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方法文章

人源前庭神经鞘瘤的原代培养

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DOI：

10.3791/51093

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2014年7月20日

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck, University of Iowa Hospitals and Clinics

本文内容

摘要

前庭神经鞘瘤（VS）是起源于施万细胞（SC）的非恶性肿瘤，与NF2肿瘤抑制基因的突变相关。本文报道了一种可重复且高效的原代人前庭神经鞘瘤细胞培养方案，该方案可用于分子和细胞水平的实验操作与分析，并能重现人类疾病的异质性特征。

摘要

前庭神经鞘瘤（VS）是起源于前庭神经的施万细胞（SC）肿瘤，占所有颅内肿瘤的10%。VS可分为散发性和家族性（2型神经纤维瘤病，NF2）两种类型，二者均与NF2肿瘤抑制基因的失活性缺陷相关。 基因。前庭神经鞘瘤（VS）的治疗通常采用手术切除或放射外科治疗，然而这些操作的并发症发生率促使人们探索侵入性更小的治疗方法。长期以来，由于难以获取新鲜组织标本，且雪旺瘤细胞无法自然永生化，严重限制了原代培养细胞在雪旺瘤致瘤机制研究中的应用。为克服原代培养细胞供应有限的问题，研究人员通过转导人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7癌基因，建立了永生化的HEI193前庭神经鞘瘤细胞系。然而，这种癌基因转导导致细胞发生显著的分子和表型改变，限制了其作为人类雪旺瘤肿瘤模型的适用性。因此，我们展示了一种简化且可重复的原代人前庭神经鞘瘤细胞培养方案。该技术易于掌握，可支持更准确地模拟前庭神经鞘瘤疾病复杂性的分子与细胞水平研究。

引言

前庭神经鞘瘤（VS）是起源于前庭神经施万细胞（SC）的肿瘤，占所有颅内肿瘤的10%1-3. VS 可表现为散发性或家族性（2 型神经纤维瘤病，NF2）两种形式，均与肿瘤抑制基因 NF2 的失活性缺陷相关 NF2 肿瘤抑制因子 基因。VS的治疗通常采用手术切除或放射外科治疗，但这些手术的并发症包括耳聋、面神经病变、脑脊液漏、平衡障碍以及肿瘤再生。1此外，并非所有患者都适合接受手术或放疗。这种较高的发病率以及缺乏替代疗法的现状，促使研究人员深入探索前庭神经鞘瘤（VSs）独特的分子生物学特性，以期开发出新的治疗方法。3,4.

细胞培养可实现对分子和细胞行为的快速、便捷且深入的分析，并可用于潜在治疗化合物的筛选。历史上，由于难以获取新鲜组织样本，且雪旺瘤细胞本身不具备永生化特性，这显著限制了原代培养在雪旺瘤致瘤机制研究中的应用。为克服原代培养细胞供应有限的问题，研究人员通过导入HPV E6和E7癌基因，建立了永生化的HEI193 VS细胞系。5。这种致癌性转导导致细胞发生显著的分子和表型改变，限制了其作为人类神经鞘瘤模型的应用。源自缺乏功能性基因的转基因小鼠品系的施万细胞（SC）培养物 NF2 基因代表了另一种可供研究的替代方案 NF2依赖性SC肿瘤发生 体外然而，这些培养方法未能重现人类前庭神经鞘瘤（VS）的异质性特征，也无法反映人类特有的肿瘤行为。大多数既往的VS培养技术需要相对较长的处理时间，并依赖复杂的选择性培养方法。6-8在此，我们介绍一种简单且可重复的前庭神经鞘瘤原代细胞培养方案，整个处理过程耗时不足3小时，经免疫染色鉴定肿瘤细胞纯度达95%。

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方案

伦理声明：本方案中使用的人类肿瘤标本已获得艾奥瓦大学机构审查委员会（IRB）的批准。

1. 肿瘤收获前一天的准备工作

  1. 包被细胞培养板：在无菌培养罩内，加入足量的多聚-L-鸟氨酸（0.01% 溶液）以覆盖聚苯乙烯/塑料培养孔/培养皿底部，盖上盖子，在室温下静置至少 2 小时。对于需要成像的实验，可用玻璃载玻片或盖玻片替代聚苯乙烯材料。
  2. 2 小时后，用抽吸法去除多聚-L-鸟氨酸溶液，并在无菌培养罩内让培养板完全干燥。加入足量的层粘连蛋白溶液（10 µg/ml，溶于无 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS [HBSS-/-] 中），覆盖整个培养板表面，盖上盖子，然后选择以下任一方式处理：1）于 4 °C 冷藏过夜，或 2）在 37 °C 培养箱中孵育至少 2 小时。若培养板需存放过夜或更长时间，应用塑料薄膜包裹以防止蒸发或干燥。

