Summary
Amfi Parhyale hawaiensis er en lovende modellorganisme for studier av krepsdyr embryologi og komparativ leddyr utvikling og evolusjon. Denne protokollen beskriver en metode for manuell fjerning av enkelt blastomeres fra tidlig cleavage stadium embryoer fra Parhyale.
Abstract
Amfi Parhyale hawaiensis er et lite krepsdyr som finnes i fjæra marine naturtyper over hele verden. I løpet av det siste tiåret, har Parhyale dukket opp som en lovende modellorganisme for laboratoriestudier av utviklingen, og gir en nyttig outgroup forhold til godt studert leddyr modellorganisme Drosophila melanogaster. I motsetning til de syncytialt spaltinger på Drosophila, tidlig spaltinger på Parhyale er holoblastic. Fate kartlegging ved hjelp av sporingsstoffer injiseres i tidlig blastomeres har vist at alle tre bakterie lag og spiren linjen er etablert av de åtte-cellers stadiet. På dette stadiet, er tre blastomeres skjebnebestemt til å gi opphav til ektoderm, er tre skjebnebestemt til å gi opphav til mesoderm, og de resterende to blastomeres er forløperne til endoderm og bakterie linjen hhv. Imidlertid har blastomere ablasjon eksperimenter vist at Parhyale embryoer også besitter betydelig regulatorisk capabilities, slik at skjebnen til blastomeres ablasjon ved åtte-cellers stadiet kan bli overtatt av etterkommere av noen av de gjenværende blastomeres. Blastomere ablasjon er tidligere beskrevet av en av to metoder: injeksjon og påfølgende aktivering av fototoksiske fargestoffer eller manuell ablasjon. Men Photoablation dreper blastomeres men ikke fjerner døde celler kroppen fra embryo. Fullstendig fysisk fjerning av spesifikke blastomeres kan derfor være en foretrukket metode for ablasjon i noen anvendelser. Her presenterer vi en protokoll for manuell fjerning av enkelt blastomeres fra åtte-cellers stadiet av Parhyale embryoer, illustrerer instrumenter og manuelle prosedyrer som er nødvendige for fullstendig fjerning av cellen kroppen mens du holder de resterende blastomeres levende og intakt. Denne protokollen kan brukes på alle Parhyale celle på åtte-cellers stadiet, eller til blastomeres av andre tidlig cleavage etapper. I tillegg, i prinsippet denne protokollen kan være aktuelt for tidlig CleaVåge stadium embryo av andre holoblastically spaltingsprober marine virvelløse dyr.
Introduction
Amfi krepsdyr Parhyale hawaiensis har dukket opp det siste tiåret som en lovende modellorganisme med stort potensial for bruk i evolusjonær utviklingsbiologi forskning en. Blant de leddyr, de fleste modellsystemer er insekter, og den mest omfattende studert av disse er bananflue Drosophila melanogaster. D. melanogaster er medlem av insekt orden Diptera, og som sådan viser mange embryologiske funksjoner som er utledet med hensyn til de av basalt forgrening insekter to. Videre er insekter nestet i subphylum Pancrustacea 3, noe som betyr at insekter har sine nærmeste slektninger i den langvarige "naturlig" gruppe kalt pancrustaceans, og at denne gruppen er paraphyletic. Dette tyder på at i tillegg til basalt forgrening insekt modeller, er studier av andre krepsdyr som kreves for å få et bredere syn på den evolusjonære historien til de utviklingstrekk ennd molekylære mekanismer som har blitt så godt undersøkt i D. melanogaster. Imidlertid har svært få krepsdyr blitt godt etablert for eksperimentelle laboratorieanalyse av utviklingen. Amfi P. hawaiensis er en svært medgjørlig laboratorie-modell-system, mottagelig for en rekke eksperimentelle teknikker. Amfipoder vise mange unike funksjoner innenfor deres foreldre superorder Peracarida (strand hoppers, scuds, og vel reker), og er derfor antatt å være relativt avledet innenfor denne gruppen av krepsdyr. Likevel, det er relativt enkelt for embryological og funksjonell genetisk manipulasjon tilbys av Parhyale gjøre dette amfipode et verdifullt tillegg til den nåværende beholdning av modellorganismer.
