una amplia gama de temperaturas y salinidades, y sobreviven bien en grandes cultivos de agua de mar artificial 1. Es fácil distinguir entrmachos y hembras een basadas en las diferencias morfológicas claras, sobre todo, los grandes en forma de gancho, el tronco, los apéndices anteriores que los machos usan para agarrar a la hembra durante el apareamiento. Para el trabajo y de desarrollo embriológico, P. hawaiensis tiene varias características muy atractivas. La embriogénesis dura aproximadamente 10 días y el tiempo hasta la madurez sexual es de aproximadamente seis semanas a 28 º C (pero tenga en cuenta que Parhyale sobrevive bien a temperaturas que van desde aproximadamente 20 a 30 º C, y que la informacion de puesta en escena de desarrollo está disponible para los embriones planteadas a 18 º C 4 , 25 º C 4, y 26 º C 5,6). Los adultos se aparean durante todo el año en el laboratorio, por lo que los embriones están disponibles en cualquier momento del año. Las hembras ponen 2-20 (dependiendo de la edad de las mujeres) huevos fertilizados en una bolsa de la cría ventral situado entre los primeros pares de patas (Figuras 1A y 1B), y es posible reunir estos embrións muy temprano en el desarrollo sin matar a la hembra o dañar los embriones (Figura 1C). Los embriones sobreviven en agua de mar artificial se filtra a través de la eclosión, se pueden fijar para la expresión génica o posterior análisis histológico 7, y una tabla de ensayo detallado permite la identificación precisa de los avances a través del desarrollo 5. Protocolos robustos se han utilizado para realizar el análisis de la expresión génica mediante hibridación in situ 8-15 o inmunotinción 4,16,17, desmontables funcional mediante ARN de interferencia 13,15 o morfolinos 12, y la línea germinal estable transgénesis 18. Usando el sistema de la transgénesis, la expresión inducible 14 y potenciador trampa 19 métodos también pueden utilizarse para investigar la función de genes en P. hawaiensis. Mientras que una secuencia del genoma a disposición del público no está disponible actualmente, un transcriptoma contiene transcripciones producido durante la ovogénesis y embriogénesis tiene abejan de novo montado y anotado 20, y depositado en una base de datos 21, facilitando el descubrimiento de genes. En suma, P. hawaiensis es un organismo modelo muy manejable adecuada para múltiples enfoques experimentales y genéticos para entender el desarrollo.
A diferencia de las primeras divisiones sincitiales de D. melanogaster, P. embriones hawaiensis escinden holoblastically después de la fertilización (Figura 2A). Linaje análisis de rastreo ha demostrado que por tercera división, cada uno de los tercero blastómeros de escisión está destinado específicamente para dar lugar a una de las tres capas germinales o la línea germinal 6 (Figura 2B). Estos datos, junto con los datos de microarrays 22, linaje de células análisis 6,23, y los experimentos de aislamiento blastómeras 4 han sugerido que los potenciales de desarrollo son segregados por lo menos a algunos terceros blastómeras la escisión por la herencia asimétrica de cell determinantes destino. En consecuencia, en los experimentos de ablación de blastómeros en el que se eliminó el precursor de línea germinal (denominado "g" en la Parhyale linaje de células nomenclatura 6) en la etapa de ocho células, embriones carecían de células germinales en las etapas de desarrollo posteriores 4, como se indica por la ausencia de células que expresa la proteína Vasa, que es un marcador de la línea germinal en la mayoría de los metazoos 24. En contraste, los experimentos de ablación de blastómeros somáticas mostraron que P. embriones hawaiensis también poseen capacidades reguladoras importantes, que los destinos de mesodermo o ectodermo blastómeras precursoras ablación en la fase de ocho células pueden ser asumidas por los descendientes de algunos de los blastómeros restantes de 25. ¿Cómo puede ocurrir la sustitución del destino celular regulativo, y el grado de autonomía de adopción por el destino de las células somáticas blastómeras, sigue siendo desconocido. Técnicas embriológicas experimentales tales como la ablación de blastómeros pueden ser útiles en understanding la autonomía relativa y nonautonomy de las decisiones del destino celular 26,27 y por lo tanto son de interés en el estudio de P. embriogénesis hawaiensis.
