Summary
혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.
Abstract
성상 세포종, 성상 세포종의 가장 일반적이고 공격적인 형태는 치료에 내화되고, 분자적으로 이질성입니다. 부모 종양의 게놈 프로파일을 보존하는 세포 배양을 확립하는 능력은, 시험관 내 및 생체 내 모델에서 환자특이적 에서 사용하기 위해 각 종양의 분자 특성에 맞는 교모세포종에 대한 새로운 치료법의 전임상 개발에 혁명을 일으킬 가능성이 있다.
단일 세포로 해리된 신선한 고원성 세포종 종양을 시작으로 신경줄기 세포 마커의 발현, 장기자가 재생, 직교 형 이종 종양 형성 능력을 포함하여 암 줄기 세포 표현형을 제시하는 세포를 위한 농축 방법으로 신경권 분석법을 사용합니다. 이 방법은 이전에 제안되었으며 현재 여러 구도자가 사용하고 있습니다. 125개의 교모세포종 표본을 해리하고 배양한 경험을 바탕으로, 우리는 상급 성구 세포종의 일상적인 신경구 배양과 전임상 연구를 위한 종양 성 세포의 대규모 확장에 적합한 상세한 프로토콜에 도착했습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 성공적인 장기 배양의 효율성을 보고하고 신경구로 성장하지 못하는 해리된 교모세포종 세포를 배양하기위한 저렴한 대안을 제안합니다. 우리는 또한 면역 작용화학을 위한 신경구 3D 아키텍처를 보존하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다. GBM의 분자 서명과 이질성을 보존하는 직교 식 이종 이식 모델을 생성 할 수있는 CSC에서 농축 된 세포 배양은 GBM의 생물학 연구와 잠재적 인 치료법의 전임상 테스트의 개선 된 설계에 대한 점점 더 인기를 끌고 있습니다.
Introduction
교모세포종 (GBM), WHO 등급 IV 성상 세포종, 가장 널리 퍼지고 공격적인 1 차적인 뇌종양입니다. 다양한 발달 표현형은 GBM 종양 세포에 의해 채택되며, 신경 줄기 세포(NSC) 마커의 발현, 장기 자가 갱신 및 성상체 마커를 발현하고 종양1-3의대량을 형성하는 보다 분화된 세포를 초래할 수 있는 가능성과 같은 "암 줄기 세포"(CSC) 특성을 나타내는 세포를 포함하여 채택된다. CSC 분자 정체성 및 임상 적 영향에 대한 설명이 여전히 필요하지만, 현재 작업의 초점은 CSC의 운영 정의에 있습니다 : 시험관내 장기 자체 갱신 및 면역 손상 설치류의 직교 이식시 원래 종양을 분화하고 재현할 수있는 능력.
교모세포종 세포는 10% 태아소 혈청(FBS)을 함유하고 있으며, 여러 고항로가시적으로 이용 가능한 혈청 배양된 혈청 세포주가 면역절량 설치류에서 종양성이지만, 원래 종양4로부터상당한 게놈 및 분자 발산이 있어 임상적으로 관련 모델로서 의사용을 제한하고 있다. 최근에는 EGF 및 bFGF에 반응하는 줄기/선조 표현형을 가진 세포가 GBM2에서확인되었다. 이어서, 해리된 GBM 종양 샘플은 세럼이 없는 배지3에서배양되었고, 원래 는 성인 포유류 뇌로부터 신경 줄기 세포의 선택 및 확장을 위해 제조되었다5. 이러한 배양 조건은 대부분의 비신가소 및 보다 분화된 종양 세포 집단의 성장을 저해하는 한편, 줄기 및 전구 세포의 성장을 부유하는 다세포 구형 구체 또는 신경구3로선호하면서 성인 포유류 신경줄기 세포의 동작을 모방한다5. 성장 인자(NMGF)로 보충된 신경권 배지 또는 10% FBS로 보충된 전통적인 성장 배지에서 배양된 1차 GBM 세포의 종합적인 나란히 비교, GBM 신경구는 종양성, 다중계 분화 잠재력을 제시하고, 원래 종양의 유전자형을 보존하고, 낮은 통로에서 종양생성이 아닌 10% FBS배양과 는 대조적으로, 4후반에 본래 종양과 상당히 갈라졌다는 것을 밝혔다.