Som forsøksdyr, P. hawaiensis gir mange fordeler. Planter er tolerant for et vidt område av temperaturer og saliniteter, og overleve godt i store kulturer av kunstig sjøvann 1.. Det er lett å skille between hanner og hunner basert på klare morfologiske forskjeller, særlig, de store, hektet, fremre trunk vedheng at menn bruker for å forstå kvinner under parring. For embryological og utviklingsarbeid, P. hawaiensis har flere svært tiltalende funksjoner. Embryo varer ca 10 dager og tid til kjønnsmodning er ca seks uker ved 28 º C (men merk at Parhyale overlever godt ved temperaturer fra ca 20-30 º C, og at detaljert utviklings iscenesettelse informasjon er tilgjengelig for embryoer hevet ved 18 º C 4 , 25 º C 4, og 26 º C 5,6). Voksne mate hele året i laboratoriet, slik at embryoer er tilgjengelig når som helst på året. Hunner lå 2-20 (avhengig av alderen av de kvinnelige) befruktede egg i en ventral rugepose plassert mellom de første par bein (figurene 1A og 1B), og det er mulig å samle disse embryoer veldig tidlig i utviklingen uten å drepe den kvinnelige eller ødelegger embryoer (figur 1C). Embryoene overleve i filtrert kunstig sjøvann gjennom til klekking, kan fikses for påfølgende genekspresjon eller histologisk analyse 7, og en detaljert rekkefølgetabell gir nøyaktig identifisering av fremdriften gjennom utvikling fem. Robuste protokoller har blitt brukt genekspresjonsanalyser å utføre ved in situ hybridisering 8-15 eller farging 4,16,17, funksjonell knockdown av RNA interferens 13,15 eller Morpholinos 12, og stabile kjønnsceller transgenesis 18. Ved hjelp av transgenesis system, induserbar ekspresjon 14 og enhancer-felle 19 fremgangsmåter kan også brukes til å undersøke gen-funksjon i P. hawaiensis. Mens en offentlig tilgjengelig genomsekvens er ikke tilgjengelig for øyeblikket, har en transcriptome inneholder transkripsjoner produsert under oogenesen og embryogenesis been de novo montert og kommentert 20, og deponert i en søkbar database 21, å legge til rette genet oppdagelse. I sum, P. hawaiensis er en svært medgjørlig modell organisme egnet for flere eksperimentelle og genetiske tilnærminger til å forstå utviklingen.
I motsetning til de tidlige syncytialt spaltinger på D. melanogaster, P. hawaiensis embryoer holde seg holoblastically etter befruktning (Figur 2A). Avstamning tracing analyse har vist at ved tredje spalting, er hver av de tredje cleavage blastomeres spesifikt dømt til å gi opphav til en av de tre bakterie lag eller spiren linje 6 (figur 2B). Disse dataene, sammen med microarray data 22, analyserer celle avstamning 6,23, og blastomere isolasjon eksperimenter 4 har antydet at utviklingspotensialer er segregert til minst noen tredje cleavage blastomeres av asymmetrisk arv av cell skjebne determinanter. Følgelig, i blastomere ablasjon eksperimenter hvor spiren linje forløper (betegnet "g" i Parhyale celle lineage nomenklatur 6) ble fjernet ved åtte cellestadiet, embryoer manglet kimceller på senere utviklingsstadier 4, som vist ved fravær av cellene uttrykker proteinet Vasa, som er en bakterie linje markør i de fleste metazoans 24. I kontrast, somatiske blastomere ablasjon eksperimenter viste at P. hawaiensis embryoer også ha betydelige regulatoriske evner, slik at skjebnen til mesoderm eller ektoderm forløper blastomeres ablasjon ved åtte-cellers stadiet kan bli overtatt av etterkommere av noen av de gjenværende blastomeres 25. Hvordan regulative celle skjebne erstatning kan oppstå, og omfanget av selvstendig celle skjebne adopsjon av somatiske blastomeres, forblir ukjent. Eksperimentelle embryologiske teknikker som blastomere ablasjon kan være nyttig i forståelseding den relative autonomi og nonautonomy av celle skjebne beslutninger 26,27 og er derfor av interesse i studiet av P. hawaiensis embryogenese.