En los experimentos que demostraron reemplazo regulativa de ectodermo y mesodermo linajes, la ablación de blastómeros se realizó mediante inyección 28 y la posterior excitación de tintes fototóxicas 25. Si bien esta técnica es eficaz en matar el blastómero (s) se inyecta, no elimina completamente el cuerpo de células muertas del embrión. Además, se han observado diferencias entre los datos recogidos a través del linaje de células de las etapas de la embriogénesis gastrulación inyectando blastómeras con trazadores fluorescentes linaje 28,29, y los datos recogidos siguiendo blastómeras no perturbadas por medio del desarrollo de las mismas etapas embrionarias 23. Eliminación física completa de blastómeros específicos puede por lo tanto ser un método preferido de la ablación para algunas aplicaciones.
Hemos publicado anteriormente los resultados de los análisis de linaje de células de embriones en los que las células individuales se ablated manualmente 23. Sin embargo, las operaciones delicadas requeridas para eliminar blastómeros individuales a partir de embriones de etapa de escisión primeros aún no se han descrito completamente. Aquí se presenta un protocolo para la recolección de P. embriones hawaiensis y ablación manual de una sola blastómeros de un embrión en su fase de ocho células. El objetivo de este método es para lograr la eliminación completa del cuerpo de la célula del embrión, lo que permite la observación de los comportamientos celulares y competencias destino celular de las células restantes durante la embriogénesis y el desarrollo de post-embrionario. Nuestro protocolo muestra la eliminación del precursor g línea germinal (Figura 2C), pero se puede aplicar a cualquier célula en la fase de ocho células, o para blastómeros de etapas de escisión anteriores. En principio, este protocolo se podría aplicar para eliminar las células individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Other escindir holoblastically invertebrados marinos.
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Protocol
Los comentarios que pueden ser de ayuda en la ejecución de ciertas medidas se indican en cursiva.
1. Día 1: Preparación de Materiales
- Prepare los siguientes materiales (véase la Tabla de Materiales y Equipos):
- 15 cm y 22 cm pipetas Pasteur
- Escribano Diamond
- filtrada agua de mar artificial (salinidad entre 0,0018 a 0,0020) que contiene 1 mg / ml de anfotericina B (1:100 de una solución madre 100 mg / ml), 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (01:50 de una solución madre que contiene 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 mg / ml de estreptomicina)
- filtra el agua de mar artificial (salinidad entre 0,0018 hasta 0,0020), sin aditivos
- un gran recipiente de plástico para las parejas de vivienda (al menos 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- pequeñas (3 cm o 5 cm) placas de Petri revestidas con Sylgard
- pequeñas (3 cm o 5 cm) placas de Petri
- un vidrio de reloj o de vidrio placa de múltiples pocillos
- fórceps (que usamos fórceps romos derivan from edad Dumont # 5 pinzas que fueron dañados accidentalmente en otros procedimientos de laboratorio, lo que hemos reutilizados mediante el uso de unas pinzas de afilar piedra para asegurar que los extremos de la pinza son suaves, que tanto los dientes tienen la misma longitud, y que ya no tienen puntas afiladas. Pinzas extremadamente finas, como las nuevas Dumont # 5 pinzas, no son deseables, ya que pueden dañar a los embriones y / o mujeres).
- una pipeta Pasteur con el extremo ensanchado (véase el paso 1.2 más abajo)
- una herramienta de recuperación de embriones que consiste de un alambre de tungsteno delgada, curvada encajada en el extremo fino de una pipeta Pasteur (podría ser sustituido por una alternativa implementar; ver 1.3 más abajo)
- una pipeta de boca con una pequeña abertura (véase el paso 1.4 más abajo)
- una aguja de cristal hecha a partir de un capilar de vidrio tirado (véase el paso 1.5)
- Para hacer la pipeta Pasteur ampliado, primera puntuación de alrededor de una pipeta Pasteur de 15 cm en el punto donde la pipeta comienza a reducir con una punta trazadora de diamante, envuelva la región de marcado de la pipeta en una toalla de papel Kimwipe o para proteger los dedos, y luego, con cuidado rompa la punta en la línea marcada. Sostenga el extremo roto de la pipeta de una llama de un mechero Bunsen durante varios segundos para suavizar los bordes. La abertura debe ser ligeramente más estrecho que la anchura máxima de la pipeta.
