Primær Culture of Human vestibulær schwannomas

Summary

Vestibulær schwannomas (VSS) er ikke-maligne tumorer af Schwann celle (SC) oprindelse, der er forbundet med mutationer i NF2 tumorsuppressorgenet. Vi rapporterer en reproducerbar, effektiv protokol til primære humane VS cellekultur, der giver mulighed for molekylære og cellulære eksperimentel manipulation og analyse og samler op heterogene karakter af sygdom hos mennesker.

Abstract

Vestibulære schwannomas (VSS) udgør Schwann celle (SC) tumorer i det vestibulære nerve, det går 10% af alle intrakranielle neoplasmer. VSS forekomme i enten sporadiske eller familiær (neurofibromatosis type 2, NF2) former, både i forbindelse med inaktivering defekter i NF2 tumorsuppressor gen. Behandling for VSS er generelt kirurgisk resektion eller strålebehandling, men sygelighed af sådanne procedurer har drevet undersøgelser mindre invasive behandlinger. Historisk set har manglende adgang til friske vævsprøver og det faktum, at schwannoma cellerne ikke udødeliggjort hæmmet brugen af ​​primære kulturer til undersøgelse af schwannoma tumorigenese. For at overvinde den begrænsede forsyning af primære kulturer blev udødeliggjort HEI193 VS cellelinje genereret ved transduktion med HPV E6-og E7 oncogener. Denne onkogen transduktion indført væsentlige molekylære og fænotypiske ændringer i de celler, der begrænser deres anvendelse som model for humane schwannoma tumorer. Vi illustrerer derfor en forenklet, reproducerbar protokol til dyrkning af primære humane VS celler. Denne nemt mestrer teknik gør det muligt for molekylære og cellulære undersøgelser, der mere præcist rekapitulere kompleksiteten af ​​VS sygdom.

Introduction

Vestibulære schwannomas (VSS) udgør Schwann celle (SC) tumorer i det vestibulære nerve, det går 10% af alle intrakranielle neoplasmer ^1-3. VSS forekomme i enten sporadiske eller familiær (neurofibromatosis type 2, NF2) former, både i forbindelse med inaktivering defekter i NF2 tumorsuppressor gen. Behandling for VSS er generelt kirurgisk resektion eller strålebehandling, men sygelighed af sådanne procedurer inkluderer døvhed, ansigts neuropatier, lækage spinal, ubalance og tumorgenvækst ^1. Derudover ikke alle patienter er acceptable kirurgisk eller stråling kandidater. En sådan betydelig sygelighed samt en mangel på alternative behandlingsformer har drevet undersøgelse af unikke molekylærbiologi VSS i håb om at udvikle nye behandlinger ^3,4.

Celledyrkning giver mulighed for hurtig, letkøbt og dybtgående analyse af molekylære og cellulære adfærd og screening af potentielle terapeutiske compounds. Historisk set har manglende adgang til friske vævsprøver og det faktum, at schwannoma cellerne ikke udødeliggjort hæmmet brugen af ​​primære kulturer til undersøgelse af schwannoma tumorigenese. For at overvinde det begrænsede udbud af primære kulturer, blev udødeliggjort HEI193 VS cellelinje genereret af transduktion med HPV E6 og E7 onkogener ^5. Denne onkogen transduktion indført væsentlige molekylære og fænotypiske ændringer i de celler, der begrænser deres anvendelse som model for humane schwannoma tumorer. SC kulturer afledt fra transgene mus linjer, der mangler et funktionelt NF2 gen udgør et alternativ til at undersøge NF2-afhængig SC tumorigenese in vitro. Disse kulturer dog undlader at rekapitulere den heterogene karakter af menneskelig VSS eller konto for menneskelig bestemt adfærd. De fleste tidligere VS dyrkningsteknikker kræves relativt lange sagsbehandlingstider og komplicerede selektive dyrkningsteknikker ^6-8.Her præsenterer vi en simpel, reproducerbar protokol til primær VS cellekultur med komplet behandling i under 3 timer, med 95% tumor celle renhed som bestemt ved immunfarvning.

Protocol

Etik Statement: udnyttelse af de menneskelige tumor prøver i denne protokol blev godkendt af University of Iowa Institutional Review Board (IRB).