I forsøkene som viste regulative utskifting av ectodermal og mesodermal linjene, ble blastomere ablasjon utføres ved injeksjon 28 og påfølgende eksitasjon av fototoksiske fargestoffer 25. Selv om denne teknikken er effektiv på å drepe den injiserte blastomere (s), betyr det ikke helt fjerne døde celler kroppen fra embryo. I tillegg har forskjellene blitt observert mellom celle avstamning data samlet gjennom å gastrulation stadier av embryogenesis ved å injisere blastomeres med fluorescerende avstamning tracere 28,29, og data samlet av følgende uaffisert blastomeres gjennom utvikling av de samme embryonale stadier 23. Fullstendig fysisk fjerning av spesifikke blastomeres kan derfor være en foretrukket metode for ablasjon i noen anvendelser.
Vi har tidligere publisert resultatene av celle avstamning analyser av befruktede egg der enkeltceller ble manuelt ablasjon 23. Men de delikate operasjoner som kreves for å fjerne enkelt blastomeres fra tidlig cleavage stadium embryoer har ennå ikke blitt fullstendig beskrevet. Her presenterer vi en protokoll for samling av P. hawaiensis embryoer og manuell ablasjon av en enkelt blastomere fra en åtte-cellers stadiet embryo. Målet med denne metoden er å oppnå fullstendig fjerning av cellekroppen fra embryo, slik at observasjon av mobiltelefon atferd og celle skjebne kompetansen til de resterende celler under embryogenesis og post-embryoutvikling. Vår protokoll viser fjerning av bakterie linje forløper g (figur 2C), men kan anvendes på en hvilken som helst celle på åtte-cellestadiet, eller for å blastomeres av tidligere cleavage stadier. I prinsippet kan denne protokollen brukes til å fjerne enkeltceller fra tidlig cleavage stadium embryo av a.r holoblastically spalte marine virvelløse dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kommentarer som kan være nyttig i å gjennomføre visse tiltak er angitt i kursiv.
En. Dag 1: Utarbeidelse av materialer
- Forbered følgende materialer (se tabell av materialer og utstyr):
- 15 cm og 22 cm Pasteur pipetter
- Diamond spiss
- Filtrert kunstig sjøvann (saltinnhold mellom 0,0018 til 0,0020) inneholdende 1 mg / ml amfotericin B (1:100 av en 100 mg / ml stamløsning), 100 enheter / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin (01:50 av en stamløsning inneholder 5000 enheter / ml penicillin og 5000 mg / ml streptomycin)
- filtrert kunstig sjøvann (saltholdighet mellom 0,0018 til 0,0020) uten tilsetningsstoffer
- en stor plastbeholder for boliger par (minst 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- små (3 cm eller 5 cm) petriskåler foret med Sylgard
- små (3 cm eller 5 cm) petriskåler
- et urglass eller glass multi-brønn-plate
- tang (vi bruker sløv tang avledet from gamle Dumont # 5 tang som ved et uhell ble skadet i andre applikasjoner, som vi har igjen tatt i bruk ved hjelp av en tang Slipestein for å sikre at endene av tangen er jevne, at begge tindene har samme lengde, og at de ikke lenger skarpe spisser. Ekstremt fin pinsett, for eksempel nye Dumont # 5 tang, er uønsket, da de kan skade fostre og / eller kvinner.)
- en Pasteur-pipette med enden utvidet (se trinn 1.2 nedenfor)
- et embryo henting verktøyet består av en tynn, buet wolfram ledning innebygd i den tynne enden av en Pasteur pipette (kan bli erstattet av en alternativ implementere, se 1.3 nedenfor)
- en munn-pipette med en liten åpning (se trinn 1.4 nedenfor)
- en glass nål laget av et trukket glasskapillære (se trinn 1.5 nedenfor)
- For å gjøre utvidet Pasteur pipette, første resultat på rundt en 15 cm Pasteur pipette på det punktet der pipetten begynner å begrense med en diamantspiss, vikle scoret regionen av pipetten i en Kimwipe eller papirhåndkle for å beskytte fingrene, og deretter forsiktig bryte av tuppen på delestreken. Hold brutt enden av pipetten over en Bunsen brenner flammen i flere sekunder for å jevne ut kantene. Åpningen skal være litt smalere enn den maksimale bredden av pipetten.