- Para hacer que la herramienta de disección alambre de tungsteno, insertar un alambre de tungsteno en el extremo de un 15 cm pipeta Pasteur de vidrio y mantenga presionado brevemente sobre una llama de mechero Bunsen para fundir el vidrio, la fijación del cable en su lugar. El uso de fórceps a la curva suavemente el extremo del alambre en forma de gancho. Vea la Figura 3 para un ejemplo de una forma apropiada para esta herramienta.
- Para hacer una pequeña abertura para la pipeta de boca, tire del extremo delgado de una pipeta Pasteur 22 cm en dos partes over una llama, y rompa la punta del extremo pequeño. Insertar en el extremo del soporte de pipeta boca.
- Hacer la aguja de vidrio que se utiliza para perforar los blastómeros de interés durante el procedimiento de ablación con un extractor de aguja. Una aguja de forma adecuada se muestra en la Figura 4. Esta aguja se puso una aguja extractora P97 Sutter utilizando un programa con parámetros 2x (calor = 566, tire = 100, velocidad = 20, tiempo = 250) + 1X (calor = 566, tire = 100, velocidad = 100, tiempo = 250). El programa y el instrumento específico usado para hacer que la aguja pueden variar, pero la aguja deben tener una punta fina, sin embargo, también ser lo suficientemente resistente para no romper cuando se empuja contra el corion del embrión.
2. Día 1: Encuentro Parejas Parhyale acoplamiento
- Use la pipeta Pasteur ampliado (paso 1.2) para recoger el apareamiento P. parejas hawaiensis del recipiente de cultivo grande, y transferirlos a un recipiente que contiene separada cinclinarse agua marina artificial. No es necesario que se va a filtrar esta agua de mar. Es mejor recolectar pares de apareamiento en la tarde por la tarde y salir a las parejas a temperatura ambiente (20-23 º C) durante la noche, para que a la mañana siguiente, la mayoría de los embriones se habrá recientemente fertilizado y depositado, por lo que el escote primeras etapas adecuado para la ablación. Reunir al menos 20 parejas de apareamiento para asegurar que algunas hembras se llevan embriones estadio de división temprana por la mañana siguiente.
3. Día 2: Reunión Parhyale embriones
- A la mañana siguiente, se filtró infundir agua de mar artificial (FASW) con CO 2. Algunas de las mujeres habrán nadado libres de sus hombres durante la noche; recoger estas mujeres separadas y anestesiar en FASW / CO 2. Los machos no apareados restantes se pueden sacar del contenedor de par de acoplamiento y se devuelven al cultivo grande. Apareamiento de pares restantes se pueden guardar para su posterior recogida de embrionesen el día o el día siguiente.
- Transferir una sola hembra anestesiada llevar los embriones a un vidrio de reloj en FASW / CO 2. Todas las hembras separadas es probable que hayan depositado los huevos, que serán visibles por el ojo como de color rosa pálido o esferoides de color púrpura a través de las placas coxales transparentes de las hembras (Figura 1A). Para determinar si los embriones se encuentran en etapas tempranas de división y por lo tanto adecuado para la ablación de blastómeros, el investigador tendrá que eliminar los embriones de la bolsa de la cría y examinarlas bajo un microscopio.
- Viendo el procedimiento bajo un microscopio de disección, sujete las placas coxales a lo largo de un lado del cuerpo con pinzas. Los embriones serán visibles en la bolsa ventral ventral entre estas placas coxales (fig. 1B).
- Inserte la herramienta de alambre curvado delgado (Figura 3; paso 1.3 anterior) en el extremo posterior de la bolsa de la cría y levante suavemente el cable hacia el extremo anterior de la bolsa de la cría de separar a las críasrevestimientos de bolsa (éstos se modifican los apéndices ventrales llamados oostegites 30), la apertura de la bolsa y el aflojamiento de los embriones. Los embriones que se encuentran dentro de la primera hora o así de ser despedidos están todos encerrados dentro de una membrana muy delgada y transparente que fácilmente se pueden romper mediante la herramienta de alambre; esta membrana desaparece en aproximadamente 2-3 horas después de la puesta de huevos y embriones no están obligados entre sí o con la mujer de cualquier forma desde este punto en adelante toda la embriogénesis. Si los investigadores encuentran incómodo o difícil de maniobrar la herramienta de alambre curvado para eliminar los embriones de la bolsa de la cría, una alternativa implementar se puede utilizar, siempre y cuando los movimientos son suaves y sin presión dura se aplica a los embriones o la bolsa de la cría. Otras herramientas adecuadas para la eliminación de los embriones de la bolsa de la cría incluyen pinzas romas o un capilar de vidrio con un extremo sellado y alisado.
