Summary
פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.
Abstract
Glioblastomas, הצורה הנפוצה והאגרסיבית ביותר של אסטרוציטומה, הם עקשן לטיפול, והטרוגני מולקולרית. היכולת להקים תרביות תאים המשמרות את הפרופיל הגנומי של גידולי ההורים, לשימוש במודלים ספציפיים למטופל במבחנה וב-vivo, יש פוטנציאל לחולל מהפכה בהתפתחות הפרה-קולינית של טיפולים חדשים לגלובלסטומה המותאמים למאפיינים המולקולריים של כל גידול.
החל מגידולי אסטרוציטומה טריים בדרגה גבוהה המנותקים לתאים בודדים, אנו משתמשים במדורה הנוירוספרית כשיטת העשרה לתאים המציגים פנוטיפ של תאי גזע סרטניים, כולל ביטוי של סמני תאי גזע עצביים, חידוש עצמי ארוך טווח במבחנה, והיכולת ליצור גידולים אורתוטופיים קסנוגרפט. שיטה זו הוצעה בעבר, וכעת היא נמצאת בשימוש על ידי מספר חוקרים. בהתבסס על הניסיון שלנו של ניתוק ו culturing 125 דגימות גליובלסטומה, הגענו לפרוטוקול המפורט שאנו מציגים כאן, מתאים פולחן נוירוספרה שגרתית של astrocytomas בדרגה גבוהה והתרחבות בקנה מידה גדול של תאים tumorigenic למחקרים פרה-קוליניים. אנו מדווחים על היעילות של תרבויות מוצלחות לטווח ארוך באמצעות פרוטוקול זה ומציעים חלופות סבירות עבור culturing תאי גליובלסטומה מנותקים שאינם מצליחים לגדול כמו נוירוספרות. אנו גם מתארים בפירוט פרוטוקול לשימור הארכיטקטורה הנוירוספרית בתלת-ממד לאימונוהיסטוכימיה. תרביות תאים מועשרות ב- CSCs, המסוגלות ליצור מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט המשמרים את החתימות המולקולריות וההטרוגניות של GBMs, הופכות פופולריות יותר ויותר לחקר הביולוגיה של GBMs ולעיצוב משופר של בדיקות פרה-קוליניות של טיפולים פוטנציאליים.
Introduction
גליובלסטומה (GBM), אסטרוציטומה בדרגה IV של ארגון המחשב העולמי, היא הגידול העיקרי הנפוץ והאגרסיבי ביותר במוח. פנוטיפים התפתחותיים מגוונים מאומצים על ידי תאים סרטניים GBM, כולל תאים המציגים "תא גזע סרטני" (CSC) מאפיינים, כגון הביטוי של תאי גזע עצביים (NSC) סמנים, התחדשות עצמית לטווח ארוך, ואת הפוטנציאל להוליד תאים מובחנים יותר להביע סמנים אסטרוציטיים ויוצרים את החלק הארי של הגידול1-3. בעוד הבהרה עדיין נדרשת לגבי זהות מולקולרית CSC והשלכות קליניות, המוקד של העבודה הנוכחית היא על ההגדרה התפעולית של CSC: התחדשות עצמית לטווח ארוך במבחנה ואת היכולת להבדיל ולשכפל את הגידול המקורי על השתלה אורתוטופית מכרסמים immunocompromised.
תאי גליובלסטומה כבר תרבית במשך עשרות שנים במדיום מסורתי המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) וכמה מעברים גבוהים זמינים מסחרית סרום קווי תאים GBM מתורבת הם tumorigenic במכרסמים immunocompromised, אבל יש הבדל גנומי ומולקולרי ניכר מן הגידול המקורי4, הגבלת השימוש בהם כמודלים רלוונטיים קלינית. לאחרונה, תאים עם פנוטיפ גזע / אב מגיב EGF ו bFGF זוהו GBMs2. לאחר מכן, דגימות גידול GBM מנותקות היו מתורבתות במדיום ללא סרום3, נוסחה במקור לבחירה והרחבת תאי גזע עצביים ממוחו של היונק הבוגר5. תנאי תרבות אלה לעכב את הצמיחה של רוב אוכלוסיות תאים סרטניים nonneoplastic ויותר מובחנים, תוך העדפת הצמיחה של תאי גזע ואביזרים כמו ספרואידים רב תאיים צפים, או נוירוספרות3, מחקה את ההתנהגות של תאי גזע עצביים יונקים בוגרים5. השוואה מקיפה זה לצד זה של תאי GBM ראשוניים בתרבית בינונית נוירוספרית בתוספת גורמי גדילה (NMGF) או במדיום הצמיחה המסורתי בתוספת 10% FBS, גילה כי neurospheres GBM היו tumorigenic, הציג פוטנציאל בידול רב לשוני, ושימר את הגנוטיפ של הגידול המקורי, בניגוד 10% תרבויות FBS אשר לא היו tumorigenic במעברים נמוכים במידה ניכרת סטה מן הגידולים המקוריים במעברים מאוחרים4.
