Summary
Vestibolare Schwannomi (VSS) sono tumori non maligni della cella (SC) di origine Schwann, associati a mutazioni del NF2 gene soppressore del tumore. Riportiamo un protocollo efficace e riproducibile per uso umano primario VS coltura cellulare che permette di manipolazione sperimentale molecolare e cellulare e di analisi e ricapitola la natura eterogenea delle malattie umane.
Abstract
Schwannoma vestibolare (VSS) rappresentano cellule di Schwann (SC) i tumori del nervo vestibolare, compromettendo il 10% di tutte le neoplasie intracraniche. Vss verifica in (neurofibromatosi di tipo 2, NF2) forma sporadica o familiare, entrambe associate a difetti inattivazione nel tumore soppressore NF2 gene. Il trattamento per VSS è generalmente la resezione chirurgica o la radiochirurgia, ma la morbosità di tali procedure ha spinto indagini trattamenti meno invasivi. Storicamente, la mancanza di accesso ai campioni di tessuto fresco e il fatto che le cellule schwannoma non sono immortalati hanno ostacolato in modo significativo l'uso di colture primarie per le indagini di schwannoma tumorigenesi. Per superare la limitata offerta di colture primarie, la linea cellulare HEI193 VS immortalata è stato generato da trasduzione con HPV oncogeni E6 ed E7. Questo trasduzione oncogenica introdotto significative alterazioni molecolari e fenotipici alle cellule, che limitano il loro uso come modello per s umanitumori chwannoma. Abbiamo quindi illustrare un protocollo riproducibile semplificata per cultura umana primaria VS cellule. Questa tecnica permette facilmente masterizzato per indagini molecolari e cellulari che ricapitolano più accuratamente la complessità della malattia VS.
Introduction
Schwannoma vestibolare (VSS) rappresentano cellule di Schwann (SC) i tumori del nervo vestibolare, compromettendo il 10% di tutte le neoplasie intracraniche 1-3. Vss verifica in (neurofibromatosi di tipo 2, NF2) forma sporadica o familiare, entrambe associate a difetti inattivazione nel tumore soppressore NF2 gene. Il trattamento per VSS è generalmente la resezione chirurgica o la radiochirurgia, ma la morbosità di tali procedure comprende sordità, neuropatie del viso, perdita di liquido spinale, squilibrio, e la ricrescita del tumore 1. Inoltre, non tutti i pazienti sono candidati per la chirurgia o radiazioni accettabili. Tale significativa morbilità, nonché una mancanza di terapie alternative ha spinto indagine sulla biologia molecolare unico di VSS nella speranza di sviluppare nuovi trattamenti 3,4.
Coltura cellulare permette una rapida, facile, e approfondita analisi del comportamento molecolare e cellulare e lo screening del potenziale terapeutico comsterline. Storicamente, la mancanza di accesso ai campioni di tessuto fresco e il fatto che le cellule schwannoma non sono immortalati hanno ostacolato in modo significativo l'uso di colture primarie per le indagini di schwannoma tumorigenesi. Per superare la limitata offerta di colture primarie, la linea cellulare HEI193 VS immortalata è stato generato da trasduzione con HPV oncogeni E6 ed E7 5. Questo trasduzione oncogenica introdotto significative alterazioni molecolari e fenotipici alle cellule, che ne limitano l'uso come modello per i tumori schwannoma umani. Culture SC derivate da linee di topi transgenici che mancano di un gene NF2 funzionale rappresentano un'altra alternativa per indagare NF2-dipendente tumorigenesi SC in vitro. Queste culture però non riescono a riepilogare la natura eterogenea del Vss umano o di un conto per il comportamento umano specifico. La maggior parte delle precedenti tecniche di coltura VS richiesti tempi relativamente lunghi di lavorazione e complicate tecniche di coltura selettivi 6-8.Qui vi presentiamo un protocollo semplice e riproducibile per primario VS coltura cellulare con l'elaborazione completa in meno di 3 ore, con il 95% di purezza delle cellule tumorali come determinato da immunoistochimica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dichiarazione Etica: uso dei campioni tumorali umani in questo protocollo è stato approvato dalla University of Iowa Institutional Review Board (IRB).
