Summary
前庭神经鞘瘤（VSS）是雪旺细胞（SC）的原点非恶性肿瘤，与在NF2的肿瘤抑制基因的突变相关联。我们提出一个可重复的，高效的协议，用于原代人类VS细胞培养，允许分子和细胞实验操作和分析，概括人类疾病的异质性。
Abstract
前庭神经鞘瘤（VSS）代表雪旺氏细胞的前庭神经（SC）的肿瘤，危及所有颅内肿瘤的10％。 VSS发生在任何偶发或家族（神经纤维瘤病2型，NF2）形式，既在NF2肿瘤抑制基因失活的缺陷有关 基因。治疗VSS通常是手术切除或放射治疗，但此类程序的发病率，带动调查微创治疗。从历史上看，缺乏新鲜组织标本，事实上，神经鞘瘤细胞不会永生都显著阻碍了利用原代培养的神经鞘瘤肿瘤发生的研究。为了克服原代培养的供应有限，是由转导与HPV E6和E7癌基因产生的永生HEI193 VS细胞系。这种致癌转导介绍显著分子和表型改变的细胞，从而限制了其作为一种模式为人类的使用chwannoma肿瘤。因此，我们说明了一个简单的，可重复的协议，用于原代人类文化VS细胞。这很容易掌握技术允许分子和细胞研究能够更准确地概括了VS疾病的复杂性。
Introduction
前庭神经鞘瘤（VSS）代表雪旺氏细胞的前庭神经（SC）的肿瘤，危及所有颅内肿瘤1-3的10％。 VSS发生在任何偶发或家族（神经纤维瘤病2型，NF2）形式，既在NF2肿瘤抑制基因失活的缺陷有关 基因。治疗VSS通常是手术切除或放射治疗，但此类程序的发病率，包括耳聋，面部神经病变，脊髓液渗漏，不平衡，和肿瘤再生长1。另外不是所有的患者都可以接受手术或放疗的候选人。这种显著的发病率替代疗法，以及缺乏带动调查VSS的独特分子生物学在开发新的治疗方法3,4的希望。
细胞培养允许潜在的治疗COM的分子和细胞行为和筛选的快速，轻便，并深入分析磅。从历史上看，缺乏新鲜组织标本，事实上，神经鞘瘤细胞不会永生都显著阻碍了利用原代培养的神经鞘瘤肿瘤发生的研究。为了克服原代培养的供应有限，是由转导与HPV E6和E7癌基因5所产生的永生HEI193 VS细胞系。这种致癌转导介绍显著分子和表型改变的细胞，从而限制了其作为一种模式为人类神经鞘瘤的使用。从缺乏功能性NF2基因的转基因小鼠系衍生的资深大律师代表的文化研究在体外NF2依赖SC肿瘤发生另一种选择。然而，这些文化不能概括人类VSS或帐户人类特定行为的异质性。以往大多数VS培养技术需要相对较长的处理时间和复杂的选择性培养技术6-8。在这里，我们提出了一个简单的，可重复的协议，用于原发性VS细胞培养与完整的处理下3小时，用95％的肿瘤细胞的纯度，通过免疫测定。
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Protocol
伦理声明：利用人类肿瘤标本在这个协议的批准爱荷华机构审查委员会的大学（IRB）。
1，安装前一天收获肿瘤
- 外套细胞培养板：在无菌培养罩，补充足够的聚L-鸟氨酸（0.01％溶液），以支付聚苯乙烯/塑料培养以及/培养皿的底部，更换盖子，并让坐在在室温下至少2小时。载玻片或盖玻片可以代替聚苯乙烯为需要成像实验。
- 2小时后，取出与吸力的聚-L-鸟氨酸溶液，并允许所述板中的无菌培养罩完全干燥。添加足够的层粘连蛋白溶液（10微克/毫升中的Ca 2 + / Mg 2 +的HBSS中自由[HBSS-/ - ），以完全覆盖培养皿，更换盖子，然后要么1）在阴凉4℃冰箱放置过夜，或2）在37℃培养箱中放置至少2小时。如果板将过夜或更长时间储存，包装在保鲜膜板，以防止蒸发/干燥。
2，安装肿瘤收获的日子
- 准备文化传媒：媒体是由新鲜肿瘤收获和加工的一天，存放于4℃，紧接媒体新增/变更加热到37℃的培养箱中培养。