בידוד של CSC מגידולים GBM מנותקים על ידי מיון תאים בהתבסס על הביטוי של סמן CSC putative CD133 הוצע גם 6,7, אבל עבודה נוספת הצביעה עלכךפנוטיפ CSC אינו קשור באופן סופי עם הביטוי של סמנים כאלה8-10, הפחתת ההתלהבות הראשונית עבור אסטרטגיה זו, ואילו סמנים חדשים עדיין נבדקים10. חוסר הזמינות עד כה של קבוצה מאומתת של סמנים המגדירים CSC, יחד עם המטרה של הגברה בקנה מידה גדול של תאים אלה למחקרים פרה-קוליניים, הופך את השימוש במיון תאים לבלתי מעשי עבור תרבויות שגרתיות המועשרות ב- CSC. תאי GBM שנבחרו על ידי היכולת לגדול כנוירוספרות ב- NMGF מבטאים תמיד סמני תאי גזע עצביים. ראינו כי Sox2 ו nestin באים לידי ביטוי בכל מקום בתרבויות נוירוספרה, בעוד חלבון CD133 קיים בקבוצת משנה של נוירוספרות GBM (נתונים שלא פורסמו התייחסות11).
מספר מעבדות רודפות אחר תרבויות נוירוספריות מגידולי גליובלסטומה באמצעות אותה גישה כללית של דיסוציאציה אנזימטית ופולחן במדיום ללא סרום בתוספת גורמיגדילה 3,4,11-14, בעוד עמיתים אחרים דיווחו על ניסיונות לגדל תרבויות נוירוספריות לטווח ארוך מדגימות GBM ללא הצלחה . השיטה הכללית לדיסוציאציה אנזימטית ותרבות נוירוספרית של גליומות בדרגה גבוהה המוצגות כאן דומה למה שתואר בפרסומים לעיל. אופטימיזציה של הפרוטוקול מבוסס על הניסיון שלנו של ניתוק ו culturing מעל 100 GBM דגימות. היעילות של קבלתתרבויותנוירוספריות לטווח ארוך מדגימות GBM טריות החלת הפרוטוקול המוצג כאן הוא מעל 40%, בדומה לדיווחים המעטים המראים נתוני יעילות 3,15, המוביל לחקירה של פרוטוקולים חלופיים כגון תאים culturing ללא הרף או לסירוגין במדיום ללא סרום בנוכחות EGF ו bFGF כמו monolayers על משטחים מצופים חלבון ECM16,17. תרבויות נוירוספרה הם עדיין הגישה המאומתת והפופולרית יותרויותרכדי לשמר גידולים GBM מאפיינים מולקולריים ופוטנציאל tumorigenic 3,4,11-14, ולכן הגישה שלנו היא לנסות תרבויות נוירוספרות הראשון, תוך בדיקה זמנית של שיטות חלופיות ליצירת תאי GBM שאינם מצליחים ליצור נוירוספרות מתחדשות-עצמית לטווח ארוך ( איור 1 ), כדי להגדיל את הייצוג של גידולים GBM שניתן להשתמש בהם במודלים של בעליחיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לתיכנות נוירוספרות מ- GBMs. עבור תאים שאינם מצליחים ליצור נוירוספרות, אנו מראים שינוי פשוט במדיום הצמיחה, כניסיון הראשון לתרבות תאים tumorigenic מן nonneurosphere להרכיב GBMs, עם תוצאות מבטיחות ועדיין עובר אימות נרחב.
Protocol
1. השעיית תא יחיד מדגם גליובלסטומה כירורגי טרי לתרבות נוירוספרה
- בהסכמה בכתב מהחולים ובהתאם להנחיות המוסדיות, לאסוף דגימות גידול לתרבות התא מיד לאחר ניתוח כריתה של גליומה בדרגה גבוהה.