CSC마커 CD133의 발현에 기초하여 세포 분류에 의한 GBM 종양으로부터의 CSC의 분리도6,7이제안되었지만, 추가 작업은 CSC 표현형이 이러한마커의발현과 결정적으로 연관되지 않음을 나타내며, 새로운 마커는 여전히10개의검사를 받고 있는 반면, 이러한 마커에 대한 초기 열정을 감소시키고 있다. CSC를 정의하는 검증된 마커 세트의 날짜에 사용할 수 없는 것은 전임상 연구를 위한 이러한 세포의 대규모 증폭을 목표로 하며 일상적인 CSC 농축 배양에 대해 셀 정렬의 사용을 비실용적입니다. NMGF에서 신경구로 성장하는 능력에 의해 선택된 GBM 세포는 변함없이 신경 줄기 세포 마커를 발현한다. 우리는 Sox2와 네신이 신경권 배양에서 유비쿼터스로 발현되는 것을 관찰했으며, CD133 단백질은 GBM 신경구의 하위 집합에 존재합니다 (미공개 된 데이터 및 참조11).
몇몇 실험실은 성장인자로보충된 혈청 없는 매체에서 효소 해리 및 배양의 동일한 일반적인 접근을 사용하여 교모세포종 종양에서 신경권 배양을 추구하고있으며,다른 동료들은 GBM 샘플에서 장기 신경권 배양을 성장시키려는 시도를 성공없이 보고하고 있다. 여기에 제시 된 고급 진종의 효소 해리 및 신경 권 문화에 대한 일반적인 방법은 위의 간행물에 설명 된 것과 유사하다. 우리는 100GBM 샘플을 해리하고 배양한 경험을 바탕으로 프로토콜을 최적화했습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 적용한 신선한 GBM 샘플로부터 장기 신경권 배양을 얻는 효율은 40% 이상이며, 효율성데이터3,15를나타내는 몇 가지 보고서와 유사하며, EGF 및 bFGF가 표면에 단층으로 코팅된 표면 17, 17의 단층으로 혈청 없는 배지에서 지속적으로 또는 간헐적으로 배양하는 것과 같은 대체 프로토콜의 탐구로이어진다. 신경권 배양은 여전히 GBM 종양의 분자 특성과 종양성 전위3,4,11-14를보존하기 위한 가장 검증되고 점점 더 대중적인 접근법이며, 따라서 우리의 접근 방식은 신경권 배양을 먼저 시도하는 한편, 장기간자가 갱신하는 신경구를 형성하지 못하는 GBM 세포를 배양하기 위한 대체 방법을 수반하는 한편(그림1)은동물학적 세포의 표현을 증가시킬 수 있다. 여기에서 우리는 GBM에서 신경구를 배양하기위한 프로토콜을 제시합니다. 신경구를 형성하는 데 실패한 세포의 경우, 우리는 비 신경권 형성 GBM에서 종양 성 세포를 배양하는 첫 번째 시도로 성장 배지에 간단한 수정을 보여주고 유망한 결과를 초래하고 여전히 광범위한 검증을 받고 있습니다.
Protocol
1. 신경권 배양을 위한 신선한 외과 교모세포종 견본에서 단세포 정지
- 환자의 서면 동의와 제도적 지침에 따라, 높은 등급의 신경교종의 절제 수술 직후 세포 배양을위한 종양 샘플을 수집합니다.
- 조직 병리학에 의한 종양 샘플의 진단을 확인합니다. 수술실에서 라미나르 유동 조직 배양 후드로 즉시 시편을 운반하여 수술로부터 1시간 이내에 처리합니다.