1.. Opsætning dagen før Tumor Harvest

1. Coat cellekulturplader: I en steril kultur hætte, tilføje nok poly-L-ornithin (0,01% opløsning) til at dække bunden af ​​en polystyren / plast kultur godt / skål, erstatte låg og lad stå ved stuetemperatur i mindst 2 timer. Glas dias eller dækglas kan erstatte polystyren til eksperimenter, der kræver billeddannelse.
2. Efter 2 timer fjernes poly-L-ornithin løsning med sug og lade pladerne tørre helt i et sterilt kultur hætter. Tilsæt så laminin opløsning (10 ug / ml i ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +-fri} HBSS [HBSS-/ -]) til helt at dække dyrkningspladerne erstatte låg, og derefter enten 1) sted i køligt 4 ° C køleskab natten over, eller 2) placeres i 37 ° C inkubator i mindst 2 timer. Hvis pladernevil blive opbevaret natten over eller længere, pak pladerne i plastikfolie for at forhindre fordampning / udtørring.

2.. Opsætning Dag Tumor Harvest

1. Forbered Kultur Medier: Medier er lavet frisk på dagen for tumor høst og forarbejdning, opbevaret ved 4 ° C, og opvarmes til 37 ° C i inkubator umiddelbart forud for medier tilføjelser / ændringer.
2. Schwannoma dyrkningsmedier er høj-glucose (4,5 mg / ml) DMEM (med phenolrødt) med 0,1 mg / ml penicillin og 0,1 mg / ml streptomycin; N2 medier supplerer endelig fortynding 1:100; Bovint insulin 5 pg / ml; Føtalt bovint serum 10% samlede volumen. Filtrere alle medier gennem 0,22 um filter.
3. Forbered Transport af prøver Cooler: Send en is fyldt køler med 1-2 (afhængig af mængden af tumor, der skal høstes) sterile 50 ml koniske rør med 25 ml HBSS med Ca ^{2 +} / ^{Mg2 +} (HBSS + / +) til operationsstuen for tumor prøve overførsel og transport.
4. Forbered individual tumor dissociation slanger - fylde sterile 2 ml rundbundede rør med 1 ml HBSS + / + og anbring på is. (Tubes skal bruges til skarp dissektion / dissociation af tumor prøver).
5. For dissociation, forberede cirka en dissociation rør for hver 0,5 cm ³ af høstede væv; for eksempel, vil en tumorprøver måler 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm ³⁾ kræver to HBSS + / + dissociation rør.
6. Ultraviolet lys sterilisation: Sted væv saks, små pincet, skalpel håndtag, 1x normal petriskål, P1000 pipette og pipettespidser i en steril kultur hætte og forlade under ultraviolet lys for ~ 15 minutter før ankomst og forarbejdning af tumorvæv.

3.. Prøvetagning Isolering og Transport

1. Isoler tumor prøver af kirurgisk resektion.
2. Umiddelbart placere tumor prøver i det iskolde HBSS + / + så hurtigt som muligt efter udtagning fra en patient. Når alle tissue udtages, transport prøver (på is) fra den operative teater til laboratoriet til videre forarbejdning.

