Summary
Vestibular Schwannomas (वीएसएस) NF2 ट्यूमर शमन जीन में परिवर्तन के साथ जुड़े श्वान सेल (अनुसूचित जाति) मूल के गैर घातक ट्यूमर, कर रहे हैं. हम आणविक और सेलुलर प्रयोगात्मक हेरफेर और विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और मानव रोग की विषम प्रकृति का स्मरण दिलाता है कि सेल संस्कृति वी.एस. प्राथमिक मानव के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, कुशल प्रोटोकॉल की रिपोर्ट.
Abstract
Vestibular schwannomas (वीएसएस) सभी अंतर्कपालीय अर्बुद का 10% से समझौता किए, श्वान सेल vestibular तंत्रिका की (अनुसूचित जाति) ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं. वीएसएस दोनों NF2 ट्यूमर शमन में निष्क्रिय दोष के साथ जुड़े छिटपुट या पारिवारिक या तो (neurofibromatosis टाइप 2, NF2) रूपों में पाए जाते हैं जीन. वीएसएस के लिए उपचार हालांकि ऐसी प्रक्रियाओं की रुग्णता कम आक्रामक उपचार की जांच प्रेरित किया है, आम तौर पर शल्य लकीर या रेडियोसर्जरी है. ऐतिहासिक, ताजा ऊतक नमूनों के लिए उपयोग और schwannoma कोशिकाओं अमर नहीं कर रहे हैं कि तथ्य की कमी काफी schwannoma tumorigenesis की जांच के लिए प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग बाधा है. प्राथमिक संस्कृतियों की सीमित आपूर्ति पर काबू पाने, अमर HEI193 वी.एस. सेल लाइन एचपीवी E6 और E7 ओंकोजीन साथ पारगमन द्वारा उत्पन्न किया गया था. इस oncogenic पारगमन मानव के लिए एक मॉडल के रूप में उनके उपयोग की सीमा कोशिकाओं है, जो करने के लिए महत्वपूर्ण आणविक और प्ररूपी परिवर्तन की शुरुआत कीchwannoma ट्यूमर. इसलिए हम कोशिकाओं वी.एस. प्राथमिक मानव की संस्कृति के लिए एक सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल वर्णन. यह आसानी से महारत हासिल तकनीक और अधिक सही वी.एस. रोग की जटिलता पुनरावृत्ति कि आणविक और सेलुलर जांच के लिए अनुमति देता है.
Introduction
Vestibular schwannomas (वीएसएस) सभी अंतर्कपालीय अर्बुद 1-3 की 10% से समझौता किए, श्वान सेल vestibular तंत्रिका की (अनुसूचित जाति) ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं. वीएसएस दोनों NF2 ट्यूमर शमन में निष्क्रिय दोष के साथ जुड़े छिटपुट या पारिवारिक या तो (neurofibromatosis टाइप 2, NF2) रूपों में पाए जाते हैं जीन. वीएसएस के लिए उपचार हालांकि ऐसी प्रक्रियाओं की रुग्णता बहरापन, चेहरे न्यूरोपैथी, रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ लीक, असंतुलन, और ट्यूमर regrowth 1 शामिल हैं, आम तौर पर शल्य लकीर या रेडियोसर्जरी है. इसके साथ ही नहीं सभी रोगियों को स्वीकार्य शल्य चिकित्सा या विकिरण उम्मीदवार हैं. वैकल्पिक चिकित्सा के इस तरह के महत्वपूर्ण रुग्णता के साथ ही एक कमी उपन्यास उपचार 3,4 के विकास की उम्मीद में वीएसएस का अनूठा आणविक जीव विज्ञान में जांच को प्रेरित किया है.
