Summary
Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.
Abstract
Glioblastomen, de meest voorkomende en agressieve vorm van astrocytoom, zijn vuurvast voor therapie en moleculair heterogeen. Het vermogen om celculturen op te zetten die het genomische profiel van de oudertumoren behouden, voor gebruik in patiëntspecifieke in vitro en in vivo modellen, heeft het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de preklinische ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor glioblastoom die zijn afgestemd op de moleculaire kenmerken van elke tumor.
Beginnend met verse hoogwaardige astrocytoomtumoren gedissocieerd in enkele cellen, gebruiken we de neurosfeertest als een verrijkingsmethode voor cellen die kankerstamcelfenotype presenteren, inclusief expressie van neurale stamcelmarkers, langdurige zelfvernieuwing in vitroen het vermogen om orthotopische xenografttumoren te vormen. Deze methode is eerder voorgesteld en wordt nu door verschillende onderzoekers gebruikt. Op basis van onze ervaring met het scheiden en cultiveren van 125 glioblastoommonsters, kwamen we tot het gedetailleerde protocol dat we hier presenteren, geschikt voor routinematige neurosfeerculering van hoogwaardige astrocytomen en grootschalige uitbreiding van tumorigenic cellen voor preklinische studies. We rapporteren over de efficiëntie van succesvolle langetermijnculturen met behulp van dit protocol en stellen betaalbare alternatieven voor het kweken van gedissocieerde glioblastoomcellen voor die niet groeien als neurosferen. We beschrijven ook in detail een protocol voor het behoud van de neurosferen 3D-architectuur voor immunohistochie. Celculturen verrijkt met CCC's, die orthotopische xenograftmodellen kunnen genereren die de moleculaire handtekeningen en heterogeniteit van GBM's behouden, worden steeds populairder voor de studie van de biologie van GBM's en voor het verbeterde ontwerp van preklinische tests van potentiële therapieën.
Introduction
Glioblastoom (GBM), een WHO graad IV astrocytoom, is de meest voorkomende en agressieve primaire hersentumor. Diverse ontwikkelingsfenotypes worden overgenomen door GBM-tumorcellen, waaronder cellen die kenmerken van "kankerstamcel" (CSC) vertonen, zoals de expressie van neurale stamcelmarkers (NSC), langdurige zelfvernieuwing en het potentieel om meer gedifferentieerde cellen te creëren die astrocytische markers uitdrukken en het grootste deel van de tumorvormen 1-3. Hoewel er nog steeds verduidelijking nodig is met betrekking tot de moleculaire identiteit van CSC en klinische implicaties, ligt de focus van dit werk op de operationele definitie van CSC: langdurige zelfvernieuwing in vitro en het vermogen om de oorspronkelijke tumor te differentiëren en te reproduceren bij orthotopische implantatie bij immuungecompromitteerde knaagdieren.
Glioblastoomcellen worden al tientallen jaren gekweekt in traditioneel medium met 10% foetale runderserum (FBS) en verschillende in de handel verkrijgbaar serum gekweekte GBM-cellijnen zijn tumorigeen bij immuungecompromitteerde knaagdieren, maar er is aanzienlijke genomische en moleculaire divergentie van de oorspronkelijke tumor4, waardoor het gebruik ervan als klinisch relevante modellen wordt beperkt. Meer recent werden cellen met stam/voorloperfenotype dat reageert op EFG en bFGF geïdentificeerd in GBM's2. Vervolgens werden gedissocieerde GBM-tumormonsters gekweekt in een serumvrij medium3, oorspronkelijk geformuleerd voor de selectie en uitbreiding van neurale stamcellen uit de volwassen zoogdierhersenen5. Deze kweekomstandigheden belemmeren de groei van de meeste niet-neuroplastische en meer gedifferentieerde tumorcelpopulaties, terwijl ze de groei van stam- en voorlopercellen als zwevende meercellige sferoïden of neurosferen3bevorderen, waarbij het gedrag van volwassen neurale stamcellen van zoogdieren wordt nagebootst5. Uitgebreide vergelijking van primaire GBM-cellen gekweekt in neurosfeermedium aangevuld met groeifactoren (NMGF) of in het traditionele groeimedium aangevuld met 10% FBS, onthulde dat de GBM-neurosferen tumorigeen waren, multilineage differentiatiepotentieel presenteerden en het genotype van de oorspronkelijke tumor behielden, in tegenstelling tot de 10% FBS-culturen die niet tumorigeen waren bij lage passages en aanzienlijk verschilden van de oorspronkelijke tumoren bij latepassages.