참고: 원격 부위의 수술의 경우 종양 샘플을 더 작은 조각으로 자르고 DMEM/F12가 들어 있는 튜브에 넣습니다(얼음 을 유지하십시오). 종양은 수술 후 몇 시간 후에 처리될 수 있습니다. - 200-500 mg의 조직(최적)으로 시작하여 메스 블레이드를 사용하여 종양 샘플을 다진 다음 10ml DMEM/F12 세럼 이없는 배지를 함유한 15ml 튜브로 전달합니다. 여러 번 반전하여 혼합하고, 종양 조각퇴적물을 중력에 의해 퇴적시키고, 매체를 제거하고, 필요에 따라 반복한다.
- 효소 조직 해리 솔루션을 준비하고 솔루션을 신선하게 중지하십시오.
- 효소 조직 해리 솔루션: 5 ml 0.05% 트립신-EDTA, 2.5 ml 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) 칼슘 및 마그네슘 프리, 2.5 ml 콜라게나제 IV 주식 솔루션 (칼슘과 마그네슘이있는 HBSS의 2,000 U /ml).
- 정지 용액: 5ml 트립신 억제제 용액, 5ml DMEM/F12, 5,000 U/ml DNAse I의 2 μl (HBSS 칼슘 및 마그네슘 프리).
- 매질의 제거및 효소 조직 해리용액을 다진 종양 샘플에 추가하여 각 0.5 g 조직에 대해 2 ml를 사용하십시오. 반전하여 부드럽게 섞습니다.
- 30분 동안 회전하에 조직 배양 배양인 37°C에서 용액으로 조직을 배양한다.
- 2ml 파이펫으로 삼중화하고 소화를 중지하거나 소화 수준에 따라 또 다른 15-30 분 배양을 위해 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 스톱 솔루션 2부와 5ml 세로지 피펫으로 기계적으로 세트리어트하여 소화를 중지합니다.
- 40 μm 세포 여과기를 통해 소화되지 않은 물질을 필터링합니다. 펠릿 은 800 x g에서 5 분 동안 방 온도에서 세포를 세척한 다음 10ml DMEM / F12에서 3 배 세척합니다.
- 5ml DMEM/F12에서 최종 셀 펠릿을 다시 중단합니다.
- 림프홀리트-M 5ml 이상 셀 서스펜션을 실온에서 20분 동안 1,300 x g에서 천천히 층으로 놓습니다.
- 핵세포를 함유하는 인터페이스 층을 DMEM/F12 10ml를 포함하는 15ml 튜브로 이송한다.
- 실온에서 5 분 동안 800 x g의 세포를 펠렛하십시오. DMEM/F12 2x로 세척을 반복합니다.
- Cryopreserve는 회수 세포 동결 매체에서 펠릿을 재중단하고, 극저온으로 알리싱하고, 느린 동결및 액체 질소에 저장하여 추가 사용을 위해 생성된 단일 세포를 보존합니다.
- 배양하기 위해, 성장인자(NMGF)로 보충된 신경권 배지에서 세포를 재중단시키고, 표준 조건하에서 일반 T25 조직 배양 플라스크에서 상대적으로 낮은 밀도(<1 x 105 세포/ml)에서 플레이트, 5% CO2,37°C, 가습조직 배양 배양 인큐베이터(그림1A).
- 다음 레시피를 사용하여 NMGF 준비
DMEM/F12 500ml용 스톡 솔루션 음량 최종 농도 N2 보충 (10 x) 5 ml 1x 250 mg/ml BSA 재고 솔루션 1 ml 0.5 mg/ml 겐타미신 시약 10 mg/ml 1.25 ml 25 μg/ml 항생제/항마이코틱 100x 2.5 ml 0.5배 100 mg/ml bFGF 0.1 ml 20 ng/ml 100 mg/ml EGF 0.1 ml 20 ng/ml
- 다음 레시피를 사용하여 NMGF 준비
- 1-3주 이상 형성되는 신경구(그림1B-E)를신선한 플라스크로 옮기고, 부착된 세포와 이물질로부터 분리한다. 3-4일마다 부분 미디어 변경을 수행합니다.