2. 肿瘤收获当天的准备工作

  1. 准备培养基：在收获和处理肿瘤当天新鲜配制培养基，4 °C 保存，并在添加或更换培养基前立即放入37 °C 培养箱中预热。
  2. 神经鞘瘤培养基为高糖（4.5 mg/ml） DMEM（含酚红），添加 0.1 mg/ml 青霉素、0.1 mg/ml 链霉素；N2 培养基添加剂终浓度稀释为 1:100；牛胰岛素 5 µg/ml；胎牛血清终浓度为总体积的 10%。所有培养基均需经 0.22 μm 滤器过滤。
  3. 准备标本运输冷藏容器：向手术室发送一个装有冰块的冷藏箱，内含 1–2 个 （根据拟收获肿瘤量决定）无菌 50 ml 锥形管，每管加入 25 ml 含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS（HBSS+/+），用于肿瘤样本的转移与运输。
  4. 准备单个肿瘤解离管：将无菌 2 ml 圆底管每管加入 1 ml HBSS+/+，置于冰上。（这些管将用于肿瘤样本的锐性解剖与解离）。
  5. 进行解离时，每收获 0.5 cm3 组织约需准备一个解离管；例如，一个尺寸为 1.0 × 1.0 × 1.0 cm（1 cm3）的肿瘤样本需要两个 HBSS+/+ 解离管。
  6. 紫外线灭菌：将组织剪、小镊子、手术刀柄、1 个普通培养皿、P1000 移液枪及移液枪头 放入无菌超净台内，在肿瘤组织到达并开始处理前置于紫外线下照射约 15 分钟 进行灭菌。

3. 标本的分离与运输

  1. 通过手术切除获取肿瘤标本。
  2. 将切除的肿瘤标本尽快放入预冷的 HBSS+/+ 中。待所有组织样本采集完毕后，将样本置于冰上，从手术室转运至实验室进行后续处理。

4. 组织解离与吹打

  1. 在超净台中按照标准无菌操作技术，将装有肿瘤标本的锥形管带入培养罩内，通过反复倒置管子和肿瘤组织清洗样本共50次。待组织碎片沉降至管底后，吸除HBSS+/+。重新加入30 ml HBSS+/+，再次充分倒置振荡50次 。重复倒置与更换液体操作，共进行4次。
  2. 最后一次将肿瘤碎片重悬于30 ml HBSS+/+中，然后将混合液倒入无菌的100 mm培养皿中，将肿瘤组织分割为约0.5 cm3的团块。若遇到较大组织块，可使用组织剪刀或手术刀（#11或#15刀片）将其切割成更小的片段。
  3. 用镊子将0.5 cm3大小的组织团块分别放入预冷、盛有HBSS+/+的2 ml圆底锥形管中，置于冰上。使用组织剪将肿瘤组织剪切成小于1 mm的碎片——悬液应呈现“雪花球”样外观（图 1）。仅需将大部分组织剪至小于1 mm即可，避免过度剪切。将剪切完成的组织管重新放回冰上，并对所有其他样本管重复此操作。
  4. 将所有剪碎的肿瘤样本转移至一个15 ml 锥形管中。此步骤可使用剪切或改造过的无菌枪头（P1000移液器 ）进行，效果良好。使用额外的HBSS+/+冲洗/润洗2 ml 解离管，确保所有肿瘤样本均被收集至15 ml 管中。将混合液在23 °C下以73 ×g离心5分钟。
  5. 吸除上清HBSS+/+，保留细胞沉淀。将组织碎片重悬于0.25%胰蛋白酶:0.2%胶原酶（溶于HBSS-/-）的1:1混合液中——加入量以刚好维持肿瘤碎片呈紧密悬浮状态为宜。盖紧管盖，置于37 °C培养箱中孵育30分钟。孵育期间至少轻摇混合一次，以保持碎片悬浮。同时将雪旺细胞培养基放入培养箱中预热。
  6. 孵育结束后，向每管中加入100 µl FBS以灭活胰蛋白酶，然后在23 °C下以73 ×g离心5分钟。使用移液器小心吸除尽可能多的上清液，避免扰动细胞沉淀。向肿瘤碎片中加入预热的培养基（N2/胰岛素/5% FBS），终体积比为1:2（肿瘤碎片:培养基）。例如，若有1 ml肿瘤碎片，则加入2 ml预热培养基。
  7. 准备进行肿瘤组织吹打：将P1000移液器枪头末端剪去，使其直径约为1–2 mm。使用直径逐渐减小的枪头缓慢吹打细胞悬液，直至可轻松通过未经改造的P1000移液器枪头为止。一旦能够轻松吹打通过，立即换用更小口径的枪头——切勿过度吹打样本。若在吹打过程中有较大组织块阻塞吸液，轻敲枪头底部通常可恢复操作。