Isolatie van CSC van gedissocieerde GBM-tumoren door celsortering op basis van de expressie van putatieve CSC-marker CD133 is ook voorgesteld6,7, maar verder onderzoek wees uit dat het CSC-fenotype niet definitief geassocieerd is met de expressie van dergelijke markers8-10, waardoor het aanvankelijke enthousiasme voor deze strategie afneemt , terwijl nieuwe markers nog steeds worden getest10. De onbeschikbaarheid tot nu toe van een gevalideerde set markers die CSC definiëren, samen met het doel van grootschalige versterking van deze cellen voor preklinische studies, maakt het gebruik van celsortering onpraktisch voor routinematige CSC-verrijkte culturen. GBM-cellen geselecteerd door het vermogen om te groeien als neurosferen in NMGF drukken steevast neurale stamcelmarkers uit. We hebben waargenomen dat Sox2 en nestine alomtegenwoordig worden uitgedrukt in neurosfeerculturen, terwijl CD133-eiwit aanwezig is in een subset van de GBM-neurosferen (ongepubliceerde gegevens en referentie11).
Verschillende laboratoria streven neurosfeerculturen na van glioblastoomtumoren met dezelfde algemene benadering van enzymatische dissociatie en cultivering in serumvrij medium aangevuld met groeifactoren3,4,11-14, terwijl andere collega's pogingen hebben gemeld om neurosfeerculturen op lange termijn zonder succes uit GBM-monsters te laten groeien . De hier gepresenteerde algemene methode voor enzymatische dissociatie en neurosfeercultuur van hoogwaardige gliomen is vergelijkbaar met wat in de bovenstaande publicaties is beschreven. We hebben het protocol geoptimaliseerd op basis van onze ervaring met het dissocieren en cultiveren van meer dan 100 GBM-monsters. De efficiëntie van het verkrijgen van neurosfeerculturen op lange termijn uit verse GBM-monsters die het hier gepresenteerde protocol toepassen, is meer dan 40%, vergelijkbaar met de weinige rapporten die efficiëntiegegevens3,15tonen , wat leidt tot de exploratie van alternatieve protocollen zoals het voortdurend of met tussenpozen cultiveren van cellen in serumvrij medium in aanwezigheid van EFG en bFGF als monolagen op oppervlakken bedekt met ECM-eiwit16,17. Neurosfeerculturen zijn nog steeds de meest gevalideerde en steeds populairdere benadering om GBM-tumoren moleculaire kenmerken en tumorigeen potentieel3,4,11-14te behouden , dus onze aanpak is om eerst neurosfeerculturen te proberen, terwijl we tegelijkertijd alternatieve methoden testen voor het cultiveren van GBM-cellen die geen langdurige zelfvernieuwende neurosferen vormen ( figuur1), om de representatie van GBM-tumoren die in diermodellen kunnen worden gebruikt, te vergroten. Hier presenteren we een protocol voor het cultiveren van neurosferen van GBM's. Voor cellen die geen neurosferen vormen, laten we een eenvoudige wijziging in het groeimedium zien, als de eerste poging om tumorogene cellen uit niet-neurosfeervormende GBM's te cultaculeren, met veelbelovende resultaten en nog steeds uitgebreide validatie ondergaan.
Protocol
1. Eencellige suspensie van verse chirurgische glioblastoom specimen voor neurosfeer cultuur
- Met schriftelijke toestemming van patiënten en in overeenstemming met institutionele richtlijnen, tumormonsters verzamelen voor celkweek onmiddellijk na resectiechirurgie van hoogwaardig glioom.
