Summary
端脚Parhyaleのhawaiensisは甲殻類発生学および比較節足動物発展と進化の研究のための有望なモデル生物である。このプロトコルは、Parhyaleの初期卵割期胚からの単一割球を手動で除去する方法を説明します。
Abstract
端脚Parhyaleのhawaiensisは、世界中の潮間帯の海洋生息地で見られる小型の甲殻類です。過去10年間、Parhyaleは十分に研究節足動物モデル生物ショウジョウバエにとって有用な外集団の比較を提供し、開発の実験室での研究のための有望なモデル生物として浮上している。 ショウジョウバエの多核体の切断とは対照的に、Parhyaleの早期切断は全割のです。初期の割球に注入されたトレーサー染料を使用フェイト·マッピングは、3つすべての胚葉及び生殖系列は、8細胞期によって確立されることが示されている。この段階では、以下の3つの割球は外胚葉を生じさせる運命され、3つは中胚葉を生じさせる運命、残りの2つの割球は、それぞれ、内胚葉および生殖細胞の前駆体であるている。しかし、割球の切除実験はParhyale胚でも大幅な規制capabilitiを有することが示されている8細胞期のアブレーション割球の運命は、残りの割球の一部の子孫に引き継がれることができるようなES、。注入及び光毒性色素または手動切除のその後の活性化：割球アブレーションは、以前のいずれかの方法によって記載されている。しかし、光切除は、割球を殺すが、胚から死んだ細胞体は削除されません。特定の割球の完全な物理的除去は、したがって、いくつかのアプリケーションのためのアブレーションの好ましい方法であってもよい。ここでは、生きているとそのまま残りの割球を保持したまま細胞体を完全に除去するために必要な機器や手動の手順を示す、Parhyale胚の 8細胞期から単一割球を手動で除去するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、8細胞期、または他の初期卵割段階の割球に任意Parhyaleセルに適用することができる。また、原則的に、このプロトコルは、初期のクレアにも適用できる可能性が他の全割で切断する海洋無脊椎動物のvage期胚。
Introduction
端脚甲殻類のParhyaleのhawaiensisは、進化発生生物学研究1で使用するための大きな可能性を秘めた有望なモデル生物として、過去10年間にわたって浮上している。節足動物の中では、ほとんどのモデル系は昆虫であり、最も広範に研究され、これらの果物はキイロショウジョウバエフライです。D.キイロは昆虫双翅目のメンバーであり、基底に分岐昆虫2のものに対して誘導されるそのようなディスプレイの多くの発生学的特徴のような。また、昆虫は昆虫がpancrustaceansと呼ばれる長年の"自然な"グループ内の最も近い親戚があり、このグループは側系統であること。つまり、Pancrustacea 3亜門の中にネストされています。これは、基底部虫モデルを分岐に加えて、他の甲殻類の研究が発達形質αの進化の歴史のより広い視野を得るために必要であることを示唆しているとてもよくDに研究されているND分子機構キイロ 。しかし、非常に少数の甲殻類は、よく開発の実験室分析のために確立されている。端脚P. hawaiensisは、実験技術の範囲に従う非常に扱いやすい実験モデルシステムである。ヨコエビは親上目フクロエビ上目（ビーチホッパー、スカッド、井戸エビ）内の多くのユニークな機能を表示するため、比較的甲殻類のこのグループ内で誘導されると考えられている。それにもかかわらず、Parhyaleが提供する発生学的で機能的遺伝子操作の相対的な容易さは、この端脚モデル生物の現在の在庫に貴重な追加します。
実験動物、Pとしてhawaiensisは多くの利点を提供しています。動物は、温度と塩分の広い範囲に寛容であり、人工海水1の大文化でよく生き残る。それはbetwを区別することは容易である最も顕著なのは、明確な形態的な違いに基づいてEENの男性と女性、交尾の際にメスを把握するために使用する男性が大規模な、フック、前トランク付属。発生学的と開発作業のために、P. hawaiensisはいくつかの非常に魅力的な特徴を持っています。胚形成は、約10日間持続し、性的に成熟するまでの時間は、28ºC（約6週間ですが、Parhyaleは約20〜30ºCの範囲の温度で十分に生存し、その詳細な発達ステージング情報は、C 4 18度で昇胚のために利用可能であることに注意してください、25ºC 4、および26ºC 5,6）。大人の実験室で一年中交尾ので、胚は、一年中いつでも可能です。