- For å gjøre wolfram ledning dissekere verktøyet, sett i en wolframtråd inn i enden av et 15 cm glass Pasteur-pipette, og holder kort over en Bunsen-brenner flammen for å smelte glasset, å feste ledningen på plass. Bruk pinsett til forsiktig kurve enden av ledningen inn i krokform. Se figur 3 for et eksempel på en egnet form for dette verktøyet.
- For å gjøre en liten åpning for munnen pipette, trekker den tynne enden av en 22 cm Pasteur pipette i to deler oveh en flamme, og bryte av spissen av den lille ende. Sett inn i enden av munningen pipetteholder.
- Lag av glass nål som skal brukes til å punktere blastomeres av interesse under ablasjonsprosedyren ved hjelp av en nål avtrekker. En passende formet nål er vist i figur 4.. Denne nålen ble trukket på en Sutter P97 nål avtrekker ved hjelp av et program med parametere 2x (varme = 566, trekk = 100, hastighet = 20, tid = 250) + 1X (varme = 566, trekk = 100, hastighet = 100, tid = 250). Den spesifikke program og instrument som brukes til å lage nålen kan variere, men nålen må ha en fin spiss, men også være solid nok til ikke å bryte når presset mot chorion av embryoet.
2. Dag 1: Gathering Parhyale Mating Par
- Bruk utvidet Pasteur pipette (trinn 1.2) for å samle parring P. hawaiensis par fra den store kultur container, og overføre dem til en egen beholder som inneholder clene kunstig sjøvann. Det er ikke nødvendig at dette sjøvann skal filtreres. Det er best å samle sammenpassende par i den senere ettermiddag og la parene ved romtemperatur (20-23 ° C) over natten, slik at den neste morgen, vil de fleste embryoer har nylig blitt befruktet og deponert, og således ved begynnelsen av spaltningen stadier egnet for ablasjon. Samle minst 20 parring par for å sikre at noen kvinner vil være bærer tidlige cleavage stadium embryoer ved følgende morgen.
Tre. Dag 2: Gathering Parhyale embryo
- Den neste morgen, tilfører filtrert kunstig sjøvann (FASW) med CO 2. Noen av hunnene vil ha svømt fri fra sine menn i løpet av natten; samle disse separerte kvinner og bedøve dem i FASW / CO 2. De gjenværende uparede hanner kan fjernes fra parings paret beholderen og tilbake til den store kultur. Resterende parring parene kan lagres for embryo samling senerei dag eller neste dag.
- Overføre en enkelt bedøvet kvinnelig bærer embryo til en klokke glass i FASW / CO 2. Alle separerte kvinner vil trolig ha deponert egg, noe som vil være synlig ved øyet som blek rosa eller lilla sfæroider gjennom de gjennomsiktige hofte plater av hunnene (figur 1A). For å finne ut om embryoene er på tidlige cleavage etapper og dermed passer for blastomere ablasjon, vil forskeren nødt til å fjerne embryo fra rugepose og undersøke dem under et mikroskop.
- Ser på fremgangsmåten under et dissekere mikroskop, gripe hofte plater langs den ene siden av kroppen med pinsett. Embryoet vil være synlig i ventral rugepose mellom disse hofte plater (Figur 1B).
- Sett den tynne, buede ledning verktøy (Figur 3, trinn 1.3 ovenfor) i den bakre enden av rugepose, og løft forsiktig ledningen mot fremre enden av rugepose for å skille stamfiskposen belegg (disse er modifisert ventral vedheng kalt oostegites 30), åpne posen og løsning embryoene. Embryoer som er innenfor den første timen eller så for å bli lagt alle er innelukket i en svært tynn, gjennomsiktig hinne som lett blir forstyrret av ledningen verktøyet, denne membranen forsvinner etter ca 2-3 timer etter egglegging, og embryoer ikke er bundet til hverandre eller til den kvinnelige på noen måte fra dette punktet og utover hele embryogenese. Hvis forskere det upraktisk eller vanskelig å manøvrere den buede ledning verktøy for å fjerne embryoer fra rugepose, et alternativt iverk kan anvendes, så lenge bevegelsen er milde og ingen sterke trykk påføres til embryoene eller rugepose. Andre verktøy egnet for fjerning av embryoer fra rugepose inkluderer avstumpet tang eller et glass kapillær med en forseglet og glattet slutten.