- לאשר אבחנה של דגימת גידול על ידי היסטופתולוגיה. מיד להעביר את הדגימה מחדר הניתוח למכסה המנוע של רקמת זרימה למינאר, לעיבוד בתוך 1 שעה מניתוח.
הערה: עבור ניתוחים באתר מרוחק, לחתוך את דגימת הגידול לתוך שברים קטנים יותר ומניחים לתוך צינור המכיל DMEM / F12 (לשמור על הקרח). הגידול יכול להיות מעובד מספר שעות לאחר הניתוח. - החל 200-500 מ"ג של רקמה (אופטימלי), טחון את דגימת הגידול באמצעות להב אזמל, ולהעביר צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר DMEM / F12 בינוני ללא סרום. מערבבים על ידי היפוך מספר פעמים, לתת את חתיכות הגידול משקעים על ידי כוח הכבידה, להסיר בינוני, ולחזור לפי הצורך.
- הכינו את פתרון ניתוק הרקמות האנזימטי והפסיקו את הפתרון טרי.
- פתרון דיסוציאציה של רקמות אנזימטיות: 5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA, 2.5 מ"ל פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) ללא סידן ומגנזיום, 2.5 מ"ל קולאזנאז IV פתרון מלאי (2,000 U/ml ב- HBSS עם סידן ומגנזיום).
- עצור פתרון: 5 מ"ל טריפסין מעכב פתרון, 5 מיליליטר DMEM / F12, 2 מיקרוליטר של 5,000 U / ml DNAse אני (עשה HBSS סידן ומגנזיום חינם).
- הסר בינוני ולהוסיף פתרון דיסוציאציה של רקמות אנזימטיות לדגימת הגידול הטחון, באמצעות 2 מ"ל עבור כל רקמה 0.5 גרם. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
- דגירה הרקמה בתמיסה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמה תחת סיבוב במשך 30 דקות.
- טריטוראט עם פיפטה 2 מ"ל ולהפסיק את העיכול או לחזור לאינקובטור עוד 15-30 דקות דגירה בהתאם לרמת העיכול.
- להפסיק את העיכול על ידי הוספת 2 כרכים של פתרון עצירה triturate מכני עם פיפטה סרולוגית 5 מ"ל.
- לסנן את החומר מעוכל באמצעות מסננת תאים 40 מיקרומטר. גלולה התאים ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו לשטוף 3x ב 10 מיליליטר DMEM / F12.
- Resuspend גלולת התא הסופי ב 5 מיליליטר DMEM / F12.
- לאט שכבת התא השעיה מעל 5 מ"ל של לימפולייט-M ו גלולה ב 1,300 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- העבר את שכבת הממשק המכילה את התאים הגרעיניים לצינור של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של DMEM/F12.
- גלולה התאים ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הכביסה עם DMEM/F12 פי 2 יותר.
- Cryopreserve תאים בודדים וכתוצאה מכך לשימוש נוסף על ידי שימוש חוזר גלולה בינונית הקפאת תא התאוששות, aliquoting לתוך cryovials, הקפאה איטית, ואחסון חנקן נוזלי.
- לתרבות, השוהים מחדש את התאים במדיום נוירוספרה בתוספת גורמי גדילה (NMGF), וצלחת בצפיפות נמוכה יחסית (<1 x 105 תאים / מיליליטר) בבקבוקון תרבית רקמת T25 רגיל בתנאים סטנדרטיים, 5% CO2, 37 °C (37 °F), חממת תרבית רקמות לחה (איור 1A).
- הכן NMGF באמצעות המתכון הבא
עבור 500 מ"ל של DMEM/F12 פתרון מלאי נפח ריכוז סופי תוספת N2 (10x) 5 מ"ל פי 1 250 מ"ג / מ"ל BSA פתרון מלאי 1 מ"ל 0.5 מ"ג/מ"ל 10 מ"ג /מ"ל גנטמיצין מגיב 1.25 מ"ל 25 מיקרוגרם/מ"ל 100x אנטיביוטי/אנטי-מיקוטי 2.5 מ"ל פי 0.5 100 מ"ג/מ"ל bFGF 0.1 מ"ל 20 ננוגרם/מ"ל 100 מ"ג/מ"ל EGF 0.1 מ"ל 20 ננוגרם/מ"ל
- הכן NMGF באמצעות המתכון הבא
- העבר נוירוספרות היוצרות מעל 1-3 שבועות (איורים 1B-E) לבקבוקים טריים, כדי להיפרד מתאים מחוברים ופסולת. בצע שינויי מדיה חלקיים כל 3-4 ימים.