女性は最初のいくつかの脚部の対（ 図1Aおよび図1B）との間に位置する腹側育児嚢への受精卵（雌の年齢に応じて）2-20を置き、それは、これらの胚を収集することが可能である女性を殺すか、胚（ 図1C）を損傷することなく、非常に早い段階で開発中のS。胚が孵化に通して濾過した人工海水中で生き残り、その後の遺伝子発現または組織学的分析のために固定7、詳細ステージング表5を介して、現像進行の正確な同定を可能にすることができる。堅牢なプロトコルは、RNA干渉13,15又はモルホリノ12、及び安定した生殖系列遺伝子導入18による機能ノックダウン、in situハイブリダイゼーション 8-15 4,16,17または免疫染色におけるによる遺伝子発現解析を行うために使用されている。遺伝子導入システム、誘導発現14および19の方法はまた、P.における遺伝子機能を研究するために用いることができるエンハンサートラップを使用してhawaiensis。公的に利用可能なゲノム配列は、現在利用可能ではありませんが、卵形成および胚発生中に生成転写物を含んだトランスクリプトームは、蜂を持っているN デノボを組み立て、20の注釈付き、および遺伝子発見を容易に検索可能なデータベース21に寄託。要するに、P. hawaiensisは、開発を理解するための複数の実験的および遺伝的アプローチに適し、非常に扱いやすいモデル生物である。
Dの初期の多核体の切断とは異なり、 キイロ、P. hawaiensis胚は受精（ 図2A）以下の全割で切断する。分析のトレースは、第三の系統切断により、第三の開裂割球の各々が具体的に三胚葉又は生殖細胞系6（ 図2B）のいずれかを生じさせるように運命づけられていることを示している。これらのデータは、一緒になって、マイクロアレイデータ22と、細胞系統は6,23を解析し、割球分離実験4は、発生電位はセルの非対称継承によって、少なくともいくつかの第三の開裂割球に偏析していることを示唆しているLの運命決定因子。細胞の非存在によって示されるように従って、（Parhyale細胞系統命名法6の「 グラム 」と呼ばれる）の生殖細胞系前駆体は、8細胞期で除去された割球アブレーション実験において、胚は、後期発生段階4から生殖細胞を欠いていほとんどの後生動物24における生殖細胞系列のマーカーであるタンパク質ヴァーサ号を発現する。対照的に、体細胞割球アブレーション実験は、P. hawaiensis胚も8細胞期で切除され、中胚葉または外胚葉前駆割球の運命は、残りの割球25のいくつかの子孫に引き継がれ ることができるような大幅な規制能力を持っている。どのように調節的細胞運命の交換が発生する可能性があり、体細胞割球による自律的な細胞運命の採用の程度は、未知のままである。このような割球アブレーションなどの実験発生学的手法は、understanに便利です鼎は相対的な自律性と細胞運命決定26,27のnonautonomyとは、P.の研究に興味がある、したがってhawaiensisの胚発生。
外胚葉および中胚葉系統の調節的置換を示した実験において、割球アブレーションは、注射28及び光毒性色素25の後続の励起により行った。この技術は注入された割球（複数可）を殺すのに効果的であるが、それは完全に胚から死んだ細胞体は削除されません。また、違いは細胞系譜蛍光系統トレーサー28,29と割球を注入することによって、胚発生の原腸段階に至るまで収集されたデータ、及び同じ胚のステージ23の開発を通じて非摂動割球に従うことによって収集されたデータとの間で観察されている。特定の割球の完全な物理的除去は、したがって、いくつかのアプリケーションのためのアブレーションの好ましい方法であってもよい。
我々は以前、細胞系統の結果は、単セル23を手動でアブレーションされた胚の分析を発表した。しかし、初期の卵割期胚からの単一割球を除去するために必要な繊細な操作は、まだ完全に記載されていない。ここでは、Pの収集のためのプロトコルを提示hawaiensis胚と8細胞期胚からの単一割球を手動で切除。この方法の目的は、胚発生および後胚発生中に残存する細胞の細胞挙動の観察および細胞運命の能力を可能にする胚からの細胞体の完全な除去を達成することである。我々のプロトコルは、生殖細胞系前駆グラム （ 図2C）の除去を示しているが、以前の開裂段階の割球を、8細胞段階で任意のセルに適用することができる。原則として、このプロトコルは、パーソナルプラグインの初期卵割期胚から単一細胞を除去するために適用することができるR全割で海洋無脊椎動物を切断。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