참고: 위의 프로토콜을 사용하여 직교 식 이종이 이식 종양을 해리하는 경우 1.11-1.13 단계는 생략 될 수 있습니다.
2. 교모세포종 신경권 배양 유지 및 다운스트림 응용 프로그램
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해리: 신경권 배양을 모니터링하고 3-4 일마다 부분 배지 변화를 수행합니다. 플라스크의 대부분의 다세포 신경구가 직경 100 μm에 도달하면 단일 세포 현탁액으로 해리하십시오.
- 신경구를 함유하는 배지를 15ml 튜브로 옮기고, 중력 퇴적물 신경구는 약 5분 동안, 배지를 제거하고 10ml 칼슘 및 마그네슘이 없는 DPBS에서 세포 펠릿을 재연한다.
- 세포가 중력에 의해 퇴적물됨에 따라 실온에서 10 분 동안 혼합하고 배양하십시오.
- DPBS 7-8 ml를 제거한 다음 미리 습식 된 혈청 피펫으로 신경 구체를 기계적으로 분리하십시오.
- 4°C에서 5분 동안 800 x g에서 해리된 세포를 펠릿합니다.
- 합격: NMGF에서 해리 된 세포 (단계 2.1.)를 다시 중단하고 필요한 플라스크 (1 :3)로 나누고 표준 조건하에서 배양합니다. 이차 신경구는 형성될 것이고, 나중에 고등 구체의 형성을 위해 해리되어야 합니다.
- 장기 자기 갱신 평가: 신경권 문화가 최소 10개의 구절을 달성할 때까지 해리 절차를 반복하여 최소 2개월의 배양에 해당합니다.
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동결: 신경구를 동결하기 위해 신경구(2.1단계)를 분리하고 회수 세포 동결 매체에서 세포 펠릿을 재보종하고, 극저온에서 알리코트, 느린 동결 및 액체 질소에 저장한다.
- 냉동 육수로부터 신경권 세포를 배양하기: 세포를 37°C에서 해동하고 10ml DMEM/F12를 포함하는 15ml 튜브로 즉시 이송한다. 튜브를 부드럽게 섞은 다음 세포를 800 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 회전시십시오. 세포 펠릿을 한 번 더 씻고 NMGF에서 세포를 재일시 중단하고 T25 조직 배양 플라스크로 옮겨.
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면역 손상 마우스에서 두개 내 임플란트에 대한 세포 현탁액:
- 신경구(2.1단계)를 분리하고 칼슘 과 마그네슘이 없는 DPBS에서 세포 펠릿을 재연한다. 혈전계 및 트라이판 블루 제외를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산합니다.
- 임플란트에 필요한 세포 수를 계산하고, 일반적으로 3 x 105 세포/마우스를 계산하고, 원하는 수의 세포를 유리병으로 옮기고, 1,000 x g의 세포를 펠릿한다.
- 마이크로센트심분리기 튜브를 부드럽게 눌러 임플란트(5 μl/마우스)에 적합한 부피로 세포 펠릿을 다시 분리합니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 놓고 2시간 이내에 사용하십시오.
3. 종양성 교모세포종 세포를 배양하기위한 대체 프로토콜 (신경권 문화가 실패하는 경우)
- 2% FBS/NMGF의 최종 농도에 태아 소 혈청으로 NMGF 배지를 보충합니다.
- NMGF 배양에서 세포로 시작 : NMGF플라스크(도 1F)에서생존 세포를 수확, 2 % FBS / NMGF 및 플레이트에서 상대적으로 낮은 밀도 (<1 x 105 세포 / ml) 일반 T25 조직 배양 플라스크및 표준 조건하에서 배양, 5 % CO2,37 °C, 습화 조직 배양(도 1G)에서의 습성 조직 배양.