הערה: אם ניתוק גידול קסנוגרפט אורתוטופי באמצעות הפרוטוקול לעיל, שלבים 1.11-1.13 ניתן להשמיט.
2. גליובלסטומה נוירוספרה תרבות תחזוקה ויישומים במורד הזרם
-
דיסוציאציה: לפקח על תרבויות נוירוספרה ולבצע שינויים בינוניים חלקיים כל 3-4 ימים. כאשר רוב הנוירוספרות הרב-תאיות בבקבוק מגיעות לקוטר של 100 מיקרומטר, ניתוק להשעיית תא בודד:
- מעבירים את המדיום המכיל את הנוירוספרות לצינור של 15 מ"ל, משקעי כבידה הנוירוספרות במשך כ -5 דקות, מסירים את המדיום ומחדשים את גלולת התא ב- DPBS ללא סידן ומגנזיום של 10 מ"ל.
- מערבבים ומדגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, כמו משקעים התאים על ידי כוח הכבידה.
- הסר 7-8 מ"ל של DPBS ולאחר מכן לנתק את הנוירוספרות מכנית עם פיפטה סרולוגית prewetted.
- גלולה התאים מנותקים ב 800 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- Passaging: Resuspend התאים מנותקים (שלב 2.1.) ב NMGF ולחלק למספר הדרוש של בקבוקונים (1:3), ולהדגיר בתנאים סטנדרטיים. נוירוספרות משניות ייווצרו, ויש לנתק אותן לאחר מכן להיווצרות ספירות שלישוניות.
- הערכת התחדשות עצמית לטווח ארוך: חזור על הליך הדיסוציאציה עד שהתרבות הנוירוספרית תשיג לפחות 10 קטעים, שווה ערך למינימום של חודשיים בתרבות.
-
הקפאה: כדי cryopreserve את neurospheres, לנתק את neurospheres (שלב 2.1.) ולהזרים מחדש את גלולת התא בינוני הקפאת תא התאוששות, aliquot cryovials, להקפיא איטי, ולאחסן חנקן נוזלי.
- כדי תרבות תאים נוירוספריים ממלאי קפוא: להפשיר את התאים ב 37 °C (77 °F) ומיד להעביר צינור 15 מ"ל המכיל 10 מיליליטר DMEM / F12. מערבבים את הצינור בעדינות ולאחר מכן לסובב את התאים ב 800 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את גלולת התא עוד פעם אחת ו resuspend התאים NMGF ולהעביר בקבוק תרבות רקמה T25.
-
השעיית תאים עבור שתל תוך נדרי בעכבר immunocompromised:
- ניתוק הנוירוספרות (שלב 2.1) והתחדשו בכדור התא ב-DPBS נטול סידן ומגנזיום. לספור תאים קיימא באמצעות hemocytometer ו טריפאן הדרה כחולה.
- לחשב את מספר התאים הדרושים להשתלה, בדרך כלל 3 x 105 תאים / עכבר, להעביר את מספר התאים הרצוי לתוך בקבוקון, גלולה התאים ב 1,000 x g.
- השהה מחדש את גלולת התא בנפח המתאים לשתל (5 מיקרול / עכבר) על ידי הקשה עדינה על צינור microcentrifuge. מניחים את המתלה התא על קרח ולהשתמש בתוך 2 שעות.
3. פרוטוקול חלופי עבור Culturing Tumorigenic גליובלסטומה תאים (במקרים שבהם התרבות הנוירוספרית נכשלת)
- להשלים את המדיום NMGF עם סרום שור עוברי לריכוז הסופי של 2% FBS / NMGF.
- החל מתאים בתרבות NMGF: קציר תאים קיימא מבקבוק NMGF(איור 1F),resuspend ב 2% FBS / NMGF וצלחת בצפיפות נמוכה יחסית (<1 x 105 תאים / מיליליטר) בבקבוק רגיל T25 רקמת תרבות, ותרבות בתנאים סטנדרטיים, 5% CO2, 37 °C (37 °C ), חממה תרבות רקמות לחות (איור 1G).