特定の手順を実行する際に役立つかもしれないコメントはイタリック体で示されている。
1。 1日目：材料の調製
- 以下の材料を（材料および装置の表を参照）準備します。
- 15センチメートルと22センチパスツールピペット
- ダイヤモンドスクライブ
- 1 mg / mlのアムホテリシンB（100 mg / mlの保存溶液の1:100）、100単位/ mlペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン（原液の1:50に含むフィルター人工海水（0.0018から0.0020の間に塩分） ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン5,000 mg / mlの5,000単位/ mlを含有する
- 無添加フィルター人工海水（0.0018から0.0020の間塩分）
- 住宅カップルのための大規模なプラスチック容器（15cm以上×15センチ×5cm）に
- 小さな（3 cm以上5cm）にシルガードを敷いたペトリ皿
- 小さな（3 cm以上5cm）にペトリ皿
- 時計皿またはガラス製マルチウェルプレート
- 鉗子（私たちはあちこちに派生鈍鉗子を使用我々は鉗子の端が両方の歯が同じ長さであることを、滑らかであり、彼らはもはや持っていることをことを保証するために、石を研ぐ鉗子を使用して再利用している、誤って他の実験手順で被害を受けたM旧デュモン＃5鉗子、シャープポイント。彼らは胚および/または女性を傷つける可能性がある新たなデュモン＃5鉗子などの非常に微細な鉗子は、望ましくない。）
- 終了したパスツールピペット（下記ステップ1.2を参照）を広げ
- パスツールピペットの細い端部に埋め込まれた薄い、湾曲タングステンワイヤからなる胚検索ツール（代替の実装で置き換えることができ、1.3以下を参照のこと）
- 小さな開口部で口ピペット（以下のステップ1.4を参照してください）
- プルガラスキャピラリーから作られたガラス針（以下のステップ1.5を参照してください）
- それから広がったパスツールピペット、ピペットは、ダイヤモンドスク狭い指を保護するためにキムワイプや紙タオルでピペットの得点部位をラップし始めの時点で15cmのパスツールピペットの周りの第1のスコア、慎重を作成するにはスコアラインの先端を解消。エッジを滑らかにするために、数秒間ブンゼンバーナーの炎の上ピペットの壊れた端を持ってください。開口部は、ピペットの最大幅より若干狭くする必要があります。
- ツールを解剖タングステン線を作るために、15cmのガラスパスツールピペットの端部にタングステン線を挿入し、所定の位置にワイヤーを固定し、ガラスを溶融するブンゼンバーナーの炎の上に簡単に保持します。フック形状に穏やかにカーブワイヤの端に鉗子を使用してください。このツールの適切な形状の例については、 図3を参照してください。
- 口のピペット用の小さな開口部を作るために、二つの部分OV開始22センチパスツールピペットの細い端を引っ張るER炎、小端の先端を解消。口のピペットホルダーの端部に挿入します。
- ニードルプラーを用いて切除処置中に関心対象の割球を穿刺するために使用されるガラス針を作る。適切な形状の針が図4に示されている。この針は、パラメータ2X（熱= 566、プル= 100、速度= 20時間= 250）+ 1Xでプログラムを使用してサターのP97針プラーで引いた（熱= 566、プル= 100、速度= 100時間= 250）。まだまた、胚の絨毛膜に押し付けたときに破損しないよう十分に頑丈であること、針を作るために使用される特定のプログラムと機器を変えることができるが、針は細かい点を持っている必要があります。
2。 1日目：ザ·ギャザリングParhyale嵌合カップル
- Pを交配収集するために拡大し、パスツールピペット（上記の手順は1.2）を使用して、大規模な培養容器からhawaiensisカップル 、およびCを含む別の容器に転送人工海水を傾けます。これは海水を濾過する必要はない。翌朝は、ほとんどの胚は最近受精や堆積ため、早期の切断に適したステージされていますように、後の午後には、相手のペアを収集し、室温で一晩（20〜23℃）でカップルを残すために最善のことですアブレーション。一部の女性は、次の朝までに初期卵割期胚を運ぶされることを保証するために、少なくとも20の嵌合ペアを収集します。
3。 2日目：ザ·ギャザリングParhyale胚