- Bevestig de diagnose van tumormonster door histopathologie. Transporteer het monster onmiddellijk van de operatiekamer naar de laminaire flow weefselkweekkap, voor verwerking binnen 1 uur na de operatie.
OPMERKING: Snijd voor operaties op een afgelegen locatie het tumormonster in kleinere fragmenten en plaats het in een buis met DMEM/F12 (houd het op ijs). De tumor kan enkele uren na de operatie worden verwerkt. - Begin met 200-500 mg weefsel (optimaal), gehakt het tumormonster met behulp van een scalpelblad en breng het over naar een buis van 15 ml met 10 ml DMEM/F12 serumvrij medium. Meng door meerdere keren om te keren, laat de tumor stukjes sedimenteren door zwaartekracht, verwijder medium en herhaal indien nodig.
- Bereid de enzymatische weefseldissociatieoplossing en stopoplossing vers.
- Enzymatische weefseldissociatieoplossing: 5 ml 0,05% Trypsine-EDTA, 2,5 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) calcium- en magnesiumvrije, 2,5 ml Collagenase IV-stamoplossing (2.000 U/ml in HBSS met calcium en magnesium).
- Stopoplossing: 5 ml Trypsine inhibitoroplossing, 5 ml DMEM/F12, 2 μl van 5.000 U/ml DNAse I (gemaakt in HBSS calcium- en magnesiumvrij).
- Verwijder medium en voeg enzymatische weefseldissociatieoplossing toe aan het gehakte tumormonster, met 2 ml voor elk 0,5 g weefsel. Meng voorzichtig door om te keren.
- Incubeer het weefsel in oplossing bij 37 °C in een weefselkweek-incubator onder rotatie gedurende 30 minuten.
- Trituraat met een pipet van 2 ml en stop de spijsvertering of keer terug naar de incubator voor nog een incubatie van 15-30 minuten, afhankelijk van het niveau van de spijsvertering.
- Stop de spijsvertering door 2 volumes Stop Solution toe te voegen en trituraat mechanisch met een serologische pipet van 5 ml.
- Filtreer het onverteerd materiaal door een celzeef van 40 μm. Pellet de cellen op 800 x g gedurende 5 min op kamertemperatuur, gevolgd door 3x wassen in 10 ml DMEM/F12.
- Resuspend de laatste cel pellet in 5 ml DMEM/F12.
- Leg de celsuspensie langzaam op 5 ml Lympholyte-M en pellet op 1.300 x g gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Breng de interfacelaag met de nucleated cellen over in een buis van 15 ml met 10 ml DMEM/F12.
- Pellet de cellen op 800 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Herhaal de was met DMEM/F12 2x meer.
- Cryopreserve de resulterende enkele cellen voor verder gebruik door resuspending de pellet in Recovery Cell Freezing Medium, aliquoting in cryovials, langzaam invriezen, en opslag in vloeibare stikstof.
- Om te groeien, resuspend de cellen in Neurosphere Medium aangevuld met groeifactoren (NMGF), en plaat met relatief lage dichtheid (<1 x 105 cellen /ml) in een gewone T25 weefselkweek kolf onder standaardomstandigheden, 5% CO2,37 °C, bevochtigde weefselkweek incubator (Figuur 1A).
- Bereid NMGF met behulp van het volgende recept
Voor 500 ml DMEM/F12 Voorraadoplossing volume eindconcentratie N2 supplement (10x) 5 ml 1x 250 mg/ml BSA stamoplossing 1 ml 0,5 mg/ml 10 mg/ml Gentamicine reagens 1,25 ml 25 μg/ml 100x antibioticum/antimycoticum 2,5 ml 0,5x 100 mg/ml bFGF 0,1 ml 20 ng/ml 100 mg/ml EFG 0,1 ml 20 ng/ml
- Bereid NMGF met behulp van het volgende recept
- Breng neurosferen die zich gedurende 1-3 weken vormen (figuren 1B-E) over in verse kolven, om zich te scheiden van aangekoppelde cellen en vuil. Voer elke 3-4 dagen gedeeltelijke mediawijzigingen uit.