- 냉동 되지 않은 배양 세포로 시작 (단계 1.14.): 세포를 해동, 혈청 없는 매체및 플레이트에서 세척 2% FBS/NMGF 및 배양 2% 단계 3.2에 설명 된 바와 같이. 실행 가능한 세포를 2% FBS/NMGF로 이송하기 전에 3일 동안 NMGF에서 배양하는 것은 분화 세포를 미리 선택하는 대안입니다.
4. 면역 화학에 의한 신경권의 형태학적 및 분자 분석
- 대부분의 떠다니는 다세포 구체가 직경 100μm에 도달할 때까지 신경구를 배양합니다.
- 인큐베이터에서 배양 플라스크를 제거하고 즉시 신경구를 펠릿, 중간을 제거하고 펠릿을 방해하지 않고 DPBS 10 ml를 추가합니다. DPBS를 제거하고, 10% 중성 버퍼링 된 포르말린으로 재연하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 펠릿 스페로이드, 30% 에탄올에서 재중단, 30-45 분 동안 인큐베이션.
- 에탄올30%를 50% 에탄올로 교체하고, 15분 동안 배양하고 신선한 50% 에탄올로 교체하고, 30분 더 배양합니다.
- 70%의 에탄올로 반복(4.4.)
- 95% 에탄올 2번의 변경으로 교체하고, 스페로이드가 밝은 흰색과 응축될 때까지 절대 에탄올로 반복합니다.
- 렌즈 용지에서 작은 필터 종이 콘을 만들고 비커에 작은 깔때기에 놓습니다. 절대 알코올로 렌즈 종이를 적시다.
- 신선한 100% 에탄올로 펠릿을 약간 풀어주고, 과도한 에탄올을 붓고 렌즈 종이 콘을 통해 스페로이드를 부어 콘 끝으로 이동하도록 합니다. 추가 절대 에탄올로 튜브를 헹구고 렌즈 종이 콘을 통해 남은 스페로이드를 붓습니다.
- 깔때기에서 종이 콘을 제거하고 조심스럽게 콘의 바닥으로 스페로이드를 이동합니다. 용지를 정사각형으로 접어서 스페로이드가 가능한 한 안전하게 동봉되어 있는지 확인합니다.
- 포장된 신경구를 카세트로 옮기고 자동 조직 프로세서로 옮김합니다.
- 절대 에탄올, 10분, 자일렌, 15분(2배), 파라핀, 10분(4배)
- 프로세서에서 카세트를 제거하고 파라핀 임베딩 시스템의 가열 된 부분에 놓습니다. 전체 표면이 파편, 먼지 또는 기타 파편이 없는지 확인하고 집게가 따뜻해지는 우물에서 모든 파라핀을 제거하십시오. 따뜻한 깨끗한 파라핀 프리 집게와 데운 베이스 몰드에 소량의 파라핀을 추가합니다.
- 카세트를 열고 패킷을 제거하고 포함 시스템의 가열 된 부분에 놓습니다. 스페로이드가 보일 때까지 종이 콘을 조심스럽게 엽니다. 예온된 집게로 가능한 한 많은 재료를 모으고 베이스 몰드의 액체 파라핀으로 옮겨.
- 가능한 한 많은 스페로이드를 검색하려면 필요에 따라 반복합니다. 에탄올로 닦아낸 전철 면도날로 티슈 페이퍼를 부드럽게 긁어 내고, 용지를 블록에 넣지 않고 잔류 스페로이드를 수집합니다.
- 스페로이드 덩어리를 따뜻한 집게로 조심스럽게 분해합니다. 스페로이드를 모서리에서 분리된 중앙 레이어로 이동합니다. 베이스 몰드를 냉각 영역으로 이동하여 스페로이드를 제자리에 고정하고, 카세트를 추가하고, 파라핀으로 천천히 채우고, 철저히 식힙니다.