- Utilice una pipeta de 15 cm inalterada Pasteur para eliminar el agua a través de la bolsa de la cría abierta, empujando hacia fuera tque los embriones, que debe depositarse en el fondo del vidrio de reloj. Traslado a la hembra para limpiar FASW (sin CO 2) para permitir la recuperación antes de su reintroducción a la cultura principal. Varias mujeres se pueden colocar en el mismo plato de recuperación, pero permiten que las mujeres se recuperen completamente antes de volver a la cultura principal, ya que pueden ser comidos por otros animales si están todavía parcialmente anestesiados.
- Utilice una pipeta de 15 cm inalterada Pasteur transferir los embriones a una placa de Petri con FASW limpio, y ver bajo el microscopio para determinar su estado embrionario. Embriones separados que están en la tercera división (etapa 4 5), que son adecuados para este procedimiento. También debe ser posible aplicar este protocolo a cualquier estadio de división antes de la formación del disco germinal (etapas 7 a 8 mayo).
4. Día 2: La ablación de células individuales
- Rellene forradas en Sylgard placa de Petri con una capa superficial de FASW. Utilice un inalterada 15 cm pi Pasteurpipeta para transferir un único embrión a la placa.
- Con unas pinzas romas, ruede suavemente el embrión para identificar la célula para extirpar (Figuras 2A y 2B). La línea germinal precursor g puede ser identificado como el micromere más pequeño, que se encuentra en la parte superior de los más pequeños Mav macrómero. Además, g no entra en contacto directamente la célula es, que es el micromere directamente a través de ella, como los micrómeros precursores mesodermo ml y cuota de mr un borde de la celda en el medio del embrión. Mr es el de blastómeros a la derecha de g, y ml es la micromere a la izquierda de g. Los macrómeros hermanas de mr, ml, y en son los precursores ectodermo Er, El y Ep respectivamente.
- Con unas pinzas en la left mano si el investigador es diestro (o en la mano derecha si el investigador es zurdo), oriente el embrión con la célula de interés hacia la derecha (o hacia la izquierda si el investigador es zurdo), y agarrar suavemente el embrión entre los fórceps para estabilizarlo.
- Usando una aguja tirado de vidrio (paso 1.5 anterior; Figura 4), perfore suavemente la célula de interés. No inserte la aguja demasiado lejos, para no empujar la aguja en las células vecinas o por debajo de la célula de interés. La aguja sólo tiene que perforar el corion y la membrana celular subyacente, y no es necesario para extender profundamente en la célula para ser sometida a ablación.
- Cambie la aguja utilizada para perforar el embrión para el final de cristal de una pipeta de boca con una fina tira de puntas de pipeta Pasteur (paso 1.4). Mantenga la punta de la pipeta cerca del agujero creado en la célula de interés, y aplicar succión muy suave.
- Muy apretar suavemente el embrión con las pinzas. Como el contenido de la Blastomera es empujado fuera del corion por el agujero creado en el paso 4.4, chupan en la pipeta de boca para permitir una vista sin obstáculos del embrión. Si el agujero es lo suficientemente grande, el núcleo de la célula perforado puede ser visto a surgir también. Esta es una buena comprobación para asegurarse de que todo el contenido de la celda se han eliminado y no puede ser regenerada.
- Observe cuidadosamente el embrión como se quita el blastómero de interés. El borde de la celda perforado se retroceder hacia el agujero en el corion, por lo que las intersecciones de las células subyacentes visibles. Continuar aplicando presión hasta que todo el blastómero de interés se ha eliminado. El uso de fórceps para rodar el embrión de un lado a otro y confirmar visualmente que todos los blastómeros de interés se ha ido.
- El uso de un inalterada 15 cm pipeta Pasteur, transferir el embrión para limpiar FASW + (FASW + 1 mg / ml de anfotericina B, 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina).
- Levante embriones blastómeros-ablación en pozos individualesde una placa de 48 pocillos limpia en FASW +, el cambio de 50% de FASW antibiótico-complementado + diaria. En nuestras manos embriones sobreviven y se desarrollan bien, incluso después de la ablación, en una gama de temperaturas de 18-28 º C. Los investigadores deben criar a sus embriones a una temperatura para los que tienen una superficie limpia (pero no necesariamente estéril) en el que criar a los embriones con el menor trastorno posible. Para poder comparar el calendario de eventos del desarrollo en embriones de blastómeros mediante ablación con controles, remitimos al lector a la información puesta en escena del desarrollo detallado que está disponible para los embriones planteadas a 18 º C 4, 25 º C 4, y 26 º C 5,6.