- 神经鞘瘤的培养基是高血糖（4.5毫克/毫升）的DMEM（含酚红）与0.1毫克/毫升青霉素和0.1毫克/毫升链霉素; N2培养基补充最终稀释度1:100;牛胰岛素5微克/毫升;胎牛血清至10％的总体积。通过0.22微米的过滤器过滤所有的媒体。
- 准备试样运输冷却器：发送一个装满冰冷却器用1-2（取决于肿瘤的数量有所收获）无菌50ml锥形管25毫升的HBSS用的Ca 2 + / Mg 2 +的（HBSS + / +）手术室肿瘤样品转移和运输。
- 准备逐张idual肿瘤分离管 - 填充无菌的圆底管1毫升的HBSS + / +，并置于冰上。 （管将用于肿瘤样本的锐性剥离/解离）。
- 对于解离，准备约一解离管组织收获的每0.5 立方厘米 ;例如，肿瘤样品测量1.0×1.0×1.0厘米（1 毫升 ）将需要两个HBSS + / +解离管。
- 紫外线杀菌：将组织剪刀，小镊子，解剖刀手柄，1个正常的培养皿中，P1000吸管，并在无菌培养罩的枪头，并在紫外光下离开〜15分钟前抵达肿瘤组织和处理。
3，标本分离和运输
- 通过手术切除孤立的肿瘤标本。
- 从患者体内取出后，立即将肿瘤标本放入冰冷的HBSS + / +尽可能快地。一旦所有的布甲Ë样品收集，样品运输（冰）从手术剧场实验室作进一步处理。
4，组织解离和研磨
- 下列标准无菌技术在层流罩，带锥形管与肿瘤标本进培养罩，并通过反相管和肿瘤50X洗涤样品。允许碎片掉落到管的底部，然后除去HBSS + / +。笔芯用30毫升的HBSS + / +和搅拌/再反转50倍。重复反转/媒体搬迁总共4倍。
- 重悬肿瘤碎片在30毫升的HBSS + / +最后一次，然后将混合物倒入一个sterile100毫米培养皿，以及独立的肿瘤，用0.5 立方厘米分组。如果较大的肿瘤片段遇到，使用组织剪刀或手术刀（＃11或＃15刀片），以切成小块。
- 使用镊子把0.5 立方厘米组织团体到个人的HBSS + / +填充，2个圆底圆锥曲线人管，所有的冰。使用组织剪刀切碎的肿瘤碎片成子1毫米片段，该悬浮液应该有一个“雪球”外观（ 图1）。剁碎的肿瘤只有等到大多数碎片都低于1毫米;不要“过度肉'的肿瘤样本。将完全碎纸巾筒背冰上，并重复所有额外标本管。
- 转移所有零散的肿瘤样本到一个单一的15 mL锥形管。 P1000的移液管与剪切/修改无菌尖端可以很好地用于此步骤。使用额外的HBSS + / +冲洗/冲洗2毫升分离管，以确保所有的肿瘤样本被收集在15毫升管。在离心机降速混合物在23°C，在73×g离心5分钟。
- 吸过的HBSS + / +，留下细胞团块。重悬片段中0.25％的胰蛋白酶1:1的混合物：0.2％胶原酶（溶于HBSS-/ - ） - 添加仅够维持肿瘤碎片在狭小的苏spension。代替螺旋盖，并置于37℃培养箱中培养30分钟。孵化保持碎片悬浮在搅拌细胞混合物至少一次。将神经鞘瘤培养基放入培养箱温暖就在这时候也是如此。
- 孵育后，加入100微升的FBS，每管以灭活胰蛋白酶，然后离心样品，在23℃，73×g离心5分钟。使用移液管小心吸过尽可能多的上清液尽可能不干扰细胞沉淀。温热的培养基（N2/insulin/5％FBS）添加到肿瘤片段为1:2肿瘤片段的最终比例：培养介质（例如，如果有1毫升肿瘤片段，在2ml的升温加介质）。
- 通过切割头销P1000的移液管尖端的直径为约1-2毫米的制备对肿瘤研磨。使用渐进式小口径的枪头慢慢磨碎的细胞悬液，直到你可以很容易地通过一个unalt吸取的解决方案ERED P1000的枪头。立即移动到一个较小的针尖，一旦你可以很容易地通过吸管尖端的肿瘤解决方案 - 不超过磨碎试样。如果一个单一的一块较大的组织块抽吸研磨过程中，攻丝枪头在锥形管的底部往往允许续研磨。
5，细胞电镀
- 一个0.5毫米3片段组织足够的种子1×100毫米的菜，或4×8-well/4-well幻灯片。加上媒体/细胞混合物前夕，请从培养板的层粘连蛋白的解决方案，但不要让板干燥。