- 翌朝、CO 2を用いて濾過人工海水（FASW）を注入する。メスの中には、夜の間にその男性から無料で泳いているでしょう。これらの分離の女性を集めて、FASW / CO 2でそれらを麻酔。 残りの不対男性は交配対容器から取り出し、大きな培養に戻すことができる。残りの交配のペアは、後の胚の収集のために保存することができます当日または翌日中。
- FASW / CO 2中の時計皿に胚を運ぶ単一の麻酔をかけた女性を転送します。すべての分離の女性はおそらく、女性の透明寛骨プレート（ 図1A）を介して淡いピンクや紫色の球状体などの目で見えるようになりますこれ、卵を堆積しているでしょう。胚は初期卵割段階にあると割球の切除のためこのように適切かどうかを判断するために、研究者が育児嚢から胚を削除し、顕微鏡下でそれらを検討する必要があります。
- 解剖顕微鏡下で手順を見て、鉗子で体の片側に沿って寛骨プレートを把握する。胚は、これらの寛骨プレート（ 図1B）間の腹側育児嚢に表示されます。
- 育児嚢の後端に、ゆっくりひなを分離するために育児嚢の前端に向かってワイヤーを持ち上げ、細い、曲がったワイヤ工具（上記の手順1.3 の図3）を挿入しますポーチ用敷物（これらは30 oostegites呼ばれる腹側の付属を修正している）、ポーチを開いて胚を緩める。この膜は、産卵後約2〜3時間で消え、胚はバインドされていない、すべてが簡単にワイヤ工具によって破壊され、非常に薄い、透明な膜で囲まれて置かれている最初の1時間かそこら内にある胚お互いに、またはどのような方法で女性に胚形成を通じてこれ以降。研究者が育児嚢から胚を除去するための湾曲したワイヤ工具を操縦することは、不都合なまたは困難見つけた場合、代わりの実装がある限り動きが穏やかであり、全く厳しい圧力が胚または育児嚢に適用されていないとして、使用することができる。育児嚢から胚を除去するのに適切な他のツールを密封し、平滑末端と平滑化鉗子やガラスキャピラリーが含まれています。
- Tを押し出し、開かれた育児嚢を介して水をフラッシュするために変更されていない15cmのパスツールピペットを使用して、彼は時計皿の底に沈殿べき胚。本培養に彼女を再導入する前に、リカバリを可能にするために（CO 2を含まない）FASWをきれいにする女性を転送します。複数の雌は同じリカバリ·皿に入れたが、彼らはまだ部分的に麻酔をかけた場合、彼らは他の動物に食べられるように、女性がメインの文化にそれらを返す前に完全に回復することを可能にすることができます。
- きれいなFASWでペトリ皿に胚を転送し、その胚の段階を決定するために、顕微鏡下で表示する変更されていない15cmのパスツールピペットを使用してください。この手順に適している第三の切断（ステージ4 5）にある別々の胚。また、従来の生殖ディスク成立の卵割期にこのプロトコルを適用することが可能であるべきである（7-8 5段 ）。
4。 2日目：単一細胞を切除する
- FASWの浅い層でのSylgardが並ぶペトリ皿を埋める。変更されていない15cmのパスツールPIを使用してくださいプレートに、単一の胚を転送するpette。
- 鈍鉗子を用いて、穏やかに（ 図2Aおよび2B）切除される細胞を同定するために胚をロール。生殖細胞系前駆体gは、最小の大割球MAVの上に座っている最小の小割球として同定することができる。また、Gは、直接中胚葉前駆体micromeres ML、MRをシェア胚の中央にあるセルの境界線として、その向かいに直接小割球である、専用のセルに接触しない。MRがGの右の割球であり、 ミリリットルは、Gの左側の小割球です。 MR、ML、および ENの姉妹macromeresは外胚葉前駆体それぞれのEr、EL、および EPである。
- LEF中のピンセットで研究者が右利きの場合は、Tの手が（あるいは右手の研究者が左利きされている場合）、右に目的の細胞と胚の向き（または左に研究者が左利きされている場合）、および静かに安定させる鉗子間の胚を把握する。
- プルガラス針（上記の手順1.5、 図4）を使用して、ゆっくりと目的の細胞に穴を開ける。隣接する細胞へ、または目的の細胞の下に針をプッシュしないように、あまりにも遠くに針を挿入しないでください。針は絨毛膜とその下の細胞膜に穴を開ける必要があり、切除される細胞内に深く拡張する必要はありません。
- 交換罰金口のピペットのガラス終わりのための胚を穿刺するために使用される針は、パスツールピペットチップ（上記のステップ1.4）を引っ張った。目的の細胞内に作成穴の近くにピペットの先端を持ち、非常に穏やかな吸引を適用します。
- 非常に静かに鉗子で胚を絞る。胚盤の内容として単なるステップ4.4で作成した穴から絨毛膜の外に押し出され、胚の遮るもののないビューを可能にするために口のピペットにそれを吸う。孔が十分に大きい場合、パンクチャ細胞の核は、同様に現れることが分かる。これは全体のセルの内容が削除されていると再生できないことを確認するには良いチェックです。