- החל תאים קפואים מעולם לא בתרבית (שלב 1.14.): להפשיר את התאים, לשטוף בינוני ללא סרום צלחת ב 2% FBS / NMGF ותרבות כמתואר בשלב 3.2. Culturing ב NMGF במשך 3 ימים לפני העברת תאים קיימא 2% FBS / NMGF היא חלופה לבחור מראש משם תאים מובחנים.
4. ניתוח מורפולוגי ומולקולרי של נוירוספרות על ידי אימונוהיסטוכימיה
- תרבות הנוירוספרות עד שרוב הכדורים הרב-תאיים הצפים מגיעים לקוטר של 100 מיקרומטר.
- הסר צלויי תרבות מהחממה ומיד גלולות נוירוספרות, להסיר בינוני ולהוסיף 10 מ"ל של DPBS מבלי להפריע גלולה. הסר DPBS, resuspend בפורמלין אגירה ניטרלי 10% דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- גלולה spheroids, resuspend ב 30% אתנול ודגרת במשך 30-45 דקות.
- החלף 30% אתנול עם 50% אתנול, דגירה במשך 15 דקות ולהחליף עם טרי 50% אתנול, דגירה עוד 30 דקות.
- חזור (שלב 4.4.) עם 70% אתנול.
- החלף עם 95% אתנול שני שינויים 10-20 דקות כל אחד, ולחזור עם אתנול מוחלט עד spheroids הם לבנים בהירים מרוכזים.
- הפוך חרוט נייר מסנן קטן מתוך נייר העדשה ומניחים אותו לתוך משפך קטן ב. הרטב את נייר העדשה באלכוהול מוחלט.
- לשחרר את גלולה מעט עם טרי 100% אתנול, לשפוך אתנול עודף ויוצקים את spheroids דרך חרוט נייר העדשה, לוודא שהם הולכים לקצה הקונוס. לשטוף את הצינור עם אתנול מוחלט נוסף ויוצקים את כל spheroids הנותרים דרך חרוט נייר העדשה.
- מוציאים את חרוט הנייר מהמשפך ומעבירים בזהירות את הכדורואידים לתחתית החרוט. מקפלים את הנייר לריבוע ומוודאים שהספרואידים סגורים בצורה מאובטחת ככל האפשר.
- מעבירים את הנוירוספרות הארוזות לקלטת ומעבירים למעבד רקמות אוטומטי.
- תוכנית מעבד הרקמות האוטומטי כדלקמן: אתנול מוחלט, 10 דקות, xylene, 15 דקות (2x), פרפין, 10 דקות (4x).
- הסר את הקלטת מהמעבד והנח אותה בחלק המחומם של מערכת הטמעת פרפין . ודאו שהמשטח כולו נקי מרסיסים, אבק או פסולת אחרת ושאבו את כל הפרפין מבארות החימום של המלקחיים. מחממים מלקחיים נקיים ללא פרפין ומוסיפים כמות קטנה של פרפין לתבנית בסיס מחוממת.
- פתח את הקלטת, הסר את המנה והנח אותה בחלק המחומם של מערכת ההטבעה. פתח בזהירות את חרוט הנייר עד שהספרואידים יהיו גלויים. לאסוף כמה שיותר של החומר ככל האפשר עם מלקחיים מראש ולהעביר את הפרפין הנוזלי בתבנית הבסיס.
- חזור על הפעולה כנדרש כדי לאחזר כמה שיותר ספירואידים. בעדינות לגרד את נייר הרקמה עם סכין גילוח נקי מראש כי כבר ניגב עם אתנול כדי לאסוף כל spheroids שיורית מבלי לקבל כל נייר לתוך הבלוק.
- בזהירות לשבור את כל גושים כדוריים עם מלקחיים חמים. מזיזים את הספרואידים מהפינות לשכבה מרכזית אחידה. מעבירים את תבנית הבסיס לאזור הקירור כדי לאבטח את הספארוידים במקום, מוסיפים את הקלטת, ממלאים לאט בפרפין ומצננים היטב.
- בלוק פרפין נוירוספרה יכול לשמש עבור חתך נורמלי אימונוהיסטוכימיה.
Representative Results
יישמנו את הפרוטוקול שתואר לעיל כדי לנתק ולתרבות 125 דגימות גליובלסטומה כירורגיות טריות (איור 1),88 אובחנו לאחרונה ו -37 גידולים חוזרים ונשנים (טבלה 2), בהסכמת המטופל המאושר ותחת הנחיות מוסדיות. היעילות של הפרוטוקול להקמת תרביות נוירוספריות לטווח ארוך הייתה 41.6%, ודומה לגידולים שאובחנו לאחרונה וגידולים חוזרים ונשנים (טבלה 2). עבור דגימות GBM מסוימות, נוצרים נוירוספרות בימים הראשונים (איורים 1B ו- 1C), ואילו עבור אחרים נדרש זמן פולחן ארוך יותר (איורים 1D ו- 1E).