1. Setup giorno prima Tumore Harvest
- Cappotto cellulari piastre di coltura: in una cappa sterile cultura, aggiungere abbastanza poli-L-ornitina (soluzione 0,01%) per coprire il fondo di una cultura polistirolo / plastica e / piatto, sostituire i coperchi, e lasciate riposare a temperatura ambiente per almeno 2 hr. Vetrini e vetrini possono essere sostituiti per polistirene per esperimenti che richiedono l'imaging.
- Dopo 2 ore, rimuovere la soluzione di poli-L-ornitina mediante aspirazione e permettono le piastre asciugare completamente in un sterili cappe cultura. Aggiungere la soluzione laminina abbastanza (10 mg / ml di Ca 2 + / Mg 2 + senza HBSS [HBSS-/ -]) per coprire completamente le piastre di coltura, sostituire le palpebre, poi o 1) posto in un luogo fresco 4 ° C frigorifero per una notte, o 2) inserire nel 37 ° C incubatore per almeno 2 ore. Se le piastresaranno memorizzati notte o più, avvolgere le piastre in involucro di plastica per evitare l'evaporazione / essiccazione.
2. Impostazione del Giorno del Tumore Harvest
- Preparare Culture Media: media è fatta fresca del giorno di raccolta e di trasformazione tumorale, conservato a 4 ° C, e riscaldato a 37 ° C in incubatore immediatamente prima ai media aggiunte / modifiche.
- Cultura schwannoma media è alta glucosio (4,5 mg / ml) DMEM (con rosso fenolo) con 0,1 mg / ml di penicillina e 0,1 mg / ml streptomicina; Mezzi N2 integrano diluizione finale 1:100; Insulina Bovini 5 mg / ml; Siero fetale bovino al 10% del volume totale. Filtrare tutti i media attraverso il filtro di 0,22 micron.
- Preparare campioni Trasporti di raffreddamento: Manda un dispositivo di raffreddamento del ghiaccio pieno di 1-2 (a seconda della quantità di tumore per essere raccolto) 50 ml provette coniche sterili con 25 ml di HBSS con Ca 2 + / Mg 2 + (HBSS + / +) per sala operatoria per il trasferimento del campione tumorale e trasporto.
- Preparare indivtubi tumore dissociazione idual - riempiono sterile 2 ml tondi tubi inferiori di 1 ml di HBSS + / + e posto sul ghiaccio. (Tubi sarà utilizzato per sharp dissezione / dissociazione di campioni tumorali).
- Per dissociazione, preparare circa un tubo di dissociazione per ogni 0,5 cm 3 di tessuto raccolto; per esempio, un campione di tumore che misurano 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm 3) richiederà due tubi + / + dissociazione HBSS.
- La luce ultravioletta sterilizzazione: forbici Luogo di tessuto, piccole pinze, bisturi manico, 1x piatto normale Petri, P1000 pipette e puntali per pipette in una cappa sterile cultura, e lasciare sotto la luce ultravioletta per ~ 15 minuti prima dell'arrivo e la trasformazione del tessuto tumorale.
3. Isolamento dei campioni e dei Trasporti
- Isolare campioni tumorali con la resezione chirurgica.
- Porre immediatamente campioni tumorali nel HBSS ghiacciata + / + il più rapidamente possibile dopo la rimozione dal paziente. Una volta che tutti Tissue campioni vengono prelevati, i campioni di trasporto (su ghiaccio), dal teatro operativo al laboratorio per ulteriori elaborazioni.
4. Dissociazione tessuti e Trituration
- Seguente tecnica sterile norma in una cappa a flusso laminare, portare provetta con il campione tumorali nella cappa coltura, e lavare i campioni capovolgendo tubo e tumore 50x. Consentire frammenti di cadono sul fondo del tubo, e poi rimuovere HBSS + / +. Riempire con 30 ml HBSS + / +, ed agitare / invertire 50x di nuovo. Ripetere rimozione inversione / media per un totale di 4x.
- Risospendere frammenti di tumore in 30 ml HBSS + / + per l'ultima volta, poi versare la miscela in un piatto di Petri mm sterile100 e tumore separato in 0,5 centimetri 3 raggruppamenti. Se frammenti di tumore più grandi sono incontrati, usare le forbici di tessuto o bisturi (# 11 o # 15 lame) per tagliare in pezzi più piccoli.