5. 细胞接种

  1. 一个 0.5 mm3 的组织碎片足以接种 1 个 100 mm 培养皿，或 4 个 8 孔/4 孔载玻片。在加入培养基/细胞混合物之前，从培养板中移除层粘连蛋白溶液，但不要让培养板干燥。
  2. 对于每个 100 mm 培养皿，将肿瘤碎片溶解于 10 ml 预温的培养基中。
  3. 对于每个 4 孔载玻片的每孔，使用 750 μl 预温的培养基（整张载玻片共需 3 ml ）。
  4. 对于每个 8 孔载玻片的每孔，使用 400 μl 预温的培养基（整张载玻片共需 3.2 ml ）。
  5. 将培养物置于 37 °C、100% 湿度、6% CO2 条件下培养。至少静置培养 36 小时，若培养液变黄（呈酸性），则更换培养基；否则在 72 小时更换，之后每 2–3 天或当培养基变酸时更换。若连续数天每日培养基均变酸，通常提示可能存在细菌或酵母污染。

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结果

正确的肿瘤组织破碎对于在组织培养皿中实现最佳接种和生长至关重要（图 1）。由于细胞碎片和红细胞的干扰，接种后最初几天内识别雪旺细胞通常较为困难。到第4天th 或 5th 在培养的第几天，靠近贴壁肿瘤组织碎片的细胞突起将在碎片间形成可识别的“网状”结构。随后的换液操作通常在第二周内清除大部分非贴壁细胞。采用此方法，通常在第7至14天之间可达到90%的汇合度，具体时间取决于肿瘤组织切碎前的初始活力以及接种密度。图 2如先前所述，神经鞘瘤培养物似乎从贴壁的肿瘤碎片小片段向外生长9,10这种外延生长在第一周结束时即可检测到。 图2 显示单个肿瘤组织碎片中雪旺细胞瘤细胞生长的明场成像，右下角红色轮廓标示了该组织碎片区域。 图3 展示了在培养孔中两个不同肿瘤组织碎片之间发生的“桥接”样生长，该结果通过多克隆兔抗S100抗体免疫染色获得。我们常规使用抗S100或抗p75抗体对培养物进行免疫染色。NTR 用于验证培养物纯度并阳性鉴定...

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讨论

历史 体外 神经鞘瘤培养

建立的努力 体外 神经鞘瘤培养始于首次听神经瘤开放手术切除后的几十年，该手术于1894年完成1220世纪20年代，克雷德尔首次记录了相关培养实验，他尝试使用“悬滴法”培养绞碎的肿瘤组织，但未获成功。12随后，默里博士和斯托特博士发表了他们的 体外 在人血浆凝块上培养神经鞘瘤的实验经验表明，Antoni A型和Antoni B型特异性组织片段的生长方式存在差异，表现为独特的细胞形态以及不同的琼脂液化速率13Cravioto 和 Lockwood 发表了关于在禽类血凝块覆盖的盖玻片和滚瓶中培养听神经瘤的进一步观察结果。他们也是首批使用 Rose 培养室进行肿瘤生长延时成像的研究者。1420世纪70年代的出版物研究了典型单层培养与较大肿瘤组织块“整体”生长之间的生长差异10Baur 在其发表的文章中结合了“整块”法和单层法，同时还证明了层粘连蛋白包被培养板的...

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披露

无任何利益冲突需要披露。

致谢

资助项目：NIDCD R01DC009801，P30DC010362，5T32DC000040-17

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚-L-鸟氨酸，0.01% 溶液SigmaP4957细胞培养表面处理
小鼠层粘连蛋白Gibco23017-015 / L2020细胞培养表面处理
0.2% 胶原酶（溶于 HBSS-/-）SigmaC2674解离试剂
0.25% 胰蛋白酶Gibco25200-056解离试剂
TPS 100 mm 圆形培养皿Midwest ScientificTP93100
Permanox 4 孔载玻片Fisher Scientific1256521
Permanox 8 孔载玻片Fisher Scientific1256522
抽滤瓶Midwest ScientificTP99500
15 ml 锥形管Midwest ScientificTP91015
50 ml 锥形管Midwest ScientificTP91050
2 ml 圆底管USA Scientific1620-2700
小剪刀FST14058-11
小镊子FST11251-20
手术刀柄FST10004-13
#11 手术刀片RobozRS-9801-11
非组织培养用 100 mm 圆形培养皿Fisher Scientific50-820-904
P1000 移液器BioexpressP3963-1000
血清移液器BioexpressR3073-2P
无菌非滤芯 P1000 吸头Midwest ScientificTD1250R
保温冰盒
超净工作台Baker
离心机Eppendorf -5810R
Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)+/+（含 Ca2+, Mg2+)Gibco24020-117神经鞘瘤培养与培养基组分
Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)-/-（不含 Ca2+, Mg2+)Gibco14170-112神经鞘瘤培养与培养基组分
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)，高糖，含酚红Gibco11965-092神经鞘瘤培养与培养基组分
N2 添加剂Gibco17502-048神经鞘瘤培养与培养基组分
胎牛血清Gibco26140-079神经鞘瘤培养与培养基组分
青霉素/链霉素Gibco15140-163神经鞘瘤培养与培养基组分
牛胰岛素（1 mg/ml，200 倍）SigmaI6634神经鞘瘤培养与培养基组分

参考文献

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重印与许可

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