4.. Tissue Dissociation og Findeling

1. Efter standard steril teknik i en laminar flow hætte, bringe konisk rør med tumor prøve i kultur hætte, og vaske prøverne ved at vende røret og tumor 50x. Tillad fragmenter til at falde til bunden af ​​røret, og derefter fjerne HBSS + / +. Fyld med 30 ml HBSS + / + og agitere / vend 50x igen. Gentag fjernelse inversion / medier i alt 4x.
2. Re-suspendere tumorfragmenter i 30 ml HBSS + / + for sidste gang, så hæld blandingen i en sterile100 mm petriskål, og separat tumor i 0,5 cm ³ grupperinger. Hvis større tumorfragmenter er stødt på, bruge væv saks eller skalpel (# 11 eller # 15 klinge) til at skære i mindre stykker.
3. Brug pincet til at placere 0,5 cm ³ vævsgrupper ind i de enkelte HBSS + / + fyldt 2 ml rundbundet keglesnital rør, alle på is. Brug væv saks til hakkekød tumorfragmenter i sub-1 mm fragmenter-suspensionen bør have en 'snowglobe' udseende (figur 1). Hakke tumoren kun indtil de fleste af fragmenterne er sub-1 mm; ikke 'over-hakkekød' tumor prøver. Placer helt hakket væv rør tilbage på is, og gentag med alle yderligere præparatreagensglassene.
4. Overfør alle fragmenterede tumor prøver i en enkelt 15 ml konisk rør. En P1000 pipette med et snit / modificeret steril spids fungerer godt for dette skridt. Brug ekstra HBSS + / + til at skylle / skylle de 2 ml dissociation rør for at sikre alle tumor prøve er indsamlet i 15 ml rør. Spin ned blandingen i centrifuge ved 23 ° C, ved 73 x g i 5 min.
5. Suge fra HBSS + / +, forlader cellepelleten. Re-suspendere fragmenter i 1:1 blanding af 0,25% trypsin: 0,2% collagenase (opløst i HBSS-/ -) - tilføj bare nok til at holde tumorfragmenter i stramme suspension. Sæt skrue-top, og plads i 37 ° C inkubator i 30 min. Omrør celleblanding mindst én gang under inkubationen for at holde fragmenter i suspension. Placer Schwannoma dyrkningsmedier i rugemaskine at varme det på dette tidspunkt så godt.
6. Efter inkubation tilsættes 100 pi FBS til hvert rør for at inaktivere trypsinet, og derefter centrifugeres prøven ved 23 ° C, 73 x g i 5 min. Ved hjælp af en pipette forsigtigt suge slukket så meget supernatant som muligt uden at forstyrre cellepellet. Tilsæt opvarmet dyrkningsmedier (N2/insulin/5% FBS) til tumorfragmenter til en endelig forholdet 01:02 tumorfragmenter: dyrkningsmedium (for eksempel, hvis der er 1 ml tumorfragmenter tilsættes i 2 ml opvarmet medier).
7. Forbered tumor findeling ved at skære spidsen ud af en P1000 pipette tip til en diameter på ca 1-2 mm. Langsomt udriv cellesuspensionen hjælp gradvist mindre og mindre diameter pipettespidser, indtil du nemt kan pipette opløsningen gennem en unaltsærligt dækkede P1000 pipette spids. Umiddelbart flytte til en mindre spids, når du nemt kan pipette tumor løsning gennem spidsen - ikke i løbet udriv prøven. Hvis en enkelt større stykke vævsblokke aspiration under triturering, trykke pipettespidsen på bunden af ​​det koniske rør ofte tillader fortsat triturering.

5.. Celleudpladning

1. Et 0,5 mm ³ fragment af væv er nok til at seede 1 x 100 mm skål eller 4 x 8-well/4-well dias. Lige før at tilføje medierne / celleblandingen fjerne laminin løsning fra dyrkningspladerne men lad ikke pladerne tørre.
2. For hver 100 mm skål, opløses tumorfragment i 10 ml varmet kultur medier.
3. For hver brønd af en 4-godt slide bruge 750 ul varmet kultur medier (3 ml for hele dias).
4. For hver brønd i en 8-godt slide bruge 400 ul varmet kultur medier (3,2 ml for hele dias).
5. Inkubér kulturerne i 37 &# 160; ° C, 100% fugtighed, 6% CO _2. Lad kulturerne alene i mindst 36 timer, og derefter ændre mediet, hvis opløsningen er gulnet (sur). Ellers ændre medierne på 72 timer, så hver 2-3 dage, eller når medierne bliver sure. Hvis mediet bliver sure dagligt i flere dage i træk, det er generelt en indikation af potentiel bakterie eller gær forurening.