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Representative Results
Después de la ablación con éxito del single tercera hendidura P. micrómeros hawaiensis como se describe en este protocolo, los micrómeros restantes cambian gradualmente sus posiciones ligeramente con el fin de ocupar parcialmente el espacio anteriormente ocupado por la ablación de blastómeros. Por ejemplo, cuando se elimina g, la vecina blastómeras MR y ML cambiar ligeramente y llegar a compartir los bordes de las celdas laterales que antes estaban en contacto directo con g (comparar Figura 2A y 2C). Después de éxito de la ablación, los blastómeros restantes pueden mostrar un ligero retraso (de menos de una hora) antes de entrar en el cuarto de escisión, pero luego deben volver a los mismos patrones de escisión y los plazos que ellos han mostrado en los embriones no manipulados, al menos, a través de la gastrulación etapas 23 . Tras la ablación de cualquiera de los cuatro micrómeros, descendientes del blasto restantemeres también deben mostrar temporización de escisión normal y comportamientos celulares, incluyendo la formación de una disposición celular característica denominada la "roseta" y la iniciación de los movimientos de gastrulación 23. La proporción de embriones que sobreviven al procedimiento de ablación y la embriogénesis completa a través de la incubación puede ser inicialmente del orden de alrededor de 10% en el caso de un investigador de nuevo a la técnica, pero con la experiencia debe ser en promedio de aproximadamente 50%, y puede ser tan alta como 75% con la práctica y el cuidado vigilante de embriones después de la ablación de blastómeros. Tabla 1 muestra ejemplos de número de embriones ablación y las tasas de supervivencia para una serie de experimentos de ablación sucesivas realizadas por el mismo investigador, que muestran las tasas de supervivencia son generalmente al menos 80% durante los primeros días después de la ablación, y que las tasas de supervivencia a través de la eclosión aumento al aumentar la experiencia del investigador.
Eliminación incompleta de blastómeros seríase evidencia al ver los restos de la blastómeros que deberían haber sido extirpado, que podrían incluir componentes de la membrana, citoplasma, o gránulos de yema, aún situados en el corion del embrión. Un retraso en la cuarta división de más de dos horas, o los patrones de escisión irregulares o comportamientos celulares de los descendientes de los blastómeros restantes, también podría indicar la ablación sin éxito. Estos fenómenos pueden ser el resultado de daño causado a otros blastómeros durante el procedimiento de ablación. Si blastómeras distintos del blanco de la pantalla ablación anomalías morfológicas o se desintegran, y de nuevo dañar probablemente ha causado a otros blastómeras durante el procedimiento de ablación.
Si los marcadores destino celular están disponibles para etiquetar los descendientes de blastómeros tercera escisión específicos cuyos destinos no están sujetos a la sustitución de la regulación, y luego una confirmación adicional de la ablación exitosa se puede obtener de etiquetado manipulado embriones con esos marcadores Folloala de la ablación. Marcadores de algunos territorios del mesodermo y ectodermo se han descrito en la mitad de las últimas etapas de la embriogénesis 8,14,15. Sin embargo, como estos dos capas germinales pueden someterse a reemplazo regulativa en la pérdida de uno de sus fundadores blastómeras 25, estos marcadores pueden no sin ambigüedad a determinar si es o no blastómeras la ablación se realizó correctamente. En el caso de la línea germinal precursor g, todos sus descendientes se caracterizan por la expresión de transcripción vasa 12 y la proteína 4 a lo largo de la embriogénesis, y embriones en los que g ha sido erosionadas células germinales falta por lo menos a través de la banda de germen primeras etapas 4. La ablación con éxito de g de este modo se puede confirmar mediante el examen de la expresión Vasa después de la ablación en las etapas posteriores de la embriogénesis (Figura 5).