- 신경구 파라핀 블록은 정상적인 단면화 및 면역 히스토케화학에 사용될 수 있다.
Representative Results
당사는 상술 및 배양(125)의 신선한 수술 교모세포종표본(그림 1),88개의 새로 진단된 및 37개의 재발성 종양(표2)을승인된 환자 동의 및 제도적 지침에 따라 적용했습니다. 장기 신경권 배양확립을 위한 프로토콜의 효율은 41.6%였으며, 새로 진단된 종양 및 재발성종양(표 2)과유사하였다. 일부 GBM 샘플의 경우, 신경구는 처음며칠(그림 1B 및 1C)에형성되며, 다른 경우에는 더 긴 배양 시간이필요합니다(그림 1D 및 1E).
신경권 형성의 효율은 조직 내 괴사의 수준에만 의존하지 않았으며, 새로 진단된 종양에서 높은 세포 밀도(GBM1)와 프로토콜 1 및 2에 따라 처리된 재발성 및 괴사종양(GBM2)의 결과에 의해 예시된 바와 같이, 둘 다 신경권 배양(도2)을산출하였다.
면역 절인 마우스에서 각 신경권 배양의 종양 성 잠재력을 테스트하는 것은 CSC의 농축을 위한 이 접근법의 결정적인 검증입니다. 이전에 설명된18,GBM1 및 GBM2 신경구와 유사한 프로토콜을 사용하여 IAC 및 IACUC 동물 관리 지침에 따라 면역 손상된 마우스의 뇌에 이식되었다. 이 종이식 종양은 뇌 가상증 및 괴사(그림 2)로의 침입과 같은GBM의 형태학적 특성을 제시한다.
GBM3는해리(도 1A)를분리하고 신경권 배지(그림1D 및 1E)에서배양되었으며, 2% FBS/NMGF(그림1D, 1G 및 1H)에서배양되었다. NMGF에서 배양된 2% FBS/NMGF 및 신경권 세포에서 배양된 단층 세포는 도 2와동일한 절차를 사용하여 누드 마우스에 이식되고 동일한 수의 세포를 이식하였다. 생존, 종양 성장 역학 또는 형태학의 차이는 두 개의 사전 임플란트 배양방법(그림 3A-C)사이에서관찰되었다. 종양 성장 특성은 시험된 최신 통로, 신경구를 위한 P20 및 2% FBS/NMGF를 위한 P10까지 변경되지 않습니다. Sox2를 포함한 신경 줄기 세포 마커는 10% FBS 3,4,11로배양된 대부분의 1차 GBM 세포에서 다운규제되고 있지만, NMGF는 2% FBS로 보충되어 Sox2 발현(도3D)의보존을 허용한다.
신경구는 프로토콜 4에 따라 처리되었고, H&E(도 4A),항삭스2 항체로 표시되어 핵국소화(도4B)및 EGFR 항체, 세포막 국소화(도4C)를나타냈다. 이 프로토콜은 네신, GFAP 및 증식 마커 Ki6711의발현에서 자극 의존적 변경에 접근하기 위해 적용되었다.
표 2. GBM에서 장기적인 자기 갱신 신경권 배양을 유도하는 효율성.