- Utilizzare le pinze per collocare i 0,5 centimetri 3 gruppi tissutali nella persona HBSS + / + compilato, 2 ml rotondo fondo conicotubi al, tutte su ghiaccio. Usare le forbici tessuti per sminuzzare frammenti di tumore in sub-1 millimetro frammenti, la sospensione dovrebbe avere un aspetto 'snowglobe' (figura 1). Tritare il tumore solo fino alla maggior parte dei frammenti sono sub-1 mm; non 'over-trita' i campioni di tumore. Posizionare il tubo di tessuto completamente macinata di nuovo sul ghiaccio, e ripetere con tutte le provette dei campioni supplementari.
- Trasferire tutti i campioni tumorali frammentati in un unico tubo da 15 ml. Una pipetta P1000 con un taglio / modificato punta sterile funziona bene per questo passo. Utilizzare supplementare HBSS + / + per svuotare / lavare i 2 tubi ml di dissociazione per assicurarsi che tutti i campioni di tumore è stato raccolto in 15 ml di tubo. Centrifugare miscela in centrifuga a 23 ° C, a 73 xg per 5 min.
- Aspirare off HBSS + / +, lasciando il pellet. Re-sospendere frammenti in miscela 1:1 di 0,25% tripsina: 0.2% collagenasi (sciolto in HBSS-/ -) - aggiungere quel tanto che basta per tenere frammenti di tumore in stretto suspension. Sostituire il tappo a vite, e il luogo nel 37 ° C incubatore per 30 min. Agitare la miscela di cellule almeno una volta durante l'incubazione per mantenere i frammenti in sospensione. Posizionare la cultura dei media Schwannoma nell'incubatrice per riscaldarla in questo tempo pure.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri FBS a ciascuna provetta per inattivare la tripsina, e poi campione centrifugare a 23 ° C, 73 xg per 5 min. Usando una pipetta, accuratamente aspirazione fuori il più possibile surnatante senza disturbare pellet di cellule. Aggiungere i terreni di coltura riscaldato (N2/insulin/5% FBS) ai frammenti di tumore a un rapporto finale di 1:2 frammenti di tumore: coltura (per esempio, se vi è 1 ml di frammenti di tumore, aggiungi in 2 ml di riscaldato media).
- Prepararsi per tumore trituration tagliando la punta di una punta P1000 pipetta ad un diametro di circa 1-2 mm. Lentamente triturare la sospensione cellulare con punte per pipette di diametro progressivamente sempre più piccoli, fino a quando si può facilmente pipetta la soluzione attraverso un unaltEred P1000 punta di pipetta. Passare immediatamente a una punta più piccola, una volta si può facilmente pipetta la soluzione tumore attraverso la punta - non più di triturare il campione. Se un unico pezzo più grande di blocchi di tessuto aspirazione durante triturazione, toccando la punta della pipetta sul fondo della provetta conica permette spesso continua triturazione.
5. Cella di placcatura
- Uno 0,5 millimetri 3 frammento di tessuto è sufficiente per seminare 1 x 100 mm piatto, o 4 x diapositive 8-well/4-well. Poco prima di aggiungere alla miscela media / cellulare, rimuovere la soluzione laminina dalle piastre di coltura, ma non lasciare le piastre a secco.
- Per ogni piatto 100 mm, sciogliere il frammento tumore in 10 ml di terreni di coltura riscaldato.
- Per ciascun pozzetto di una slitta 4 pozzetti, utilizzare 750 microlitri Terreni di coltura riscaldata (3 ml per l'intero vetrino).
- Per ogni ben di uno scivolo 8-bene, usare 400 microlitri di media cultura riscaldato (3.2 ml per tutta la diapositiva).