OPMERKING: Als orthotopische xenografttumor wordt losgekoppeld met behulp van het bovenstaande protocol, kunnen stappen 1.11-1.13 worden weggelaten.
2. Glioblastoma Neurosfeer cultuur onderhoud en downstream toepassingen
-
Dissociatie: Bewaak de neurosfeerculturen en voer elke 3-4 dagen gedeeltelijke mediumveranderingen uit. Wanneer de meeste meercellige neurosferen in de kolf een diameter van 100 μm bereiken, dissocieren in een eencellige suspensie:
- Breng het medium met de neurosferen over in een buis van 15 ml, zwaartekracht sediment de neurosferen gedurende ongeveer 5 minuten, verwijder het medium en resuspend de celkorrel in 10 ml calcium- en magnesiumvrije DPBS.
- Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, terwijl de cellen sedimenteren door de zwaartekracht.
- Verwijder 7-8 ml DPBS en dissocieert de neurosferen mechanisch met een voorgewette serologische pipet.
- Pellet de gedissocieerde cellen bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Passaging: Resuspend de gedissocieerde cellen (stap 2.1.) in NMGF en verdeel in het benodigde aantal kolven (1:3), en incubeer onder standaardomstandigheden. Secundaire neurosferen zullen zich vormen en moeten vervolgens worden gescheiden voor de vorming van tertiaire sferen.
- Beoordeling van zelfvernieuwing op lange termijn: Herhaal de dissociatieprocedure totdat de neurosfeercultuur ten minste 10 passages bereikt, wat overeenkomt met minimaal 2 maanden in cultuur.
-
Invriezen: Om de neurosferen te cryopreserveren, de neurosferen te ontkoppelen (stap 2.1.) en de celkorrel opnieuw te gebruiken in Recovery Cell Freezing Medium, aliquot in cryovials, langzaam invriezen en opslaan in vloeibare stikstof.
- Om neurosfeercellen uit een bevroren stam te gekweekt: ontdooi de cellen bij 37 °C en breng onmiddellijk over op een buis van 15 ml met 10 ml DMEM/F12. Meng de buis voorzichtig en draai de cellen vervolgens 5 min op 4 °C op 800 x g. Was de celkorrel nog een keer en resuspend de cellen in NMGF en breng over naar een T25 weefselkweekkolf.
-
Celsuspensie voor intracranieel implantaat bij immuungecompromitteerde muis:
- Dissocieert de neurosferen (stap 2.1.) en resuspendeert de celkorrel in calcium- en magnesiumvrije DPBS. Tel levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe uitsluiting.
- Bereken het aantal cellen dat nodig is voor implantaten, meestal 3 x 105 cellen/muis, breng het gewenste aantal cellen over in een flacon en pellet de cellen op 1.000 x g.
- Resuspend de celkorrel in een volume dat geschikt is voor implantatie (5 μl/muis) door zachtjes op de microcentrifugebuis te tikken. Plaats de celsuspensie op ijs en gebruik binnen 2 uur.
3. Alternatief protocol voor het cultiveren van tumorigene glioblastoomcellen (voor de gevallen waarin neurosfeercultuur faalt)
- Vul het NMGF-medium aan met foetale runderserum tot een eindconcentratie van 2% FBS/NMGF.
- Beginnend met cellen in NMGF-cultuur: Oogst levensvatbare cellen uit de NMGF-kolf(figuur 1F),resuspend in 2% FBS/NMGF en plaat met een relatief lage dichtheid (<1 x10 5 cellen/ml) in een gewone T25 weefselkweekkolf, en kweek onder standaardomstandigheden, 5% CO2, 37 °C, bevochtigde weefselkweek incubator (Figuur 1G).
- Beginnend met bevroren nooit gekweekte cellen (stap 1.14.): Ontdooi de cellen, was in serumvrij medium en plaat in 2% FBS/NMGF en kweek zoals beschreven in stap 3.2. Cultiveren in NMGF gedurende 3 dagen voorafgaand aan het overbrengen van levensvatbare cellen naar 2% FBS/NMGF is een alternatief voor het voorselecteren van gedifferentieerde cellen.