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Figura 1. Adultos Parhyale hawaiensis femenina y embriones. (A) Vista lateral de una hembra adulta P. hawaiensis, mostrando placas coxales (flechas), apéndices torácicos (puntas de flecha) y embriones visibles como esferoides de color rosa o púrpura a través de las placas coxales transparentes (esquema azul punteada). Anterior es a la izquierda. (B) Vista ventral de una mujer adulta P. hawaiensis mostrando embriones visibles en la bolsa de la cría (esquema azul punteada). Anterior es a la izquierda. (C) Los embriones liberados de bolsa de la cría se desarrollan normalmente en FASW. Una variedad de etapas que van desde S1 a través de la eclosión se muestra, por etapas de acuerdo con Browne et al 5 Barra de escala = 1 mm en (A) y (B);. 500 micras en (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ocho embriones en la etapa de células de P. hawaiensis. (A) Live fase de ocho células (fase S4 5) embrión no manipulada, que comprende cuatro micrómeros (células pequeñas) y cuatro macrómeros (células grandes). (B) Esquema de un embrión en su fase de ocho células mostrando designaciones destino celular de todos los blastómeros en un embrión de tipo salvaje como lo revela el linaje de rastreo basado en marcadores fluorescentes 6. (C) Live S4 embrión etapa que ha tenido la g blastómeros eliminado utilizando el presente protocolo. La región círculo muestra la región antes ocupada por el g blastómeros, elrestantes micrómeros han cambiado de posición ligeramente como resultado de la ablación de g. Barra de escala = 250 micras (A) y (C). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Herramienta de alambre utilizado para la eliminación de embriones a partir de la bolsa de la cría. La herramienta que se muestra aquí se hizo mediante la inserción de un alambre de tungsteno en el extremo estrecho de una pipeta Pasteur y suavemente la fusión del vidrio para sellar el cable en su lugar, a continuación, utilizando fórceps para introducir una curva suave en el alambre. Otras herramientas adecuadas para la eliminación de los embriones de la bolsa de la cría incluyen pinzas romas o un capilar de vidrio con un extremo sellado y alisado. Scale bar = 1 cm.
Figura 4. Aguja de vidrio utilizado para perforar blastómeras durante el procedimiento de ablación. La aguja que se muestra aquí se puso una aguja extractora P97 Sutter utilizando un programa con parámetros 2 x (calor = 566, Pull = 100, velocidad = 20, tiempo = 250) + 1 x (calor = 566, tire = 100, velocidad = 100, tiempo = 250). Otros instrumentos o programas pueden ser utilizados para tirar de las agujas adecuados para la ablación, mientras que son de la misma forma general que la que se muestra aquí. Barra de escala = 1 cm.
Figura 5. Evaluación de los resultados de blastómeros unablation durante la embriogénesis. (A) región de gónadas de un tipo salvaje etapa S29 embrión poco antes de la eclosión, que muestra células germinales etiquetados por anti-Vasa inmunotinción (puntas de flecha). El anticuerpo anti-Vasa utilizado aquí es específica de P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes y Extavour, datos no publicados). (B) Región gónadas de un embrión de etapa S29 que tenía el g blastómeros eliminado en la fase de ocho células, mostrando ausencia de células germinales según lo revelado por la ausencia de señal específica anti-Vasa en la región de las gónadas (puntas de flecha). La barra de escala en (A) = 100 micras y se aplica también a (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ronda Ablación | # Separada por ablación | # (%) Sobrevivieronal desarrollo 50% | # (%) Sobrevivieron al desarrollo del 90-100% |
| 1 | 49 | 41 (83,7) | 6 (12,2) |
| 2 | 48 | 46 (95,8) | 17 (35,4) |
| 3 | 31 | 25 (80,6) | 22 (71,0) |
| 4 | 97 | 72 (74,2) | 56 (57,7) |
| 5 | 108 | 100 (92,6) | 65 (60,2) |
| 6 | 50 | 36 (72,0) | 37 (74,0) |
| TOTALES | 383 | 320 (83,6) | 203 (53,0) |
Tabla 1. Representante supervivencia ablaciónestadísticas. Tras la ablación micromere, la supervivencia se puntuó tanto dentro del primer 50% de desarrollo (5-6 días a 25 º C) y luego en el desarrollo del 90-100% (10-12 días a 25 º C). Ablación redondea 1-6 son ejemplos representativos de experimentos llevados a cabo por un solo investigador (AR Nast) en orden cronológico en el transcurso de un período de ocho meses. Los investigadores deben encontrar que, como se muestra aquí, las tasas de supervivencia para aumentar el desarrollo del 90-100% con la experiencia.