- Bruk en uendret 15 cm Pasteur pipette til å spyle vann gjennom åpnet rugepose, presser ut tHan embryoer, som skal slå seg ned til bunnen av se-glass. Overfør den kvinnelige å rengjøre FASW (uten CO 2) for å tillate utvinning før gjeninnføre henne til hovedkulturen. Flere hunner kan plasseres i samme utvinningsrett, men tillate kvinner å komme seg helt før du returnerer dem til hoved kultur, da de kan bli spist av andre dyr dersom de er fortsatt delvis bedøvet.
- Bruk en uendret 15 cm Pasteur pipette til å overføre embryoene til en petriskål med rent FASW, og se under mikroskop for å fastslå fosterstadiet. Separate embryoer som er ved den tredje spalting (trinn 4 5), som er egnet for denne fremgangsmåten. Det bør også være mulig å bruke denne protokollen til noen cleavage scenen før bakterie plate dannelse (iscenesetter 7 til 8 mai).
4. Dag 2: ablating enkeltceller
- Fyll Sylgard-lined petriskål med et grunt lag med FASW. Bruk en uendret 15 cm Pasteur piPette å overføre en enkelt embryo til platen.
- Ved hjelp av butte tang, forsiktig rulle embryoet for å identifisere cellen som skal ablateres (figurene 2A og 2B). Spiren linjen forløper g kan bli identifisert som den minste micromere, som sitter på toppen av den minste macromere Mav. I tillegg gjør g ikke direkte kontakt med en celle, som er micromere direkte over fra det, som mesoderm forløper micromeres ml og mr deler en cellerammen på midten av embryoet. Mr er blastomere til høyre for g, og ml er den micromere til venstre for g. Søster macromeres av mr, ml, og no er Ektoderm forløpere ER, El, og Ep hhv.
- Med tang i LSFt hånd hvis forskeren er høyrehendt (eller i høyre hånd hvis forskeren er venstrehendt), orientere embryoet med cellen av interesse til høyre (eller venstre hvis forskeren er venstrehendt), og gripe forsiktig embryoet mellom tang for å stabilisere den.
- Ved hjelp av et trukket glassålen (trinn 1.5 ovenfor, Fig. 4), forsiktig punktere celle av interesse. Ikke sett inn nålen for langt, for ikke å skyve nålen inn i cellene nabo eller under cellen av interesse. Nålen har bare å punktere chorion-og underliggende celle-membran, og som ikke trenger å strekke seg dypt inn i den celle som skal ablateres.
- Bytt nålen brukes til å punktere embryo for glasset ende av en munn-pipette med en fin trukket Pasteur pipette (trinn 1.4 over). Hold i pipettetuppen nær hullet laget i cellen av interesse, og anvende meget lett sug.
- Veldig forsiktig klem embryoet med pinsett. Ettersom innholdet av BlastoMere er skjøvet ut av chorion gjennom hullet opprettet i trinn 4.4, suger den inn i munnen pipetten til å tillate en uhindret utsikt over fosteret. Hvis hullet er stort nok, kan kjernen i det punkterte cellen ses å komme i tillegg. Dette er en god sjekk for å sikre at hele celleinnholdet er fjernet og kan ikke regenereres.
- Observere embryo nøye som blastomere av interesse fjernes. Grensen av punktert cellen vil falle mot hullet i chorion, noe som gjør kryss av de underliggende celler synlige. Fortsett å påføre trykk til alle de blastomere av interesse er fjernet. Bruk pinsett til å rulle embryo fra side til side og visuelt bekrefte at alle de blastomere av interesse er borte.
- Ved hjelp av en uendret 15 cm Pasteur-pipette, overføres embryoet for å rense FASW + (FASW + 1 mg / ml amfotericin B, 100 enheter / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin).