सेल संस्कृति संभावित चिकित्सीय कॉम की आणविक और सेलुलर व्यवहार और स्क्रीनिंग की, तेजी से सुगम, और में गहराई से विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैपाउंड. ऐतिहासिक, ताजा ऊतक नमूनों के लिए उपयोग और schwannoma कोशिकाओं अमर नहीं कर रहे हैं कि तथ्य की कमी काफी schwannoma tumorigenesis की जांच के लिए प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग बाधा है. प्राथमिक संस्कृतियों की सीमित आपूर्ति पर काबू पाने, अमर HEI193 वी.एस. सेल लाइन एचपीवी E6 और E7 ओंकोजीन 5 के साथ पारगमन द्वारा उत्पन्न किया गया था. इस oncogenic पारगमन मानव schwannoma ट्यूमर के लिए एक मॉडल के रूप में उनके उपयोग की सीमा कोशिकाओं है, जो करने के लिए महत्वपूर्ण आणविक और प्ररूपी परिवर्तन की शुरुआत की. एक कार्यात्मक NF2 जीन की कमी है कि ट्रांसजेनिक माउस लाइनों से व्युत्पन्न अनुसूचित जाति संस्कृतियों इन विट्रो में NF2 निर्भर अनुसूचित जाति tumorigenesis की जांच के लिए एक और विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन संस्कृतियों हालांकि मानव विशिष्ट व्यवहार के लिए मानव वीएसएस या खाते की विषम प्रकृति पुनरावृत्ति करने में विफल. हाल पिछले वी.एस. संस्कृति तकनीक अपेक्षाकृत लंबे समय प्रसंस्करण और जटिल चयनात्मक संस्कृति तकनीक 6-8 की आवश्यकता है.Immunostaining द्वारा निर्धारित रूप में यहाँ हम 95% ट्यूमर सेल शुद्धता के साथ 3 घंटा तहत में पूरा प्रसंस्करण के साथ सेल संस्कृति वी.एस. प्राथमिक के लिए एक सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल, उपस्थित थे.
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Protocol
आचार विवरण: इस प्रोटोकॉल में मानव ट्यूमर नमूनों का उपयोग आयोवा संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था.
1. सेटअप दिन के ट्यूमर से पहले हार्वेस्ट
- कोट सेल संस्कृति प्लेटों: एक बाँझ संस्कृति हुड में, पलकों की जगह, एक polystyrene / प्लास्टिक संस्कृति अच्छी तरह / डिश के नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त पाली एल ओर्निथिन (0.01% समाधान) जोड़ने के लिए, और कम से कम के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं 2 घंटा. कांच स्लाइड या coverslips इमेजिंग की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए polystyrene के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
- 2 घंटे के बाद, सक्शन साथ पाली एल ओर्निथिन समाधान निकालने और प्लेटें एक बाँझ संस्कृति डाकू में पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं. पर्याप्त laminin समाधान जोड़ें (सीए 2 में 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर + / 2 मिलीग्राम + मुक्त HBSS [HBSS-/ -]) पूरी तरह से संस्कृति प्लेटों को कवर करने के लिए, पलकों की जगह है, तो रातोंरात शांत 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में 1) जगह है, या तो या 2) कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह है. यदि प्लेटेंरात भर या उससे अधिक समय संग्रहीत किया जाएगा, वाष्पीकरण / सुखाना रोकने के लिए प्लास्टिक की चादर में प्लेटें लपेटो.
2. सेटअप ट्यूमर फसल के दिन
- तैयार करें संस्कृति मीडिया: मीडिया, ट्यूमर फसल और प्रसंस्करण के दिन पर ताजा किया 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, और तुरंत पहले मीडिया परिवर्धन / परिवर्तन करने के लिए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है.
- Schwannoma संस्कृति मीडिया 0.1 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन और 0.1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ उच्च ग्लूकोज (4.5 मिलीग्राम / एमएल) (फिनोल लाल के साथ) DMEM है; एन 2 मीडिया अंतिम कमजोर पड़ने 1:100 के पूरक; गोजातीय इंसुलिन 5 ग्राम / मिलीलीटर; 10% कुल मात्रा भ्रूण गोजातीय सीरम. 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सभी मीडिया फिल्टर.