4. Morfologische en moleculaire analyse van neurosferen door immunohistochie
- Kweek de neurosferen totdat de meeste zwevende meercellige sferoïden een diameter van 100 μm bereiken.
- Verwijder kweekkolven uit de incubator en pellet onmiddellijk de neurobolletjes, verwijder het medium en voeg 10 ml DPBS toe zonder de pellet te verstoren. Verwijder DPBS, resuspend in 10% neutraal gebufferd formaline en incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Pellet de sferoïden, resuspend in 30% ethanol en incubeer gedurende 30-45 min.
- Vervang 30% ethanol door 50% ethanol, incubeer gedurende 15 min en vervang door verse 50% ethanol, incubeer nog eens 30 min.
- Herhaal (stap 4.4.) met 70% ethanol.
- Vervang door 95% ethanol twee veranderingen van elk 10-20 minuten en herhaal dit met absolute ethanol totdat sferoïden helder wit en gecondenseerd zijn.
- Maak een kleine filterpapierkegel van lenspapier en plaats deze in een kleine trechter in een bekerglas. Maak het lenspapier nat met absolute alcohol.
- Maak de pellet iets los met verse 100% ethanol, giet overtollige ethanol af en giet de sferoïden door de lenspapierkegel, zorg ervoor dat ze naar de punt van de kegel gaan. Spoel de buis af met extra absolute ethanol en giet de resterende sferoïden door de lenspapierkegel.
- Verwijder de papieren kegel uit de trechter en verplaats de sferoïden voorzichtig naar de onderkant van de kegel. Vouw het papier in een vierkant en zorg ervoor dat de sferoïden zo goed mogelijk zijn afgesloten.
- Breng de verpakte neurosferen over naar een cassette en breng ze over naar een automatische weefselprocessor.
- Programmeer de automatische weefselprocessor als volgt: absolute ethanol, 10 min, xyleen, 15 min (2x), paraffine, 10 min (4x).
- Verwijder de cassette uit de processor en plaats deze op het verwarmde deel van een paraffine-insluitsysteem . Zorg ervoor dat het hele oppervlak vrij is van fragmenten, stof of ander vuil en hevel alle paraffine uit de forceps warmwaterputten. Verwarm schone paraffinevrije tang en voeg een kleine hoeveelheid paraffine toe aan een opgewarmde basisvorm.
- Open de cassette, verwijder het pakket en plaats het op het verwarmde deel van het insluitsysteem. Open de papierkegel voorzichtig totdat de sferoïden zichtbaar zijn. Verzamel zoveel mogelijk van het materiaal met voorverwarmde tang en breng over op de vloeibare paraffine in de basisvorm.
- Herhaal dit indien nodig om zoveel mogelijk sferoïden op te halen. Schraap het tissuepapier voorzichtig met een voorverwarmd schoon scheermesje dat is afgeveegd met ethanol om eventuele resterende sferoïden te verzamelen zonder papier in het blok te krijgen.
- Breek voorzichtig alle bolvormige klonten met warme tangen. Verplaats de sferoïden van de hoeken naar een uniforme centrale laag. Verplaats de basisvorm naar het koelgebied om de sferoïden op hun plaats te zetten, voeg de cassette toe, vul langzaam met paraffine en koel grondig.
- Het neurosfeer paraffineblok kan worden gebruikt voor normale doorsneden en immunohistochie.
Representative Results
We hebben het hierboven beschreven protocol toegepast op dissociate en kweek 125 verse chirurgische glioblastoommonsters (figuur 1), 88 nieuw gediagnosticeerde en 37 terugkerende tumoren (tabel 2), met goedgekeurde toestemming van de patiënt en volgens institutionele richtlijnen. De efficiëntie van het protocol voor het vaststellen van neurosfeerculturen op lange termijn was 41,6%, en vergelijkbaar voor nieuw gediagnosticeerde tumoren en terugkerende tumoren (Tabel 2). Voor sommige GBM-monsters vormen zich in de eerste paar dagen neurosferen (figuren 1B en 1C), terwijl voor andere langere cultiveringstijd vereist is (figuren 1D en 1E).