- Incubare le culture nel 37 &# 160; ° C, umidità del 100%, 6% di CO 2. Lasciare le colture da solo per almeno 36 ore, e quindi modificare il supporto se la soluzione è ingiallito (acido). In caso contrario, cambiare il supporto a 72 ore, poi ogni 2-3 giorni o quando i media diventano acide. Se il supporto diventa acido giorno per diversi giorni di fila, questo è generalmente un segno di potenziale contaminazione batterica o di lievito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Corretta frammentazione tumore è essenziale per la semina ottimale e escrescenza nelle piastre di coltura tissutale (Figura 1). Identificazione di cellule schwannoma durante i primi giorni dopo placcatura è spesso difficile, a causa oscurando quantità di detriti cellulari e globuli rossi. Con il 4 ° o 5 ° giorno, estensioni delle cellule vicino frammenti di tumore aderenti creeranno riconoscibile 'allacciatura' modelli tra i detriti. Successive modifiche di supporto generalmente rimuovere la maggioranza di cellule non aderenti dalla seconda settimana. Usando questo metodo, il 90% di confluenza può essere previsto tra 7-14 giorni, a seconda della vitalità iniziale del frammento tumorale prima macinazione e placcatura densità (Figura 2). Come descritto in precedenza, culture schwannoma sembrano crescere verso l'esterno da piccoli frammenti di frammenti di tumore aderenti 9,10. Tale escrescenza è rilevabile dalla fine della prima settimana. Figura 2 mostra bimmagini rightfield di schwannoma escrescenza cellulare da un unico frammento di tumore, delineato in rosso nell'angolo in basso a destra. Figura 3 illustra la conseguenza 'ponte' che si verifica tra due diversi frammenti di tumore, in pozzetti di coltura immunoistochimica con anticorpo policlonale di coniglio anti-S100. Noi abitualmente immunostain culture con anti-S100 o anticorpi anti-p75 NTR per verificare la purezza di culture e positivamente identificare le cellule schwannoma per analisi (Figura 4). Con questi metodi sopra> 95% delle cellule in queste colture rappresentano cellule schwannoma. Cellule Schwannoma etichetta anche con gliale fibrillare proteina acida (GFAP) e ErbB2, tra gli altri marcatori 11.
Figura 1. Confronto dello stesso campione tumorale sia prima (A) e di poppaer (B) macinazione. campione preparato in 1.5 ml HBSS + / + con rosso fenolo in 2,0 ml tubo conico fondo tondo.
Figura 2. Aspetto tipico delle culture al microscopio in campo chiaro. Affusolato escrescenza cellulare schwannoma irradia dal frammento di tumore, immagine presa sulla cultura giorno 10. Scala bar = 100 micron.
Figura 3. Immunocolorazione di colture primarie schwannoma vestibolare con anticorpi anti-S100 dimostrando tipica cultura e morfologie cellulari. A) Visualizzazione di potere basso illustra conseguenza da frammenti di tumore dorati, cultura giorni 14. Scala bar = 200 micron. B) pow SuperioreVista er di cellule schwannoma con morfologia affusolato, cultura giorno 14. Scala bar = 100 micron.
Figura 4. Immunostaining di culture schwannoma vestibolare primarie per confermare cultura purezza e l'identità delle cellule. A) Culture immunoistochimica con anticorpi anti-S100. I nuclei sono etichettati con DAPI. Barra della scala = 100 micron. B) colture immunostained con anticorpi anti-p75 NTR. I nuclei sono etichettati con DAPI. Barra della scala = 100 micron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Storia delle culture in vitro schwannoma a
Sforzi per stabilire in colture in vitro schwannoma iniziato solo pochi decenni dopo la neuroma acustico iniziale resezione chirurgica aperta si è verificato nel 1894 12. Le prime colture registrate erano di Kredel nel 1920, che hanno tentato senza successo di crescita del tumore macinate dal "metodo goccia appeso" 12 . Più tardi, Drs. Murray e Stout pubblicato la loro esperienza in vitro cultura neurilemomas coltivate su coagulato plasma umano. È interessante notare che questa tecnica ha rivelato che Antoni A e B Antoni specifici frammenti sono cresciuti in modo diverso, con morfologia e differenziali cellulare tassi unici di agar liquefazione 13. Cravioto e Lockwood pubblicati ulteriori osservazioni delle culture neuroma acustico in grumi aviaria sui scivola coverglass e tubi a rulli. Erano anche i primi ad usare camere di Rose per time-lapse imaging della crescita tumorale
Vantaggi di culture vestibolare Schwannoma primarie
Studi di tumorigenesi schwannoma umano spesso utilizzano linee cellulari immortalizzate omogenee e modelli di topi transgenici. Tali strumenti sono utili, ma do non riflettere accuratamente i genotipi, fenotipi, e la complessità della malattia umana. Per contro, colture primarie probabile forniscono un modello più realistico. Hanno più fedelmente ricapitolano l'eterogeneità dello status genomico e molecolare associata a tumori umani 15.