Representative Results

Korrekt tumor fragmentering er afgørende for optimal såning og udvækst i vævskulturskåle (figur 1). Identifikation af schwannoma celler under de første dage efter udpladning er ofte vanskeligt på grund af at tilsløre mængder celleaffald og røde blodlegemer. Ved det ^4. eller ^5. dag, vil celle udvidelser nær vedhængende tumorfragmenter skabe genkendelige 'snøring' mønstre blandt murbrokkerne. Efterfølgende medieændringer generelt fjerne størstedelen af ​​ikke-adhærente celler ved den anden uge. Ved hjælp af denne metode, kan forventes 90% sammenløb mellem dag 7-14, afhængigt af den oprindelige vitalitet tumorfragment før hakning og forkromning densitet (figur 2). Som tidligere beskrevet Schwannom kulturer synes at vokse udad fra små fragmenter af adhærente tumorfragmenter ^9,10. En sådan udvækst er påviseligt ved slutningen af den første uge. Figur 2 viser brightfield billeddannelse af schwannoma celleudgroning fra en enkelt tumorfragment, der er skitseret i rødt i nederste højre hjørne Figur 3 illustrerer den "bro" udvækst, der opstår mellem to forskellige tumorfragmenter., i dyrkningsbrønde immunofarvet med polyklonale kanin anti-S100 antistof. Vi rutinemæssigt immunfarve kulturer med anti-S100 eller anti-p75 ^NTR antistoffer til at kontrollere renheden af kulturer og positivt identificere schwannoma celler til analyse (Figur 4). Med disse metoder i> 95% af cellerne i disse kulturer repræsenterer schwannoma celler. Schwannoma celler også mærke med glial fibrillært surt protein (GFAP) og ErbB2, blandt andre markører ^11.

Fig. 1. Sammenligning af samme tumorprøven både før (A) og agterER (B) hakning. prøve fremstillet i 1,5 ml HBSS + / + med Phenolrød i 2,0 ml rund bund konisk rør.

Figur 2.. Typisk udseende kulturer på lysfelt mikroskopi. Spindled schwannoma celleudgroning udstråler fra tumorfragment, billede taget på kultur dag 10. Skala bar = 100 um.

Figur 3.. Immunfarvning af primære vestibulære schwannoma kulturer med anti-S100-antistoffer viser typiske kultur og celle morfologier. A) Lavt strømforbrug, visende udvækst fra belagt tumorfragmenter, kultur dag 14. Skala bar = 200 pm. B) Højere poware visning af schwannoma celler med Spindled morfologi, kultur dag 14. Målestok = 100 um.

Figur 4.. Immunfarvning af primære vestibulære schwannoma kulturer at bekræfte kultur renhed og celle identitet. A) Kulturer immunfarvet med anti-S100-antistoffer. Kerner er mærket med DAPI. Skala bar = 100 um. B) Kulturer immunofarvede med anti-p75 ^NTR antistoffer. Kerner er mærket med DAPI. Målestok = 100 um.

Discussion

Historie af in vitro Schwannoma Cultures

Bestræbelser på at etablere in vitro schwannoma kulturer begyndte blot et par årtier efter den indledende akustiske neuroma åben kirurgisk resektion forekom i 1894 ^12. Den første registrerede kulturer var ved Kredel i 1920'erne, der forgæves har forsøgt at vokse hakket tumor med "hængende dråbe-metoden" ¹² . Senere, Drs. Murray og Stout offentliggjort deres in vitro-dyrkning erfaring med neurilemomas dyrket på størknet humant plasma. Interessant, afslørede denne teknik, at Antoni A og Antoni B specifikke fragmenter voksede forskelligt, med unikke cellulære morfologi og differentierede agar fortætning ^13. Cravioto og Lockwood udgivet yderligere observationer af akustiske neuroma kulturer i fugle blodpropper på dækglas underkjoler og rulle rør. De var også de første til at bruge Rose kamre til time-lapse billeddannelse af tumorvækst 10. Baur kombineret »en bloc« og monolags tilgange i sin publikation, som også vist de mitogene virkninger af laminin-belagt dyrkningspladerne ^9. Fleste efterfølgende publicerede protokoller, som vor, anvende en lignende protokol såning hakket tumorfragmenter på en kultur overfladebehandlet med en ladet aminosyre (poly-L-ornithin, poly-L-lysin) og forberedelse laminin ^8. Vi har anvendt den samme metode til at kultur schwannomas følger ansigtet, trigeminal, vagus og spinale nerver med lignende resultater.

Fordele ved vestibulære Schwannoma primære kulturer

Undersøgelser af menneskelig schwannoma tumorigenesis bruger ofte homogene udødeliggjorte cellelinjer og transgene musemodeller. Disse værktøjer er en fordel, men do ikke nøjagtigt gengive de genotyper, fænotyper og kompleksiteten af ​​sygdom hos mennesker. Derimod primære kulturer sandsynligvis en mere realistisk model. De mere trofast rekapitulere heterogenitet af genomisk og molekylær status forbundet med humane tumorer ^15.