De efficiëntie van neurosfeervorming was niet uitsluitend afhankelijk van het niveau van necrose in het weefsel, zoals blijkt uit de resultaten van een nieuw gediagnosticeerde tumor met hoge celdichtheid (GBM1) en een terugkerende en necrotische tumor (GBM2) verwerkt volgens protocollen 1 en 2, die beide neurosfeerculturen opleverden (Figuur 2).
Het testen van het tumorigene potentieel van elke neurosfeercultuur bij immuungecompromitteerde muizen is de cruciale validatie van deze aanpak voor verrijking van CSC's. Met behulp van een protocol vergelijkbaar met eerder beschreven18, GBM1 en GBM2 neurosferen werden geïmplanteerd in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen, volgens institutionele en IACUC-richtlijnen voor dierverzorging. De xenografttumoren vertonen morfologische kenmerken van GBM's, zoals invasie in het hersenparenchym en necrose (figuur 2).
GBM3 werd gedissocieerd (figuur 1A) en gekweekt in neurosfeermedium (figuren 1D en 1E), en in 2% FBS/NMGF (figuren 1D, 1G en 1H). Monolaagcellen gekweekt in 2% FBS/NMGF en neurosfeercellen gekweekt in NMGF werden gedissocieerd en hetzelfde aantal cellen werd geïmplanteerd in naaktmuis, met dezelfde procedure als in figuur 2. Er werden geen verschillen in overleving, tumorgroeidynamiek of morfologie waargenomen tussen de twee pre-implantatiekweekmethoden (Figuren 3A-C). Tumorgroeikenmerken veranderen niet tot de meest recente geteste passage, P20 voor neurosferen en P10 voor 2% FBS/NMGF. Terwijl neurale stamcelmarkers, waaronder Sox2, worden gereguleerd in de meeste primaire GBM-cellen gekweekt in 10% FBS 3,4,11, maakt NMGF aangevuld met 2% FBS het behoud van Sox2-expressie mogelijk (Figuur 3D).
Neurosferen werden verwerkt volgens Protocol 4 en gelabeld met H&E(figuur 4A),anti-Sox2-antilichamen, met nucleaire lokalisatie(figuur 4B)en EGFR-antilichaam, celmembraanlokalisatie(figuur 4C). Dit protocol is toegepast om toegang te krijgen tot stimuliafhankelijke veranderingen in de expressie van nestine, GFAP en de proliferatiemarker Ki6711.
Tabel 2. Efficiëntie van het afleiden van langdurige zelfvernieuwende neurosfeerculturen van GBM's.
| Pathologie | N. | Percentage monsters dat op lange termijn zelfvernieuwende neurosferen oplevert (n) |
| Glioblastoom - onbehandeld, eerste operatie | 88 | 42.0% (37) |
| Glioblastoom - recidiverend | 37 | 40.5% (15) |
| totaal | 125 | 41.6% (52) |
Figuur 1. Celkweek van verse glioblastoom chirurgische specimens. Verse tumoren worden enzymatisch gedissocieerd tot enkele cellen. Nucleated cell interface van dichtheid scheidingsmedium wordt vervolgens geplateerd in NMGF. Gedissocieerde neurosferen worden geplateerd in NMGF, en meestal 1 dag na plating zijn er dode cellen, puin, gehechte enkele cellen en af en toe delende cellen in suspensie (A). Neurosfeervorming is in sommige gevallen sneller (B,C) en voor andere (D,E). Alle neurosferen worden gedissocieerd en opnieuw geploeterd voor ten minste 10 passages, 41,6% GBM's leveren op lange termijn zelfvernieuwende neurosferen op. Levensvatbare GBM-gedissocieerde cellen die niet groeien als neurosferen (F) kunnen worden overgebracht naar alternatieve kweekomstandigheden, bijvoorbeeld 2% FBS/NMGF (G,H). Bar (A), 100 μm, is van toepassing op alle afbeeldingen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Neurosfeergeneratie en orthotopische muis xenografts van GBM tumoren. Een tumormonster met een hoge