היעילות של היווצרות נוירוספרה לא הייתה תלויה אך ורק ברמת הנמק ברקמה, כפי שבאה לידי ביטוי בתוצאות של גידול שאובחן לאחרונה עם צפיפות תאים גבוהה (GBM1) וגידול חוזר ונמק (GBM2) המעובד על פי פרוטוקולים 1 ו -2, שניהם מניבים תרביות נוירוספריות (איור 2).
בדיקת הפוטנציאל tumorigenic של כל תרבות נוירוספרה בעכברים immunocompromised הוא האימות המכריע של גישה זו להעשרה של CSCs. באמצעות פרוטוקול דומה שתואר בעבר18, GBM1 ו GBM2 נוירוספרות הושתלו במוחם של עכברים immunocompromised, תחת הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים IACUC. גידולי קסנוגרפט מציגים מאפיינים מורפולוגיים של GBMs, כגון פלישה לפרנצ'ימה במוח ונמק (איור 2).
GBM3 נותק (איור 1A) ותרבית במדיום נוירוספרי(איורים 1D ו- 1E),וב- 2% FBS / NMGF (איורים 1D, 1G ו- 1H). תאים חד-שכבתיים בתרבית של 2% FBS/NMGF ותאי נוירוספרה שתורבתו ב- NMGF היו מנותקים ומספר זהה של תאים הושתלו בעכבר עירום, באותו הליך כמו באיור 2. לא נצפו הבדלים בהישרדות, בדינמיקה של גידולים או במורפולוגיה בין שתי שיטות התרבות המוקדמות (איורים 3A-C). מאפייני הגדילה של הגידול אינם משתנים עד למעבר האחרון שנבדק, P20 לנוירוספרות ו- P10 עבור 2% FBS/NMGF. בעוד סמני תאי גזע עצביים, כולל Sox2, הם downregulated ברוב תאי GBM העיקריים בתרבית 10% FBS 3,4,11, NMGF בתוספת 2% FBS מאפשר שימור של ביטוי Sox2 (איור 3D).
נוירוספרות עובדו על פי פרוטוקול 4, ומסומן עם H&E (איור 4A), נוגדן אנטי-Sox2, המציג לוקליזציה גרעינית (איור 4B),ונוגדן EGFR, לוקליזציה של קרום התא (איור 4C). פרוטוקול זה הוחל כדי לגשת לשינויים תלויי גירויים בביטוי של nestin, GFAP, ואת סמן התפשטות Ki6711.
שולחן 2. יעילות של הפקת תרבויות נוירוספרה לחידוש עצמי לטווח ארוך מ- GBMs.
| פתולוגיה | (ש"ע) | אחוז הדגימות המניבות נוירוספרות לחידוש עצמי לטווח ארוך (n) |
| גליובלסטומה - לא מטופל, ניתוח ראשון | 88 | 42.0% (37) |
| גליובלסטומה - חוזר | 37 | 40.5% (15) |
| סך | 125 | 41.6% (52) |
איור 1. תרבית תאים מדגימות ניתוחיות גליובלסטומה טריות. גידולים טריים מנותקים אנזימטית לתאים בודדים. ממשק תאים גרעיניים מאזור הפרדת צפיפות מצופה לאחר מכן ב- NMGF. נוירוספרות מנותקות מצופות ב- NMGF, ובדרך כלל יום אחד לאחר הציפוי יש תאים מתים, פסולת, תאים בודדים מחוברים, ומדי פעם תאים מתחלקים בהשעיה (A). היווצרות נוירוספרה היא מהירה יותר במקרים מסוימים (B, C), ואיטית יותר עבור אחרים (D,E). כל הנוירוספרות מנותקות ומופצות ל-10 קטעים לפחות, 41.6% ג'יגה-בתים מניבים נוירוספרות לחידוש עצמי לטווח ארוך. תאים דיסוציאציה GBM קיימא שאינם מצליחים לגדול כמו נוירוספרות (F) ניתן להעביר לתנאי תרבות חלופיים, למשל 2% FBS / NMGF (G, H). בר (A), 100 מיקרומטר, חל על כל התמונות. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 2. דור נוירוספרה קסנוגרפטים עכבר אורתוטופי מגידולים GBM. דגימת גידול המציגה צפיפות תאים גבוהה (GBM1) וגידול עם תוכן נמקי גבוה (GBM2) היו מנותקים ונוירוספרות בתרבית במשך 10 קטעים על פי פרוטוקולים 1 ו -2. עכברים Immunocompromised הושתלו עם 3 x 105 תאים נוירוספריים מנותקים והקריבו כאשר moribund. מוחות עכבר היו פורמלין קבוע פרפין מוטבע עבור H&E כתמים וזיהוי אימונוהיסטוכימיה של סמנים אנושיים, המיטוכונדריה האנושית (hMit) או המעמד העיקרי histocompatibility אני subunit HLA-A (MHC-I). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 3. גידול דומה בעכברים מושתלים תוך אופן עם תאי GBM3 בתרבית כמו נוירוספרות ב NMGF או כמו monolayers ב 2% FBS / NMGF. (A) עקומות ההישרדות קפלן-מאייר עבור GBM3 בתרבית כמו נוירוספרות ב NMGF או monolayers ב 2%FBS / NMGF (שניהם מעבר <10) להראות שום הבדל בהישרדות (n = 10, p = 0.7174, מבחן דרגת יומן). (B) גידול גידול במעקב על ידי הדמיה bioluminescence חי (BLI) להראות שום הבדל משמעותי בדינמיקה גידול בין שתי הקבוצות. (C)מורפולוגיה גידול הוא נבדל עבור 4 GBM3 xenografts, 2 תרבותי NMGF ו 2 תרבותי 2% FBS / NMGF. כתם MHC-I כמתואר באיור 2. סולם, 600 מיקרומטר. (D)כתם מערבי המציג את ביטוי יצרנית תאי הגזע Sox2 נשמר ב 2% FBS / NMGF תרבויות המשמשות ליזום את הגידולים xenograft (A-C). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 4. ניתוח של ביטוי חלבון בחלקים נוירוספריים על ידי אימונוהיסטוכימיה. תרביות נוירוספרה היו פורמלין קבוע פרפין מוטבע כמתואר בנוהל 4, ומוכתם H&E (A), נוגדן אנטי Sox2 (B), ונוגדן אנטי EGFR (C). מצע DAB שימש להמחאה חזותית (B, C). בר, 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
Discussion
דיסוציאציה נכונה של תאי גידול אנזימטיים היא צעד קריטי בפרוטוקול זה. הרקמה חייבת להיות טחון הרבה לפני הדגירה בתמיסת דיסוציאציה של התא ב 37 מעלות צלזיוס תחת סיבוב, במשך מינימום של 30 דקות, כאשר הרקמה חייבת להיות משולש מכנית ואת הארכת הדיסוציאציה מאומתת. בהתאם למידת לכידות הרקמה, ניתן להאריך את הדגירה למשך 15-30 דקות נוספות, לפי הצורך כדי להשלים את הניתוק לתאים בודדים. דגירה בתמיסת דיסוציאציה במשך יותר משעה אינה מומלצת עקב ירידה בכדאיות התא. למרות הכמות האופטימלית של רקמה התחלתית היא 200-500 מ"ג, פרוטוקול זה הוביל תרבויות נוירוספרה מוצלחת מ קטן כמו 50 מ"ג של רקמת הגידול.
NMGF ללא סרום הוא מדיום סלקטיבי, ואחוז מהתאים הניאופלסטיים המרכיבים את עיקר הגידול, כמו גם תאים מארחים, לא ישרדו, בעוד שאחרים יתחברו לתרבות הרקמות שטופלה בבקבוקון לאחר הציפוי. זה קריטי כי נוירוספרות שייווצרו מעל 1-3 שבועות (איורים 1B-E) מועברים בקבוקונים טריים, להיפרד תאים סרטניים מובחנים ופסולת.
תאי GBM מנותקים אנזימטית ולעולם לא מתורבתים (שלב 1.10) יכולים להיות קריאופושמור כמקור גיבוי של תאים לתרבות במדיה אלטרנטיבית, במקרה שהתרבות הנוירוספרית נכשלת. השגנו בהצלחה תרבויות נוירוספריות ממלאי קפוא כזה, כמו גם תאים חד שכבתיים הגדלים ב-2% FBS/NMGF.