- 興味の割球が取り除かれたとして、慎重に胚を観察します。パンクしたセルの枠線は、基礎となる細胞の交点が見えるように、絨毛膜の穴の方に後退します。興味の割球のすべてが除去されるまで圧力をかけ続ける。左右に胚をロールバックする鉗子を使用して、視覚的に興味のある割球のすべてがなくなっていることを確認してください。
- 変更されていない15cmのパスツールピペットを用いて、（FASW + 1 mg / mlのアムホテリシンB、100単位/ mlペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン）FASW +をきれいに胚を移す。
- 個々のウェル中の割球アブレーション胚を上げるFASW +クリーン48ウェルプレートの、日々の抗生物質を補充FASW +の50％を変更する。私たちの手の中に胚が生存し、18〜28ºCからの温度範囲で、よくても、次のアブレーションを開発研究者は、最小限の乱れで胚を上げるために、クリーン（必ずしも無菌ではない）の面を持っている温度で、その胚を発生させる必要があります。コントロールと割球アブレーション胚における発生事象のタイミングを比較できるように、我々は18ºC 4、25ºC 4で上昇胚可能です詳細な発達ステージング情報を読者に参照し、26ºC 5,6。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
単一の第3の切断Pの成功アブレーション次このプロトコルで説明したように部分的に切除された旧割球の占有スペースを占めるようにhawaiensisの micromeresは、残りのmicromeresは徐々に少しの位置をずらす。 Gが除去されると、たとえば、割球のMRに隣接しては若干シフトし、Gと直接接触する（ 図2Aおよび2Cの比較）で、以前いた横方向のセルの枠線を共有するようになってきミリリットル 。成功切除に続いて、残りの割球は、第四の切断に入る前に（1時間未満の）わずかな遅延が表示されることがありますが、彼 らは、彼らは、少なくとも原腸形成段階23に至るまで操作されていない胚に表示しているのと同じ切断パターンとタイミングを再開しなければならない。 4 micromeres、残りの胚盤の子孫のうちのいずれかの次のアブレーションミアズも「ロゼット」と原腸の動き23の開始と呼ばれる特徴的な細胞構造の形成を含む通常の切断タイミングと細胞挙動を示すべきである。孵化に至るまでアブレーション処置完全胚形成を生き残る胚の割合は、最初に新しい技術研究者にとって約10％程度であるが、経験して約50％を平均化し、約75％と高くすることができる割球切除後の胚の実践と警戒、注意して表1にアブレーションされた胚の数及びその生存率は、最初のいくつかのために、一般的に少なくとも80％を示す同じ研究者によって行われる連続的な切除一連の実験のための生存率の例を示す研究者の増加経験の上昇を孵化に至るまで切除し、その生存率を、次の日。
不完全な割球の除去は次のようになります。まだ胚の絨毛膜内に位置し、膜成分、細胞質、または卵黄顆粒を含むことができるアブレーションされている必要が割球の名残を見ることによって証明。二時間以上の第四の切断、あるいは不規則な切断パターンや残りの割球の子孫細胞の挙動の遅れは、また失敗したアブレーションを示している可能性があります。これらの現象は、アブレーション処置の間に他の割球に生じた損傷の結果であり得る。アブレーション表示形態異常をターゲット1や損傷、その後、再び、崩壊以外の割球は、おそらく、切除処置中に他の割球に生じていた場合。
細胞運命マーカーは運命調節的交換の対象とはならない特定のサード切断割球の子孫にラベルを付けるために利用可能である場合には、成功したアブレーションのさらなる確認は、これらのマーカーfolloで操作された胚を標識化することによって得ることができるウイングアブレーション。いくつかの中胚葉および外胚葉地域のマーカーは、胚発生8,14,15の後期半ばに記載されている。これらの胚葉の両方が彼らの創設者の割球25の1の損失時に調節的交換を受けることができるので、これらのマーカーは明確にアブレーションが成功した割球かどうかを判断しない場合があります。生殖細胞系前駆gの場合には、そのすべての子孫は、胚発生を通して脈転写物12およびタンパク質4の発現によりマークされ、gは少なくとも4つの初期の胚帯段階に至る欠如の生殖細胞をアブレーションされた胚た。 gでの成功したアブレーション、従って胚形成の後期段階におけるアブレーション（ 図5）以下の脈管の発現を調べることにより確認することができる。