- नमूना परिवहन कूलर तैयार: ऑपरेटिंग कमरे के लिए 2 + (HBSS + + /) सीए 2 + / मिलीग्राम के साथ 25 मिलीलीटर HBSS के साथ बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (काटा जा ट्यूमर की मात्रा पर निर्भर करता है) 1-2 के साथ एक बर्फ से भरे कूलर भेजें ट्यूमर का नमूना स्थानांतरण और परिवहन के लिए.
- व्यक्ति को तैयारidual ट्यूमर हदबंदी ट्यूब - 1 HBSS + + / मिलीलीटर और बर्फ पर जगह के साथ दौर बाँझ 2 मिलीलीटर नीचे ट्यूब भरना. (ट्यूब ट्यूमर के नमूनों की तेज विच्छेदन / हदबंदी के लिए उपयोग किया जाएगा).
- हदबंदी के लिए, काटा ऊतक के हर 0.5 सेमी 3 के लिए लगभग एक हदबंदी ट्यूब तैयार; उदाहरण के लिए, 1.0 x 1.0 x 1.0 सेमी (1 सेमी 3) को मापने के लिए एक ट्यूमर नमूना दो HBSS + + / हदबंदी ट्यूबों की आवश्यकता होगी.
- पराबैंगनी प्रकाश नसबंदी: जगह ऊतक कैंची, छोटे संदंश, स्केलपेल संभाल, 1x सामान्य पेट्री डिश, P1000 विंदुक, और एक बाँझ संस्कृति हुड में पिपेट टिप्स, और ~ के लिए पराबैंगनी प्रकाश के तहत छोड़ पूर्व ट्यूमर के ऊतक के आगमन और प्रसंस्करण के लिए 15 मिनट.
3. नमूना अलगाव और परिवहन
- शल्य लकीर से ट्यूमर नमूनों को अलग.
- इसके तत्काल बाद रोगी से हटाने के बाद जितनी जल्दी संभव ठंडा HBSS + + / में ट्यूमर नमूनों जगह है. एक बार सभी Tissuई नमूने आगे की प्रक्रिया के लिए प्रयोगशाला को ऑपरेटिव थिएटर से, (बर्फ पर) परिवहन के नमूने एकत्र कर रहे हैं.
4. ऊतक हदबंदी और Trituration
- एक लामिना का प्रवाह हुड में मानक बाँझ तकनीक के बाद, संस्कृति हुड में ट्यूमर नमूना साथ शंक्वाकार ट्यूब लाने, और ट्यूब और ट्यूमर 50x inverting द्वारा नमूने धो लो. टुकड़े ट्यूब के नीचे गिर जाते हैं, और फिर HBSS + + / हटाने की अनुमति. 30 मिलीलीटर HBSS + + / के साथ फिर से भरना, और आंदोलन / फिर 50x पलटना. 4x की कुल के लिए उलटा / मीडिया हटाने दोहराएँ.
- 30 मिलीलीटर HBSS + + / पिछली बार के लिए, तो एक sterile100 मिमी पेट्री डिश में मिश्रण डालना, और अलग ट्यूमर 0.5 सेमी में 3 समूहों में ट्यूमर के टुकड़े को निलंबित पुनः. बड़े ट्यूमर के टुकड़े का सामना कर रहे हैं, छोटे टुकड़ों में कटौती करने के लिए ऊतक कैंची या छुरी (# 11 या # 15 ब्लेड) का उपयोग करें.
- व्यक्तिगत HBSS + + / भरा में 0.5 सेमी 3 ऊतक समूहों जगह संदंश का प्रयोग, 2 मिलीलीटर दौर नीचे शांकवसभी बर्फ पर अल ट्यूब,. एक 'snowglobe' उपस्थिति चित्रा (1) होना चाहिए उप 1 मिमी टुकड़े निलंबन में ट्यूमर टुकड़े कीमा ऊतक कैंची का प्रयोग करें. टुकड़े के बहुमत उप 1 मिमी हैं केवल जब तक ट्यूमर क़ीमा; नहीं 'पर कीमा' ट्यूमर के नमूनों से करते हैं. बर्फ पर वापस पूरी तरह से कीमा बनाया हुआ ऊतक ट्यूब प्लेस, और सभी अतिरिक्त नमूना ट्यूबों के साथ दोहराएँ.