- 每100毫米的菜，溶解肿瘤片段在10毫升加温培养基。
- 对于4以及滑动的各孔中，用750微升温热的培养基（3毫升整个滑动）。
- 对于一个8孔滑动的每一个孔，用400微升回暖文化传媒（3.2毫升整个幻灯片）。
- 孵育培养37＆＃160;℃，100％湿度，6％的CO 2。离开文化的独自至少36小时，然后改变介质如果解决方案是泛黄（酸性）。否则在72小时改变媒体，然后每2-3天或当媒体变成酸性。如果媒体每日变为酸性，为连续数天，但通常潜在的细菌或酵母菌污染的指示。
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Representative Results
正确的肿瘤碎片是最佳的播种和生长在组织培养皿中（ 图1）是必不可少的。神经鞘瘤细胞的过程中电镀后的第一天鉴定是非常困难的，由于遮蔽细胞碎片和红血细胞的数量。由第 4或第 5天，贴壁附近的肿瘤细胞碎片扩展将创建可识别的“花边”模式的瓦砾中。随后的媒体的变化通常由第二周除去大部分的非贴壁细胞。使用这种方法，90％汇合可以7-14天之间所预期的，取决于肿瘤片段切碎并镀密度（ 图2）之前的初始活力。如前所述，神经鞘瘤培养物似乎从粘附肿瘤片段9,10小片段向外生长。这样的产物是可检测由第一周结束时， 图2示出了b从单一的肿瘤片段，用红色标出在右下角神经鞘瘤细胞生长rightfield成像， 图3示出了两种不同的肿瘤片段之间发生了“架桥”向外生长，在培养孔进行免疫染色用多克隆兔抗-S100抗体。我们经常免疫染色培养物用抗-S100或抗p75的抗体。NTR核实培养物的纯度和正确识别神经鞘瘤细胞进行分析（ 图4）。用这些方法将细胞在这些培养过的> 95％代表神经鞘瘤细胞。神经鞘瘤细胞也标记与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和ErbB2，以及其他标志物11。
图1相同的肿瘤样品的两个前（A）和尾部的比较于1.5ml的HBSS + / +与酚红于2.0毫升圆底离心管中ER（B）切碎，样品制备。
从肿瘤的片段图2。在明显微镜文化的典型外观。梭形神经鞘瘤细胞生长辐射，对文化10日拍摄的图像。比例尺= 100微米。
图3。免疫染色主要前庭神经鞘瘤培养具有抗S100抗体示范典型培养和细胞形态的。 A）低功耗图，表明从镀肿瘤碎片，文化的第14天。比例尺= 200微米。 乙产物）更高的POW神经鞘瘤细胞梭形形态，培养14天。比例尺= 100微米的ER图。
图初级前庭神经鞘瘤的文化4。免疫染色证实培养的纯度和细胞的身份。 A）培养用抗-S100抗体。细胞核用DAPI标记。比例尺= 100微米B）用抗-P75 NTR抗体文化。细胞核用DAPI标记。比例尺= 100微米。
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Discussion
在体外培养神经鞘瘤史
努力建立体外培养神经鞘瘤的最初听神经瘤的开放手术切除发生于1894年12开始后短短的几十年，第一次有记载的文化是由Kredel在20世纪20年代，谁不成功地试图用“悬滴法”12成长切碎的肿瘤。后来，博士。穆雷和烈性黑啤酒发表了他们在体外用生长在凝结人类血浆神经鞘瘤的文化体验。有趣的是，这种技术透露，安东尼A和安东尼乙特异性片段增长方式不同，琼脂13液化独特的细胞形态和鉴别率。 Cravioto和Lockwood出版听神经瘤文化的进一步观测禽流血块的玻璃罩单和辊管。他们还率先使用玫瑰腔肿瘤生长的时间推移成像
前庭神经鞘瘤原代培养的好处
人类神经鞘瘤肿瘤发生的研究经常使用同质永生化细胞系和转基因小鼠模型。这些工具都是有益而DØ不能准确地反映基因型，表现型，与人类疾病的复杂性。相比之下，原代培养物可能提供更现实的模型。他们更忠实地复述与人类肿瘤相关的15基因组和分子状态的异质性。