celdichtheid (GBM1) en een tumor met een hoog necrotisch gehalte (GBM2) werden gedissocieerd en neurosferen gekweekt voor 10 passages volgens protocollen 1 en 2. Immuungecompromitteerde muizen werden geïmplanteerd met 3 x10 5 gedissocieerde neurosfeercellen en opgeofferd wanneer ze sterven. Muishersenen waren formaline gefixeerd en paraffine ingebed voor H&E-kleuring en immunohistochiëmiedetectie van menselijke markers, menselijke mitochondriën (hMit) of grote histocompatibiliteitsklasse I subeenheid HLA-A (MHC-I). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Vergelijkbare tumorgroei bij muizen intracraniaal geïmplanteerd met GBM3-cellen gekweekt als neurosferen in NMGF of als monolagen in 2% FBS/NMGF. (A) Kaplan-Meier overlevingscurven voor GBM3 gekweekt als neurosferen in NMGF of monolagen in 2%FBS/NMGF (beide passage <10) vertonen geen verschil in overleving (n=10, p=0,7174, log-rank test). (B) Tumorgroei gecontroleerd door live bioluminescentie imaging (BLI) vertoont geen significant verschil in tumorgroeidynamiek tussen de twee groepen. (C) Tumormorfologie is niet te onderscheiden voor 4 GBM3 xenografts, 2 gekweekt in NMGF en 2 gekweekt in 2% FBS/NMGF. MHC-I vlek zoals beschreven voor figuur 2. Schaal, 600 μm. (D) Westelijke vlek met de stamcelmaker Sox2-expressie die wordt vastgehouden in 2% FBS/NMGF-culturen die worden gebruikt om de xenografttumoren (A-C) te initiëren . Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Analyse van eiwitexpressie in neurosfeersecties door immunohistochistry. Neurosfeerculturen waren formaline-vast en paraffine ingebed zoals beschreven in procedure 4, en gekleurd met H&E (A), anti-Sox2 antilichaam (B) en anti-EGFR antilichaam (C). DAB-substraat werd gebruikt om te visualiseren (B,C). Staaf, 20 μm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Discussion
Een goede enzymatische tumorceldissociatie is een cruciale stap in dit protocol. Het weefsel moet ruim vóór incubatie in celdissociatieoplossing bij 37 °C bij rotatie worden gehakt, gedurende ten minste 30 minuten, wanneer het weefsel mechanisch moet worden getand en de verlenging van de dissociatie moet worden geverifieerd. Afhankelijk van de mate van weefselcohesie kan de incubatie met extra 15-30 minuten worden verlengd, indien nodig om dissociatie in enkele cellen te voltooien. Incubatie in dissociatieoplossing langer dan 1 uur wordt niet aanbevolen vanwege verminderde levensvatbaarheid van de cel. Hoewel de optimale hoeveelheid startweefsel 200-500 mg is, heeft dit protocol geleid tot succesvolle neurosfeerculturen vanaf slechts 50 mg tumorweefsel.
Serumvrije NMGF is een selectief medium en een percentage neoplastische cellen dat het grootste deel van de tumor en gastheercellen omvat, zal het niet overleven, terwijl anderen zich na het plateren aan de met weefselkweek behandelde kolf hechten. Het is van cruciaal belang dat de neurosferen die zich gedurende 1-3 weken zullen vormen (figuren 1B-E) worden overgebracht naar verse kolven, om zich te scheiden van gedifferentieerde tumorcellen en puin.
GBM-cellen die enzymatisch worden gedissocieerd en nooit gekweekt (stap 1.10) kunnen worden gebruikt als een back-upbron van cellen naar cultuur in alternatieve media, voor het geval de neurosfeercultuur faalt. We hebben met succes neurosfeerculturen verkregen uit dergelijke bevroren voorraden, evenals monolaagcellen die groeien in 2% FBS / NMGF.