- एक एकल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी खंडित ट्यूमर के नमूनों स्थानांतरण. एक कट / संशोधित बाँझ टिप के साथ एक P1000 विंदुक इस कदम के लिए अच्छी तरह से काम करता है. प्रयोग अतिरिक्त HBSS + + / सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूमर का नमूना 15 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्र किया गया है बनाने के लिए 2 मिलीलीटर हदबंदी ट्यूब कुल्ला / फ्लश करने के लिए. 5 मिनट के लिए 73 XG पर, 23 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र में मिश्रण स्पिन.
- सेल गोली छोड़ रहा है, HBSS + + / बंद सक्शन. 0.25% trypsin के 1:1 मिश्रण में टुकड़े पुनः निलंबित: (HBSS-/ में भंग -) - 0.2% collagenase में ट्यूमर के टुकड़े रखने के लिए अभी काफी जोड़ तंग सुspension. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पेंच टॉप, और जगह बदलें. निलंबन में टुकड़े रखने के लिए ऊष्मायन के दौरान कम से कम एक बार सेल मिश्रण आंदोलन. साथ ही इस समय यह गर्म करने के लिए इनक्यूबेटर में schwannoma संस्कृति मीडिया रखें.
- ऊष्मायन के बाद, 23 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 73 XG पर trypsin निष्क्रिय करने के लिए प्रत्येक ट्यूब 100 μl FBS जोड़ने, और तब नमूना अपकेंद्रित्र. एक विंदुक का प्रयोग, ध्यान से सेल गोली परेशान बिना जितना संभव सतह पर तैरनेवाला बंद चूषण. 01:02 ट्यूमर टुकड़े के अंतिम अनुपात में ट्यूमर टुकड़ों को गर्म संस्कृति मीडिया (N2/insulin/5% FBS) जोड़ें: संस्कृति मीडिया (उदाहरण के लिए, ट्यूमर के टुकड़े के 1 मिलीग्राम है, तो गरम के 2 मिलीलीटर में जोड़ मीडिया).
- लगभग 1-2 मिमी की एक व्यास के लिए एक P1000 विंदुक टिप के बंद टिप काटने से ट्यूमर विचूर्णन के लिए तैयार करें. आप आसानी से एक unalt के माध्यम से समाधान पिपेट कर सकते हैं जब तक धीरे धीरे, उत्तरोत्तर और छोटे छोटे व्यास पिपेट सुझावों का उपयोग सेल निलंबन triturateजुटी P1000 विंदुक टिप. आप आसानी से टिप के माध्यम से ट्यूमर समाधान पिपेट कर सकते हैं एक बार तुरंत एक छोटे टिप करने के लिए कदम - से अधिक नमूना triturate नहीं है. शंक्वाकार ट्यूब के तल पर पिपेट टिप दोहन विचूर्णन दौरान ऊतक ब्लॉक आकांक्षा का एक भी बड़ा टुकड़ा, अक्सर निरंतर विचूर्णन की अनुमति देता है.
5. सेल चढ़ाना
- ऊतक से एक 0.5 मिमी 3 टुकड़ा 1 x 100 मिमी पकवान, या 4 एक्स 8-well/4-well स्लाइड बीज के लिए पर्याप्त है. बस से पहले मीडिया / सेल मिश्रण जोड़ने के लिए, संस्कृति प्लेटों से laminin समाधान निकालने पर प्लेट्स सूखा नहीं है.
- प्रत्येक 100 मिमी पकवान के लिए, 10 मिलीलीटर गरम संस्कृति मीडिया में ट्यूमर टुकड़ा भंग.
- एक 4 अच्छी तरह से स्लाइड में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से, 750 μl गर्म संस्कृति मीडिया (साबुत स्लाइड के लिए 3 मिलीग्राम) का उपयोग करें.