- Hev blastomere-ablateres embryoer i individuelle brønnerav en ren 48-brønners plate i FASW +, endrer 50% av antibiotika-supplert FASW + daglig. I våre hender embryoer overleve og utvikle seg godt, selv etter ablasjon, ved en rekke temperaturer 18-28 º C. Forskere må heve embryoer ved en temperatur hvor de har en ren (men ikke nødvendigvis sterilt) overflate som å heve embryoer med minimal forstyrrelse. For å kunne sammenligne tidspunktet for utviklings hendelser i blastomere-ablateres embryoer med kontroller, henviser vi leseren til den detaljerte utviklings informasjon iscenesettelse som er tilgjengelig for embryoer hevet ved 18 º C 4, 25 º C 4, og 26 º C 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter vellykket ablasjon av enkelt tredje cleavage P. hawaiensis micromeres som beskrevet i denne protokollen, de resterende micromeres gradvis skifte sine posisjoner litt slik som å delvis okkupere plassen tidligere okkupert av den tyreoideaektomi blastomere. For eksempel, når g er fjernet, nabo blastomeres mr og ml skiftet litt, og kommer til å dele den laterale cellegrensene som tidligere var i direkte kontakt med g (sammenlign figur 2A og 2C). Etter vellykket ablasjon, kan de gjenværende blastomeres vise en liten forsinkelse (på mindre enn en time) før vi går fjerde cleavage, men de bør da gjenopptas samme cleavage mønstre og timing at de ville ha vist i umanipulerte embryoer minst gjennom å gastrulation iscenesetter 23 . Etter ablasjon av noen av de fire micromeres, etterkommere av de gjenværende Blastomeer bør også vise vanlig cleavage timing og cellulære atferd, inkludert dannelsen av en karakteristisk cellular ordning kalt "rosett" og initiering av gastrulation bevegelser 23. Andelen av embryo som overlever ablasjonsprosedyren og komplett embryogenese gjennom til klekking kan i utgangspunktet være i størrelsesorden på rundt 10% for en forsker ny til teknikk, men med erfaring bør gjennomsnittlig ca 50%, og kan være så høyt som 75% med praksis og årvåken vare på embryoer følgende blastomere ablasjon. Tabell 1 viser eksempler på antall embryoer ablasjon og overlevelse for en serie av suksessive ablasjon eksperimenter utført av den samme forskeren, som viser at overlevelsesprosenten er generelt minst 80% for de første dager etter ablasjon, og at overlevelsesprosenten gjennom å klekking stige med økende opplevelse av forskeren.
Ufullstendig blastomere fjerning ville væredokumentert av å se restene av blastomere som burde vært ablateres, som kan omfatte membran komponenter, cytoplasma, eller eggeplomme granulater, fortsatt ligger innenfor chorion av embryoet. En forsinkelse i fjerde spalting av mer enn to timer, eller uregelmessig cleavage mønstre eller cellulære atferd av etterkommere av de gjenværende blastomeres, kan også indikere mislykket ablasjon. Disse fenomenene kan være et resultat av skader påført andre blastomeres under ablasjonsprosedyren. Dersom andre enn den ene målrettet for ablasjon vise morfologiske avvik eller gå i oppløsning, så igjen skade blastomeres har trolig blitt påført andre blastomeres under ablasjonsprosedyren.
Hvis celle skjebne markører er tilgjengelig til å merke etterkommere av spesifikke tredje cleavage blastomeres hvis skjebner er ikke gjenstand for regulative erstatning, kan deretter ytterligere bekreftelse på vellykket ablasjon fås ved merking manipulert embryoer med disse markørene Follofløyen ablasjon. Markører for noen mesodermal og ectodermal territorier har blitt beskrevet på midten til slutten stadier av embryogenesis 8,14,15. Men fordi begge disse bakterie lag kan gjennomgå regulative erstatning ved tap av en av sine grunnlegger blastomeres 25, disse markørene kan ikke entydig fastslå om blastomere eller ikke ablasjon var vellykket. I tilfelle av kimen linje forløper g, er alle av dens etterkommere som er merket ved ekspresjon av vasa transkripsjon 12 og protein 4 gjennom embryogenese og embryoer hvor g er blitt ablated mangel kimceller i det minste frem til begynnelsen av bakterie båndet trinn 4.. Vellykket ablasjon av g kan dermed bli bekreftet ved å undersøke vasa uttrykk etter ablasjon i senere stadier av embryogenesis (figur 5).
th = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />
Figur 1. Voksen Parhyale hawaiensis kvinnelige og embryoer. (A) Lateral visning av en voksen kvinne P. hawaiensis, viser hofte plater (piler), thorax vedheng (pilspisser) og embryo synlige som rosa eller lilla sfæroider gjennom de gjennomsiktige hofte plater (blå stiplet omriss). Anterior er til venstre. (B) Ventral visning av en voksen kvinne P. hawaiensis viser embryoer synlige i rugepose (blå stiplet omriss). Anterior er til venstre. (C) Embryoet løslatt fra rugepose utvikle seg normalt i FASW. En rekke scener som strekker seg fra S1 gjennom klekking er vist, arrangert i henhold til Browne et al 5 Skala bar = 1 mm i (A) og (B),. 500 mikrometer i (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Åtte celle stadium embryoer fra P. hawaiensis. (A) Live åtte-cellers stadiet (stadium S4 5) umanipulerte embryo, bestående av fire micromeres (mindre celler) og fire macromeres (større celler). (B) Skjematisk fremstilling av en åtte-cellers stadiet embryo viser celle skjebne betegnelser på alle blastomeres i en vill type embryo som avslørt av avstamning sporing basert på fluorescerende markører seks. (C) Live S4 scenen embryo som har hatt g blastomere fjernes ved hjelp av denne protokoll. Den sirklet regionen viser regionen tidligere okkupert av g blastomere; denrester micromeres har skiftet stilling noe som følge av ablasjon av g. Scale bar = 250 mikrometer i (A) og (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Wire verktøy som brukes for å fjerne embryoer fra rugepose. Verktøyet er vist her ble laget ved å sette inn en wolframtråd inn i den trange enden av en Pasteur-pipette og forsiktig smelting av glass for å forsegle wiren på plass, og deretter ved hjelp av tenger for å innføre en svak kurve inn i ledningen. Andre verktøy egnet for fjerning av embryoer fra rugepose inkluderer avstumpet tang eller et glass kapillær med en forseglet og glattet slutten. Scale bar = 1 cm.
Figur 4. Glass nål brukes for punktering blastomeres under ablasjonsprosedyren. Nålen vist her ble trukket på en Sutter P97 nål avtrekker ved hjelp av et program med parametere 2 x (varme = 566, trekk = 100, hastighet = 20, gang = 250) + 1 x (varme = 566, trekk = 100, hastighet = 100, tid = 250). Andre instrumenter eller programmer kan anvendes for å trekke nålene som er egnet for ablasjon, så lenge de er av den samme generelle form som den som er vist her. Scale bar = 1 cm.
Figur 5. Vurdere resultatene av blastomere enblation under embryogenesen. (A) Gonadebeskyttelse regionen i en vill type scene S29 embryo kort tid før klekking, som viser kjønnsceller merket med anti-Vasa farging (pilspisser). Den anti-Vasa antistoff som brukes her er spesifikt for P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes og Extavour, upubliserte data). (B) Gonadebeskyttelse regionen i en scene S29 embryo som hadde g blastomere fjernet ved åtte-cellers stadiet, viser fravær av kjønnsceller som åpenbart av fravær av spesifikke anti-Vasa signal i gonade region (pilspisser). Scale bar i (A) = 100 mikrometer og gjelder også for (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Ablasjon runde | # Ablateres | # (%) Overlevdetil 50% utvikling | # (%) Overlevde til 90-100% utvikling |
| 1 | 49 | 41 (83,7) | 6 (12,2) |
| 2 | 48 | 46 (95,8) | 17 (35,4) |
| 3 | 31 | 25 (80,6) | 22 (71,0) |
| 4 | 97 | 72 (74,2) | 56 (57,7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60.2) |
| 6 | 50 | 36 (72,0) | 37 (74.0) |
| TOTAL | 383 | 320 (83.6) | 203 (53.0) |
Tabell 1. Representant ablasjon overlevelsestatistikk. Etter micromere ablasjon, ble overlevelse scoret både innen de første 50% av utvikling (5-6 dager ved 25 º C) og deretter på 90-100% utvikling (10-12 dager ved 25 º C). Ablasjon runder 1-6 er representative eksempler på eksperimenter utført av en enkelt forsker (AR Nast) i kronologisk rekkefølge i løpet av en åtte måneders periode. Forskere skal finne det, som vist her, overlevelse til 90-100% utvikling øker med erfaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en protokoll for manuell ablasjon og fullstendig fysisk fjerning av enkelt blastomeres fra tidlige cleavage stadier av amfi P. hawaiensis. Vi demonstrere bruken av denne protokollen ved å fjerne én bakterie linjen forløper celle g fra en åtte-cellers stadiet embryo, og vise at ablasjon har vært vellykket ved å bekrefte fravær av g 's datter celler i senere embryogenese. Denne protokollen kan brukes for å fjerne en hvilken som helst av de micromeres fra embryo på tidlige stadier spaltningsseter. For å bruke denne protokollen for å fjerne macromeres på dette stadiet, eller blastomeres på første eller andre cleavage stadier, kan brukerne bare bruke de små endringer for å skape en litt større hull i chorion på trinn 4.4, og bruke press og sug for en lengre tid for å fjerne større volum av celleinnholdet i trinn 4.6. Vi har funnet at etter bruk av denne protokollen, er un utvikling av de gjenværende blastomeres etter ablasjonpåvirkes med hensyn til spalt-ningscellen og bevegelsesmønstre i det minste frem til tidspunktet for gastrulation 23..