| 병리학 | n | 장기 자가 갱신 신경구를 산출하는 샘플의 비율 (n) |
| 교모 세포종 - 치료되지 않은 첫 번째 수술 | 88 | 42.0% (37) |
| 교모세포종 - 재발 | 37 | 40.5% (15) |
| 합계 | 125 | 41.6% (52) |
그림 1. 신선한 교모세포종 수술 시편에서 세포 배양. 신선한 종양은 효소적으로 단일 세포로 해리됩니다. 밀도 분리 배지로부터핵세포 인터페이스는 그 후 NMGF에서 도금된다. 해리된 신경구는 NMGF에서 도금되고, 일반적으로 도금 후 1일 동안 죽은 세포, 파편, 부착된 단일세포 및 현탁액(A)에서 간헐적으로 분할되는 세포가 있다. 신경구 형성은 어떤 경우에는 더 빠릅니다(B,C),그리고 다른 사람에 대 한 느린(D,E). 모든 신경구는 적어도 10개의 통로를 위해 해리되고 보충되고, 41.6% GBM은 장기 자기 갱신 신경구를 산출합니다. 신경구(F)로 성장하지 못하는 실행 가능한 GBM해리세포는 대체 배양 조건, 예를 들어 2% FBS/NMGF(G,H)로 이송될 수 있다. 바(A),100 μm은 모든 이미지에 적용됩니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. GBM 종양에서 신경권 생성 및 치열 류 마우스 제노 이식. 고세포 밀도(GBM1)와 높은 괴사 함량(GBM2)을 가진 종양을 제시하는 종양 샘플은 프로토콜 1 및 2에 따라 10개의 구절을 배양하여 해리및 신경구를 배양하였다. 면역 손상된 마우스는 3 x 105 해리된 신경권 세포로 이식되고 moribund 때 희생하였다. 마우스 뇌는 인간 마커, 인간 미토콘드리아(hMit) 또는 주요 조직적합성 클래스 I 서브유닛 HLA-A(MHC-I)의 H&E 염색 및 면역조직화학 검출을 위해 파라핀 고정 및 파라핀을 포함하였다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. NMGF에서 신경구로 배양된 GBM3 세포와 함께 자궁내 이식된 마우스의 유사한 종양 성장 또는 2% FBS/NMGF에서 단층층으로 배양된다. (A)2%FBS/NMGF(두 통로 <10)에서 NMGF 또는 단층층으로 배양된 GBM3에 대한 카플란 마이어 생존 곡선은 생존(n=10, p=0.7174, 로그 랭크 테스트)에 차이가 없음을 나타낸다. (B)살아있는 생물발광 이미징(BLI)에 의해 모니터링되는 종양 성장은 두 그룹 간의 종양 성장 역학에 유의한 차이를 나타내지 않는다. (C)종양 형태는 4GBM3 이종이이식, NMGF에서 배양된 2개, FBS/NMGF 2%로 배양된 2개에 대해 구별할 수 없다. 그림 2에대해 설명된 바와 같이 MHC-I 얼룩. 스케일, 600 μm. (D)줄기세포 제조사 Sox2 발현을 나타내는 서양블롯은 제노이식종양(A-C)을개시하는 데 사용되는 2%의 FBS/NMGF 배양에 유지된다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 면역히스토케에 의한 신경권 섹션에서 단백질 발현의 분석. 신경권 배양은 프로시저 4에 기재된 바와 같이 포르말린 고정 및 파라핀을 삽입하고, H&E(A),항삭스2항체(B),및 항EGFR항체(C)로염색하였다. DAB 기판은시각화(B,C)를시각화하는 데 사용되었다. 바, 20 μm. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
적절한 효소 종양 세포 해리는 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 조직은 37°C의 회전 하에서 세포 해리용액의 배양 전에 잘 절단되어야 하며, 최소 30분 동안, 조직이 기계적으로 삼각화되어야 하고 해리의 연장이 검증되어야 한다. 조직 응집력의 정도에 따라, 배양을 추가로 연장할 수 있습니다 15-30 분, 단일 세포로 해리를 완료 하는 데 필요한. 1시간 이상 해리 용액의 배양은 세포 생존가능성이 저하되어 권장되지 않는다. 시작 조직의 최적 양은 200-500 mg이지만,이 프로토콜은 종양 조직의 50 mg의 작은에서 성공적인 신경 권 배양으로 이어졌습니다.