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Discussion
Se describe un protocolo para la ablación manual y eliminación física completa de blastómeros independientes de división etapas tempranas del anfípodo P. hawaiensis. Se demuestra el uso de este protocolo mediante la eliminación de la única línea germinal de células precursoras g de un embrión en su fase de ocho células, y demostrar que la ablación ha sido un éxito, al confirmar la ausencia de células hijas g 's en la embriogénesis después. Este protocolo se puede utilizar para eliminar cualquiera de los micrómeros del embrión en las etapas de escisión temprana. Utilizar este protocolo para eliminar macrómeros en esta etapa, o blastómeras en las etapas primera o segunda de escisión, los usuarios sólo pueden aplicar las ligeras modificaciones de la creación de un agujero ligeramente más grande en el corion en el paso 4.4, y la aplicación de presión y de succión durante más tiempo para eliminar el mayor volumen de contenido de la celda en el paso 4.6. Hemos encontrado que, tras el uso de este protocolo, el desarrollo de los blastómeros restantes después de la ablación es la ONUafectada con respecto a los patrones de escisión y movimiento de células, al menos, a través de la hora de la gastrulación 23.
Este protocolo podría ser útil para la continua investigación sobre el potencial de desarrollo de blastómeros de escisión temprana en este anfípodo. Quedan muchas preguntas por responder en esta área, incluyendo por qué algunas células, pero no en otros pueden cambiar destinos para reemplazar los de blastómeros ablación, y el momento preciso y mecanismos de estos cambios regulativos. El protocolo también puede ser modificado para dar cabida a la ablación de más de una celda, simplemente repitiendo los pasos 4.2 a 4.7 sucesivamente sobre los blastómeros de interés.
Es importante utilizar un microscopio estereoscópico de alta calidad con iluminación adecuada con el fin de ver e identificar correctamente los blastómeros de escisión temprana. Encontramos ese incidente lateral blanca luz de una fuente de luz fría de fibra óptica es la más útil para este propósito. La luz incidente directamente sobre el SPECIMes crea reflexiones que pueden oscurecer las morfologías celulares y las fronteras, mientras que la luz transmitida no puede penetrar la densa yema de los embriones y por lo tanto blastómeras son difíciles de distinguir. Es muy útil para el vidrio de reloj o caja de Petri que contiene los embriones para ser colocados sobre una superficie de color negro en lugar de una superficie de vidrio blanco o transparente, ya que esto proporciona mejor contraste para los embriones pálidos.
Una limitación de este protocolo es que el blastómero de interés debe ser correcta y sin ambigüedades identificados antes de comenzar el procedimiento. Técnicas fotoablación serían más útiles para los investigadores nuevos en el sistema, ya que los embriones se pueden dejar de desarrollar para unos pocos ciclos de división después de la inyección del colorante fluorescente 28, y la identidad del blastómero inyectado confirmaron después de la inyección, pero antes de fotoablación, mediante el análisis de los patrones de los descendientes celulares, que han sido bien descritos en la línea celular anterioredad analiza 6,23. Una vez que los investigadores están familiarizados con el P. hawaiensis embrión y puede identificar todos los blastómeros con confianza, la ablación manual descrito aquí podría ser utilizado para aplicaciones en las que es deseable la eliminación física completa de un blastómero, en lugar de matar a la célula sin necesidad de retirar el cuerpo de células muertas desde el embrión,.
Este procedimiento podría, en principio, ser aplicado para eliminar blastómeros individuales a partir de embriones en estadio de división de otros crustáceos holoblastically de escisión, o de otros invertebrados marinos o de agua dulce cuya corion o membranas de fertilización no se puede quitar fácilmente. Las modificaciones podrían incluir el uso de medios de incubación con características apropiadas de salinidad, y la modificación de la forma de la aguja para dar cabida a las membranas más delicadas, agujas más largas (más finas) o revestimientos embrionarias más robustas (más cortos, agujas afiladas rápidamente).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Rayhan Arif y Hassaan Shahawy para el trabajo de cámara, Tripti Gupta y Frederike Alwes asistencia refinar la técnica de ablación celular, y los miembros del laboratorio Extavour para la retroalimentación de los datos, video y manuscrito. Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el Instituto de Células Madre de Harvard (Seed Grant número SG-0057-10-00) la Ellison Medical Foundation (Nueva Académico Premio número AG-NS-07010-10) a la CGE, y premios del programa de la universidad de Harvard para la Investigación ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
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