神经鞘瘤文化的纯度
小学组织文化的挑战是维持靶细胞纯度。神经鞘瘤压倒性包括肿瘤性雪旺氏细胞6，然而文化不是从成纤维细胞污染的免疫。在历史上，用于优化神经鞘瘤细胞的纯度分为三类方法：1）选择由化学上确定的培养基和特定的生长因子; 2）免疫纯化（ 例如 ，使用磁珠细胞分选7），3）两个前述方法的组合。在我们的经验，成纤维细胞或其它非神经鞘瘤细胞通常包括细胞少于5％，在丘尔再次，不管病人的特点（年龄，性别），零星或NF2相关的肿瘤，原发性或继发性肿瘤切除术，或胆囊与实体肿瘤类型。如果成纤维细胞似乎接管文化，去除血清1-2介质的变化将显著降低该人群无不良影响神经鞘瘤细胞的存活。预处理的细胞培养表面与层粘连蛋白也有利于神经鞘瘤细胞的生长9。文化的最小传代也有助于减少不必要的细胞污染 - cryostorage最好的前两个文化通道内完成，和文化的实验是不建议超过通道4-5。我们找到最佳的结果，当文化的实验是由通道1-2与非cryostored细胞完成。
我们同时使用免疫（抗-S100，DAPI）和细胞的核的形态在我们的神经鞘瘤培养的质量控制措施显微镜下的外观。有时它是有帮助的免疫染色培养单核细胞（CD68）或成纤维细胞特异性标记物的子集，以进一步验证培养纯度9。在细胞行为（ 如增殖或细胞死亡）实验分析中，我们始终免疫染色用抗-S100或抗-P75 NTR抗体，以验证发现是特定神经鞘瘤细胞。
文化形态和增长模式
神经鞘瘤的文化通常会显示独特的发展模式让人想起安东尼A的（高细胞密度，严密组织，适应症Verocay小体的形成）和很少安东尼B（比较稀疏核，丰富的细胞过程，较少组织）的模式出现在神经鞘瘤切除的病理组织学肿瘤16。几乎所有的神经鞘瘤细胞显示了经典长，梭形，双极细胞与雪旺既和神经鞘瘤细胞6,17但是其他细胞形态相关联的形状开发网，所描述的Cravioto（变形虫小胶质细胞样细胞，梭形细胞，球拍状细胞和风筝形细胞），有时会发生14。总体而言，细胞生长和增殖是在我们的基础培养基（DMEM/10％FBS/Insulin/N2补充）很慢。除了 已知的促有丝分裂因子如毛喉素，β1-神经调节蛋白的显著增加细胞增殖18。
关键协议的步骤
我们的神经鞘瘤组织培养协议简单和相当宽容;然而，有一些确保成功的几个关键步骤。首先，正确的肿瘤处理是至关重要的。期望最好的结果，当肿瘤被直接放入冰冷的HBSS + / +，尽快从患者一旦除去。这是违背收集切除肿瘤的无菌生理盐水，然后在案件的结尾发送的总组织处理的病理通常的手术做法。第二，保持组织SAMPLES尽可能凉爽处理过程中。至关重要的是，在切除肿瘤保持冰冷，和方便发生时的处理尽可能下面的去除。做尽可能多的组织处理的尽可能在冰上为好。第三，积极洗肿瘤样本。这将有助于减少细菌或酵母感染的风险。第四，不要过度切末肿瘤标本。肿瘤研磨依赖于半主观时，继续与一个直径较小的P1000的枪头的评估。
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Disclosures
没有利益冲突的披露。
Acknowledgments
技术支持：NIDCD R01DC009801，P30DC010362，5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T.
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al.
- Kaasinen, S., et al.
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd,, et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