Purezza delle Culture schwannoma
Una sfida di cultura del tessuto primario è mantenere la purezza delle cellule bersaglio. Schwannomas prevalentemente costituiti da cellule di Schwann neoplastiche 6, tuttavia le culture non sono immuni dalla contaminazione di fibroblasti. Storicamente, i metodi per ottimizzare schwannoma cellule purezza rientrano in tre categorie: 1) selezione da fattori di crescita specifici mezzo chimicamente definito e; 2) immunopurificazione (ad esempio, con cella perlina magnetica classificare 7), 3) una combinazione di entrambi i metodi precedenti. Nella nostra esperienza fibroblasti o altre cellule non schwannoma comprendono generalmente meno del 5% di cellule nel culri, indipendentemente dalle caratteristiche del paziente (età, sesso), tumori sporadici o NF2-associati, resezione del tumore primario o secondario, o cistiche vs tipi di tumori solidi. Se fibroblasti sembrano prendere sulla cultura, la rimozione del siero per 1-2 modifiche di supporto riduce in modo significativo questa popolazione senza pregiudicare la sopravvivenza delle cellule schwannoma. Pre-trattamento di superfici di coltura cellulare con laminina facilita anche la crescita delle cellule schwannoma 9. Passaging Minimal delle culture aiuta anche a diminuire la contaminazione cellulare indesiderata - crioconservazione è meglio completata entro i primi due passaggi della cultura, e la cultura della sperimentazione non è raccomandato al di là passaggio 4-5. Troviamo risultati ottimali quando la cultura della sperimentazione è completata dal passaggio di 1-2 con le cellule non cryostored.
Usiamo entrambi immunoistochimica (anti-S100, DAPI) e l'aspetto microscopico della morfologia cellulare e nucleare, misure di controllo della qualità nelle nostre culture schwannoma. Occasionalmenteè utile per immunostain un sottoinsieme di colture per monociti (CD68) o marcatori fibroblasti specifici per verificare ulteriormente la cultura purezza 9. Durante analisi sperimentale del comportamento cellulare (per esempio, la proliferazione o la morte cellulare), abbiamo sempre immunostain con anti-S100 o anticorpi anti-p75 NTR per verificare che i risultati sono schwannoma cella specifica.
Modelli di cultura morfologia e crescita
Culture tumorali Schwannoma tipicamente visualizzano i modelli di crescita unici che ricordano Antoni A (alta densità cellulare, ben organizzata, indicazioni di formazioni corpo Verocay) e raramente di Antoni B (nuclei relativamente radi, processi cellulari abbondanti, meno organizzazione) modelli visti in istopatologia di schwannoma resecato tumori 16. Quasi tutte le cellule schwannoma visualizzano la forma classica lungo, affusolato, bipolare cella associata sia con Schwann e cellule schwannoma 6,17 invece altri morfo cellularelogie, come descritto da Cravioto (Cells ameboide Microglia-like, cellule fusiformi-Shaped, Celle di racchetta a forma, e celle Kite-Shaped) a volte si verificano 14. Nel complesso, la crescita e la proliferazione delle cellule sono molto lenti nel nostro terreno di base (DMEM/10% supplemento FBS/Insulin/N2). L'aggiunta di noti fattori mitogeni come forskolina e β1-neuregulin aumenta significativamente la proliferazione cellulare 18.
Critical Steps protocollo
Il nostro protocollo di coltura tissutale schwannoma è semplice e abbastanza tollerante; tuttavia ci sono diversi passaggi chiave che assicurano il successo. In primo luogo, il trattamento del tumore corretta è fondamentale. Aspettatevi migliori risultati quando tumore è posto direttamente in ghiaccio-freddo HBSS + / + appena possibile una volta rimosso dal paziente. Ciò è contrario alla prassi chirurgica del tumore resecato raccolta in soluzione salina sterile inviando poi il tessuto aggregato alla trasformazione in patologia alla fine del caso. In secondo luogo, tenere samp tessutoles freddo come possibile durante la lavorazione. E 'fondamentale che il tumore asportato è mantenuto freddo ghiaccio, e che il trattamento si verifica speditamente possibile dopo la rimozione. Fare tanto del trattamento possibile di tessuto su ghiaccio pure. In terzo luogo, aggressivo lavare i campioni di tumore. Questo aiuta a ridurre il rischio di contaminazione batterica o di lievito. In quarto luogo, non lo fanno i campioni tumorali over-trito. Tumore triturazione dipende da una valutazione semi-personale di quando continuare con un diametro della punta della pipetta P1000 più piccoli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interesse di rivelare.
Acknowledgments
Supporto: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T.
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al.
- Kaasinen, S., et al.
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd,, et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