Conceptueel gezien is "kankerstamcel" een werk in uitvoering en dit opkomende veld zal baat hebben bij aanvullende verduidelijking, aangezien de klinische implicaties aanzienlijk zijn, met name bij de generatie van tumor heterogeniteit, plasticiteit en resistentie tegen therapie19,20. De neurosfeerculturen zijn niet alleen van vitaal belang voor het genereren van patiëntspecifieke GBM-diermodellen, maar zijn ook waardevol voor in vitro studies zoals verandering in celsignalering en genexpressie als reactie op groeifactoren, hypoxie en farmacologischemiddelen 11,21. We hebben gekozen voor het gebruik van doorsneden van formaline vaste en paraffine ingebedde neurosferen, het behoud van de 3D-architectuur, om eiwitexpressie en post-translationele modificaties door immunohistochie11te bestuderen, vanwege de superieure subcellulaire lokalisatie met betrekking tot de meer gebruikelijke methode om de hele bol te labelen en in beeld te brengen.
Het is aangetoond dat niet alle cellen in neurosferen afgeleid van volwassen zoogdierhersenen stamcellen zijn22. Evenzo zijn de neurosferen gekweekt uit GBM-tumoren waarschijnlijk niet clonal, vanwege de aanwezigheid van meer gedifferentieerde kankervoorlopercellen en zelfaggregatie, waarvan bekend is dat ze optreden bij hoge celdichtheden23, wat door sommigen als een beperking van deze methode wordt beschouwd. Om verrijking voor zelfvernieuwende stamcellen op lange termijn te bevorderen, in tegenstelling tot alleen voorlopers die tijdelijk kunnen groeien als neurosferen22, worden de primaire neurosferen gedissocieerd voor secundaire neurosfeervorming en verder gepasseerd gedurende minimaal 10 passages, ongeveer gelijk aan 2 maanden in continue cultuur, wat een indicatie is van een populatie verrijkt met stamcellen22. Onze ervaring is dat GBM-neurosfeerculturen die dat doel bereiken, voor onbepaalde tijd als neurosferen kunnen worden uitgebreid. Tumorkwaliteit is belangrijk, omdat we succesvolle culturen hebben verkregen van GBM's en anaplastische astrocytomen, respectievelijk WHO-graad IV en III, maar niet van gliomen van lagere kwaliteit.
De meest voorkomende methode voor het cultiveren van glioblastoomcellen, in traditioneel groeimedium aangevuld met 10% FBS, leidt tot aanzienlijke genomische en fenotypische divergentie van de oorspronkelijke tumoren 4. Aan de andere kant zijn neurosfeerculturen een stabiele en langdurige bron van cellen die kankerstamcelfenotype4presenteren. De neurosfeermethode is steeds populairder geworden voor de verrijking van CSC in langetermijnculturen voor orthotopische muis xenograftmodellen, ondanks het feit dat het niet succesvol is voor alle hoogwaardige astrocytoommonsters, wat de belangrijkste zwakte van deze methode vertegenwoordigt. Studies om te begrijpen hoe moleculaire kenmerken van de ouderlijke tumoren de neurosfeervorming kunnen beïnvloeden, zijn aan de gang. Verkenning van praktische alternatieve methoden voor cultuur hoogwaardige gliomen, gevolgd door uitgebreide validatie, wordt verleend, gezien de belangrijke voordelen van het hebben van patiëntspecifieke GBM-modellen, naarmate we verder gaan in een tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde, gevoed door de toegankelijkheid van "omics" -informatie en een toenemend aantal potentiële gerichte therapieën.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk is gefinancierd door het Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Trypsin - EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
| Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
| Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
| Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
| Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |
References
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).
- Ignatova, T. N., et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760 (2006).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).
- Joo, K. M., et al. Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas. Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).
- Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma. Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).
- deCarvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28, 181-190 (2010).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. , (2011).
- Laks, D. R., et al. Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Gunther, H. S., et al. Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).
- Fael Al-Mayhani, T. M., et al. An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours. J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype. PLoS One. 5, (2010).
- Pietras, A. Cancer stem cells in tumor heterogeneity. Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).
- Lomonaco, S. L., et al. The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells. Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