Denne protokollen kan være nyttig for videre gransking av utviklingspotensialet av tidlige cleavage blastomeres i denne amfipode. Mange spørsmål gjenstår å bli besvart i dette området, blant annet hvorfor noen celler, men ikke andre kan endre skjebner å erstatte de av ablasjon blastomeres, og presis timing og mekanismer av disse regulative endringene. Protokollen kan også modifiseres for å imøtekomme ablasjon av flere enn en celle, ved å gjenta trinn 4.2 til 4.7 suksessivt på blastomeres av interesse.
Det er viktig å bruke en høykvalitets stereo med riktig belysning for å vise og korrekt identifisere tidlige cleavage blastomeres. Vi finner at lateral hendelsen hvitt lys fra en fiberoptisk kald lyskilde er de mest nyttige for dette formål. Innfallende lyset rett over specimno skaper refleksjoner som kan tilsløre de cellulære morfologi og grenser, mens overført lys ikke klarer å trenge gjennom den tette eggeplomme av embryoene og blastomeres er derfor vanskelig å skille. Det er mest nyttig for urglass eller petriskål inneholder embryoer som skal plasseres på en svart overflate snarere enn en hvit eller gjennomsiktig glass overflate, da dette gir best mulig kontrast til den bleke embryoer.
En begrensning til denne protokollen er at den blastomere av interesse må være riktig og entydig identifisert før du begynner. Photoablation teknikker ville være mer nyttig for forskere New til systemet, siden embryoene kan overlates til å utvikle et par spaltningssetene sykluser etter injeksjon av det fluorescerende fargestoff 28, og identiteten av den injiserte blastomere bekreftet etter injeksjon, men før Photoablation, ved å analysere mønsteret i den cellulære etterkommere, som er godt beskrevet i tidligere cellelinjenalder analyserer 6,23. Når forskere er kjent med P. hawaiensis embryo og kan identifisere alle blastomeres med trygghet kan den manuelle ablasjon som er beskrevet her kan brukes for anvendelser hvor fullstendig fysisk fjerning av en blastomere, i stedet for å drepe cellen uten å fjerne døde celler kroppen fra embryo, er ønskelig.
Denne fremgangsmåten kan i prinsippet brukes til å fjerne enkelt blastomeres fra cleavage scene embryo av andre holoblastically spaltingsprober krepsdyr, eller andre marine eller ferskvannsløse hvis chorions eller befruktnings membraner kan ikke være lett å fjerne. Modifikasjoner kan omfatte bruk av inkubering medier med passende saltinnhold karakteristika, og å modifisere formen på nålen for å få plass til mer ømfintlige membraner (lengre, tynnere nåler) eller mer robuste embryonale belegg (kortere, hurtig avsmalnende nåler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Rayhan Arif og Hassaan Shahawy for kamera arbeid, Tripti Gupta og Frederike Alwes for assistanse avgrense cellen ablasjon teknikk, og Extavour lab medlemmer for tilbakemelding på data, video og manuskript. Dette arbeidet ble delvis støttet av Harvard Stem Cell Institute (Seed Grant nummer SG-0057-10-00) Ellison Medical Foundation (New Scholar Award nummer AG-NS-07010-10) til CGE, og Harvard College Research Program utmerkelser til ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