SRC = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />：FO番目は= "5インチ"
図1。成人女性PのアダルトParhyale hawaiensis女性胚（A）側面図hawaiensis、寛骨プレート（矢印）を示す、胸部付属（矢頭）と透明寛骨プレート（青点線）を介してピンクや紫色の球状体などの目に見える胚。前方左にある。成人女性Pの（B）の腹を見るhawaiensis育児嚢（青点線）に表示胚を示す。前方左にある。育児嚢から放出された（C）胚FASWで正常に発達。 S1からのハッチングが示されている段階までの範囲の様々なブラウンらに従って5段階スケールバー= 1（A）中のミリメートルおよび（B）;500μmの（C）に。51073/51073fig1highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。 Pの八細胞期胚hawaiensis。（A）は 4 micromeres（小さ なセル）と4 macromeres（大きなセル）を含む、8細胞期（ステージS4の5）操作されていない胚を生きています。 （B）蛍光マーカー6に基づいてトレースする系統によって明らかにされた野生型胚のすべての割球の細胞運命の指定を示す8細胞期胚の模式図。 （c）は、本プロトコルを使用して除去したG割球を持っていた、S4期胚ライブ。丸で囲んだ領域は、以前のG割球が占める領域を示しています。残りmicromeresは、Gのアブレーションの結果として、わずかに位置をずらしている。スケール（A）中=250μmのバーと、（C）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。育児嚢から胚を除去するために使用されるワイヤ工具。ここに示したツールは、緩やかなカーブを導入するために鉗子を使用して、次いで、パスツールピペットの狭い端部にタングステンワイヤを挿入し、静かに適所にワイヤを封止するガラスを溶融することによって作製したワイヤーに。育児嚢から胚を除去するのに適切な他のツールを密封し、平滑末端と平滑化鉗子やガラスキャピラリーが含まれています。サウスカロライナ州= 1センチメートルエールバー。
図4。アブレーション手技中に割球を穿刺するために使用されるガラス針。ここに示されている針はパラメータ2 X（ヒート= 566、プル= 100、速度= 20時間= 250）+ 1 xはプログラムを使ってサターのP97針プラーで引いた（熱= 566、プル= 100、速度= 100時間= 250）。他の器具またはプログラムは、それらがここに示されたものと同じ一般的な形状のものであるように、切除に適した針を引っ張るために使用することができる。スケールバー= 1 cmである。
図5。割球Aの結果を評価するblation胚形成中に（A）のダウンロードが抗ヴァーサ免疫染色（矢印）によって標識された生殖細胞を示す、孵化前に野生型のステージS29胚の生殖腺地域。ここで使用される抗ヴァーサ抗体は、P.に特異的であるhawaiensisヴァーサ（Linsler、AlwesとExtavour、未発表データ）。 （B）生殖腺領域（矢印）における特異的抗ヴァーサ信号の不在によって明らかにされるように、生殖細胞の非存在を示す、8細胞段階で除去グラム割球を有した段階S29胚の生殖腺領域。 （A）=100μmの中のスケールバーと（B）についても同様である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| アブレーションラウンド | ＃アブレーションさ | ＃（％）生き残った50％の開発に | ＃（％）は90〜100%開発まで生存 |
| 1 | 49 | 41（83.7） | 6（12.2） |
| 2 | 48 | 46（95.8） | 17（35.4） |
| 3 | 31 | 25（80.6） | 22（71.0） |
| 4 | 97 | 72（74.2） | 56（57.7） |
| 5 | 108 | 100（92.6） | 65（60.2） |
| 6 | 50 | 36（72.0） | 37（74.0） |
| 合計 | 383 | 320（83.6） | 203（53.0） |