혈청이 없는 NMGF는 선택적 배지이며, 종양의 대부분을 포함하는 신플라스틱 세포의 백분율뿐만 아니라 숙주 세포는 생존되지 않을 것이며, 다른 세포는 도금 후 플라스크처리된 조직 배양에 부착될 것이다. 1-3주 이상 형성될 신경구(그림1B-E)는분화된 종양 세포및 이물질과 분리하기 위해 신선한 플라스크로 옮겨지는 것이 중요합니다.
GBM 세포는 신경권 배양에 실패할 경우, 효소적으로 해리되고 배양되지 않은(step 1.10)을 대체 매체에서 배양하는 세포의 백업 원천으로서 냉동 보존될 수 있다. 우리는 성공적으로 2 % FBS / NMGF에서 성장하는 단층 세포뿐만 아니라 이러한 냉동 주식에서 신경 권 배양을 얻었다.
개념적으로, "암 줄기 세포"는 진행 중인 작업이며, 이러한 신흥 분야는 임상적 영향이 상당하기 때문에, 특히 종양 이질성, 가소성 및 치료에 대한 내성19,20에대한 내성에서 상당한 영향을 미치기 때문에 추가적인 해명에서 유익할 것이다. 환자 별 GBM 동물 모델을 생성하는 데 중요한 것 외에도, 신경권 배양은 성장 인자, 저산소증 및 약리학제(11,21)에반응하여 세포 신호 및 유전자 발현의 변경과 같은 체외 연구에도 유용하다. 우리는 포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 신경권의 단면을 사용하여 3D 아키텍처를 보존하고, 면역 조직화학(11)에의한 단백질 발현 및 번역 후 변형을 연구하기로 결정했습니다.
성인 포유류 뇌에서 유래된 신경구 내의 모든 세포가줄기세포(22)인것은 아니라는 것이 나타났다. 유사하게, GBM 종양으로부터 배양된 신경구는 복제되지 않을 가능성이 있으며, 이는 더 분화된 암 전구 세포 및 자가 응집의 존재로 인해, 높은 세포밀도(23)에서발생하는 것으로 알려져 있으며, 이는 이 방법의 한계로 간주된다. 신경권(22)으로일시적으로 성장할 수 있는 전월체와 는 달리, 장기자가 자가갱신줄기세포를 농축하는 것을 선호하기 위해, 1차 신경구는 이차 신경구 형성을 위해 해리되고, 줄기세포에서인구가 풍부해지는 2개월에 해당하는 10개의 구절을 더 통과한다. 우리의 경험에서, 그 표시를 달성하는 GBM 신경권 문화는 신경구로 무기한 확장될 수 있습니다. 종양 등급은 우리가 GBM과 아나플라스틱 성체 세포종에서 성공적인 배양을 얻었기 때문에, WHO 등급 IV와 III, 각각, 그러나 낮은 학년 진모에서.
교모 세포종을 배양하는 가장 널리 퍼진 방법은, 10% FBS로 보충된 전통적인 성장 배지에서, 본래 종양 4에서상당한 게놈 및 현상변 발산으로 이끌어 냅니다. 한편, 신경권 배양은 암줄기세포 표현형4를제시하는 세포의 안정적이고 장기적인 공급원이다. 신경권 방법은 이 방법의 주요 약점을 나타내는 모든 고급 성상세포종 샘플에 성공하지 못했음에도 불구하고, 치열 류 마우스 이종이식 모델에 대한 장기 배양에서 CSC의 농축에 대한 점점 더 인기를 끌고있다. 부모 종양의 분자 특성이 신경권 형성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 연구가 진행중입니다. "omics" 정보의 접근성과 잠재적 표적 치료의 증가에 힘입어 개인화된 의학의 시대로 발전함에 따라 환자 특정 GBM 모델을 갖는 중대한 이점을 감안할 때, 고급 진교를 배양하는 실용적인 대체 방법의 탐구가 부여됩니다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 헤르멜린 뇌종양 센터, 헨리 포드 병원에 의해 투자되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
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