מבחינה מושגית, "תא גזע סרטני" הוא עבודה בתהליך ותחום מתפתח זה ייהנה מהבהרה נוספת, שכן ההשלכות הקליניות הן משמעותיות, במיוחד בדור של הטרוגניות הגידול, פלסטיות, והתנגדות לטיפול1 9,20. בנוסף להיותו חיוני ליצירת מודלים מסוימים של בעלי חיים GBM המטופל, תרבויות נוירוספרה הם גם בעלי ערך עבור מחקרים במבחנה כגון שינוי איתות התא ביטוי גנים בתגובה גורמי גדילה, היפוקסיה, וסוכניםתרופתיים 11,21. בחרנו להשתמש בחתכים של נוירוספרות משובצות פורמלין ופרפין, שמירה על ארכיטקטורת תלת-ממד, ללמוד ביטוי חלבון ושינויים פוסט-תרגומיים על ידי אימונוהיסטוכימיה11, בשל לוקליזציה תת-תאית מעולה ביחס לשיטה הנפוצה יותר של תיוג והדמיה של הספירה כולה.
הוכח כי לא כל התאים בתוך נוירוספרות נגזר המוח יונקים בוגרים הם תאי גזע22. באופן דומה, נוירוספרות מתורבת גידולים GBM סביר להניח לא שיבוט, בשל נוכחותם של תאים אבות סרטניים מובחנים יותר וצבירה עצמית, ידוע להתרחש בצפיפות תאים גבוהה23, אשר נחשב מגבלה של שיטה זו על ידי כמה. כדי להעדיף העשרה לתאי גזע מתחדשים לטווח ארוך, בניגוד רק אבות אשר יכול לגדול באופן חולף כמו נוירוספרות22, נוירוספרות העיקרי מנותקים להיווצרות נוירוספרה משנית, ומעבר נוסף עבור מינימום של 10 קטעים, שווה בערך 2 חודשים בתרבות רציפה, המהווה אינדיקציה של אוכלוסייה מועשרת בתאי גזע22. מניסיוננו, תרבויות נוירוספריות GBM המשיגות את הסימן הזה יכולות להמשיך להתרחב כמו נוירוספרות ללא הגבלת זמן. כיתה הגידול חשוב, שכן השגנו תרבויות מוצלחות מ GBMs ו astrocytomas אנאפלסטי, WHO כיתה IV ו- III, בהתאמה, אבל לא מ gliomas כיתה נמוכה יותר.
השיטה הנפוצה ביותר של culturing תאים גליובלסטומה, במדיום הצמיחה המסורתי בתוספת 10% FBS, מוביל הבדל גנומי ופנוטיפי ניכר מן הגידולים המקוריים 4. מצד שני, תרבויות נוירוספריות הן מקור יציב וארוך טווח של תאים המציגים פנוטיפ תא גזע סרטני4. השיטה neurosphere הפך פופולרי יותר ויותר עבור העשרה של CSC בתרבויות לטווח ארוך עבור מודלים קסנוגרפט עכבר אורתוטופי, למרות שלא היה מוצלח עבור כל דגימות אסטרוציטומה בדרגה גבוהה, המייצג את החולשה העיקרית של שיטה זו. מחקרים כדי להבין כיצד מאפיינים מולקולריים של גידולים הוריים יכולים להשפיע על היווצרות נוירוספרה נמצאים בעיצומה. חקירה של שיטות חלופיות מעשיות לתרבות gliomas כיתה גבוהה, ואחריו אימות נרחב מוענקים, בהתחשב ביתרונות חשובים של בעל מודלים GBM ספציפי החולה, כפי שאנו מתקדמים לעידן של רפואה מותאמת אישית, מונע על ידי הנגישות של מידע "omics" ומספר גדל של טיפולים ממוקדים פוטנציאליים.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המרכז לגידול במוח הרמלין, בית החולים הנרי פורד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
References
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).
- Ignatova, T. N., et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760 (2006).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).
- Joo, K. M., et al. Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas. Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).
- Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma. Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).
- deCarvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28, 181-190 (2010).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2011).
- Laks, D. R., et al. Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Gunther, H. S., et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).
- Fael Al-Mayhani, T. M., et al. An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours. J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype. PLoS One. 5, (2010).
- Pietras, A. Cancer stem cells in tumor heterogeneity. Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).
- Lomonaco, S. L., et al. The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