表1。代表的切除の生存統計は、。小割球切除に続いて、生存（25ºCで10〜12日）（25ºCで5〜6日間）の開発の最初の50％以内とし、90から100パーセントの開発の両方で記録された。アブレーションラウンド1-6は、8ヶ月の期間にわたって時系列的に、単一の研究者（ARナスト）によって行われた実験の代表的な例である。経験を持つ90〜100パーセントの開発が増加するには、こちらの生存率を示すように研究者は、それを見つける必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、手動の切除や端脚Pの初期卵割段階から単一割球を完全に物理的に除去するためのプロトコルを記述hawaiensis。我々は、8細胞期胚から単一の生殖系列前駆細胞gを除去することによって、このプロトコルの使用を示す、アブレーションは、後胚発生におけるグラムの娘細胞の有無を確認することに成功していることを示している。このプロトコルは、初期卵割段階での胚からmicromeresのいずれかを削除するために使用することができる。第一または第二の切断の段階で、この段階でmacromeres、または割球を除去するためにこのプロトコルを使用するには、ユーザーは単にステップ4.4で絨毛膜内のわずかに大きい穴の作成、長時間の圧力と吸引を適用する若干の修正を適用することができますステップ4.6で、セルの内容の大きなボリュームを削除します。我々は、このプロトコルの使用以下、アブレーション後の残りの割球の開発は不可であることを見出した少なくとも、原腸23時までを切断し、細胞運動パターンに関して影響を受ける。
このプロトコルは、この端脚における初期卵割球の発生能に入っても続い調査のための役に立つかもしれません。多くの質問がいくつかの細胞ではなく他の人が切除さの割球のそれを置き換えるために運命を変えることができる理由を含め、この分野で回答されずに残っているし、これらの調節的変化の正確なタイミングとメカニズム。プロトコルは、単に目的の割球に連続して4.2〜4.7の手順を繰り返すことにより、複数のセルのアブレーションを収容するように修飾することができる。
なお、初期卵割割球を表示し、正しく識別するために適切な照明を有する高品質の立体顕微鏡を使用することが重要である。我々は、光ファイバ冷光源からの横方向の入射白色光は、この目的のために最も有用であることがわかります。直接SPECIM上記の入射光透過光が胚および割球の密な卵黄を貫通するように失敗しながらENは、携帯の形態との境界を曖昧にすることができ、反射を作成し、そのため、区別することは困難である。これは淡胚のための最良のコントラストを与えるように、それは、時計皿又は黒色表面ではなく、白色または透明なガラス表面上に配置される胚を含むペトリ皿に最も有用である。
この議定書の一つの限界は、対象とする割球が正確かつ明確に手順を開始する前に、識別されなければならないということです。胚は蛍光色素28の注射後、数切断サイクルの開発に残すことができるので、光アブレーション技術は、システムに新しい研究者のためのより有用であろうと、注入された割球の正体は、ポスト噴射を確認したが、光アブレーションの前にウェル前の細胞株に記載されている細胞の子孫のパターンを分析することによって年齢は6,23を分析します。研究者は、Pと理解したらhawaiensis胚と自信を持ってすべての割球を識別することができ、ここで説明する手動の切除ではなく胚から死んだ細胞体を除去することなく、細胞を殺すよりも割球の完全な物理的除去は、望ましい用途に使用することができた。
この手順では、原則的には他の全割で切断する甲殻類の卵割期胚、またはその絨毛膜や受精膜を容易に除去することはできませんその他の海洋や淡水無脊椎動物から単一割球を除去するために適用することができる。修飾は、適切な塩分特性を有するインキュベーション培地を用いて、より繊細な膜（長く薄い針状）、またはより堅牢な胚性被覆（短く、迅速に針をテーパ）を収容するために針の形状を修正することを含むことができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、データ、ビデオ、および原稿について報告用RayhanアリフとHassaan Shahawyカメラワークのため、TriptiグプタとFrederike Alwes細胞除去技術を洗練支援のため、およびExtavourラボのメンバーに感謝します。この作品は、部分的にハーバード幹細胞研究所によってサポートされていました（シード·グラント番号SG-0057-10-00）エリソン医療財団（新規奨学生賞番号AG-、NS-07010から10）CGEに、ハーバード大学の研究プログラム賞へARN。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