Renheden af Schwannoma Cultures

En udfordring af primær vævskultur er at opretholde målet celle renhed. Schwannomas overvældende består af neoplastiske Schwann celler ^6, men kulturer er ikke immune over for fibroblast forurening. Historisk metoder til optimering schwannoma celle renhed falder i tre kategorier: 1) udvælgelse af kemisk defineret medium og specifikke vækstfaktorer; 2) immunrensning (fx med magnetisk perle celle sortering ^7), 3) en kombination af de to foregående metoder. I vores erfaring fibroblaster eller andre ikke-schwannoma celler omfatter generelt mindre end 5% af cellerne i culture, uanset patientens karakteristika (alder, køn), sporadiske eller NF2 tumorer uden forbindelse, primær eller sekundær tumor resektion, eller cystisk vs solide tumorer. Hvis fibroblaster synes at være at overtage kulturen, vil fjernelse af serum til 1-2 medieændringer reducere denne population uden at påvirke schwannoma celle overlevelse. Pre-behandling cellekultur overflader med laminin letter også vækst schwannoma celle ^9.. Minimal passage af kulturerne også med til at mindske uønsket cellulær forurening - cryostorage er bedst inden for de første to kultur passager og kultur eksperimenter anbefales ikke uden passage 4-5. Vi finde optimale resultater, når kultur eksperimenter er afsluttet ved passage 1-2 med ikke-cryostored celler.

Vi bruger både immunfarvning (anti-S100, DAPI) og mikroskopiske udseende cellulære og kernemorfologi som kvalitetskontrol i vores schwannoma kulturer. Indimellem er deter nyttigt at immunfarve en delmængde af kulturer til monocyt (CD68) eller fibroblast specifikke markører for yderligere at verificere kultur renhed ^9. Under eksperimentelle analyser af celle adfærd (fx proliferation eller celledød), vi altid immunfarve med anti-S100 eller anti-p75 ^NTR antistoffer til at verificere, at resultaterne er schwannoma celle specifikke.

Kultur morfologi og vækstmønstre

Schwannoma tumor kulturer typisk vise unikke vækstmønstre minder om Antoni A (høj celledensitet, stramt organiseret, indikationer af Verocay krop formationer) og sjældent af Antoni B (forholdsvis sparsomme kerner, rigelige cellulære processer, mindre organisation) mønstre ses i histopatologi resekterede schwannoma tumorer ^16. Næsten alle schwannoma celler vise den klassiske lange, Spindled, bipolar celle form forbundet med både Schwann og schwannoma celler ^6,17 dog andre celle morphologier, som beskrevet af Cravioto (Amoeboid Mikroglia-lignende celler, spindel-formede celler, Racket-Shaped celler og Kite-formede Cells) undertiden forekomme ^14. Samlet set cellevækst og-formering er meget langsomme i vores base medium (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 supplement). Tilsætning af kendte mitogene faktorer, såsom forskolin og β1-neuregulin øger celleproliferation ^18.

Kritiske protokol

Vores schwannoma vævskultur protokol er enkel og forholdsvis tilgivende; men der er flere vigtige skridt, der sikrer succes. Først rette tumor håndtering er kritisk. Forvent det bedste resultat, når tumor er placeret direkte i iskold HBSS + / + snarest engang fjernes fra patienten. Dette er i strid med den sædvanlige kirurgiske praksis at indsamle resekterede tumor i sterilt saltvand og derefter sende det samlede væv til behandling i patologi ved afslutningen af ​​sagen. For det andet, holder væv Samples så køligt som muligt under behandlingen. Det er afgørende, at den resekterede tumor holdes iskold, og at behandlingen sker som hurtigt som muligt, efter fjernelse. Gøre så meget af vævsbehandling som muligt på is samt. For det tredje, aggressivt vaske tumor prøver. Dette hjælper med at reducere risikoen for bakteriel eller gær forurening. For det fjerde, ikke over-hakkekød tumor prøver. Tumor trituration afhænger af en semi-subjektive vurdering af, hvornår de skal fortsætte med en mindre diameter P1000 pipette spids.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components