- एक 8 अच्छी तरह से स्लाइड में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से, 400 μl गर्म संस्कृति मीडिया (साबुत स्लाइड के लिए 3.2 मिलीग्राम) का उपयोग करें.
- 37 और में संस्कृतियों सेते# 160; डिग्री सेल्सियस, 100% नमी, 6% सीओ 2. कम से कम 36 घंटे के लिए अकेले संस्कृतियों छोड़ दो, और उसके समाधान (अम्लीय) yellowed है अगर मीडिया बदल जाते हैं. वरना तो हर 2-3 दिनों या मीडिया अम्लीय हो जाते हैं, 72 घंटा में मीडिया बदल जाते हैं. मीडिया एक पंक्ति में कई दिनों के लिए दैनिक अम्लीय हो जाता है, यह आम तौर पर संभावित जीवाणु या खमीर संदूषण का एक संकेत है.
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Representative Results
सही ट्यूमर विखंडन टिशू कल्चर व्यंजन में इष्टतम बोने और परिणाम (चित्रा 1) के लिए आवश्यक है. चढ़ाना के बाद पहले दिन के दौरान schwannoma कोशिकाओं की पहचान की वजह से सेलुलर मलबे और लाल रक्त कोशिकाओं की मात्रा obscuring के लिए, अक्सर मुश्किल होता है. 4 वें या 5 वें दिन तक, पक्षपाती ट्यूमर के टुकड़े के पास सेल एक्सटेंशन मलबे के बीच पैटर्न 'जाली' पहचानने योग्य बनाएगा. बाद में मीडिया में परिवर्तन आम तौर पर दूसरे सप्ताह से गैर पक्षपाती कोशिकाओं के बहुमत को हटा दें. इस विधि का प्रयोग, 90% संगम दिनों 7-14 के बीच उम्मीद की जा सकती, पूर्व (चित्रा 2) क़ीमा और घनत्व चढ़ाना ट्यूमर टुकड़ा के प्रारंभिक जीवन शक्ति पर निर्भर करता है. पहले से वर्णित है, schwannoma संस्कृतियों पक्षपाती ट्यूमर टुकड़े 9,10 के छोटे टुकड़े से बाहर की ओर बढ़ने के लिए दिखाई देते हैं. इस तरह के परिणाम पहले सप्ताह के अंत तक detectable है. 2 से पता चलता बी चित्रानिचले सही कोने में लाल रंग में उल्लिखित एक ही ट्यूमर टुकड़ा, से schwannoma सेल परिणाम की rightfield इमेजिंग. 3 दो अलग ट्यूमर टुकड़े के बीच होता है कि 'ब्रिजिंग' परिणाम दिखाता है चित्रा, संस्कृति कुओं में पॉलीक्लोनल खरगोश विरोधी S100 एंटीबॉडी के साथ immunostained. हम नियमित रूप से संस्कृतियों की शुद्धता को सत्यापित करने और सकारात्मक (चित्रा 4) के विश्लेषण के लिए schwannoma कोशिकाओं की पहचान करने के लिए विरोधी S100 या विरोधी P75 एनटीआर एंटीबॉडी के साथ संस्कृतियों immunostain. इन तरीकों के साथ इन संस्कृतियों में कोशिकाओं के 95>% से अधिक schwannoma कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. Schwannoma कोशिकाओं को भी अन्य मार्करों 11 के बीच glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और ErbB2, के साथ लेबल.
चित्रा 1. (क) से पहले और पीछे दोनों ही ट्यूमर नमूना की तुलनाईआर (बी) क़ीमा. नमूना 1.5 मिलीलीटर 2.0 मिलीलीटर में phenol लाल के साथ HBSS + + / दौर नीचे शंक्वाकार ट्यूब में तैयार किया.
चित्रा 2. Brightfield माइक्रोस्कोपी पर संस्कृतियों की विशिष्ट उपस्थिति. Spindled schwannoma सेल परिणाम ट्यूमर टुकड़ा से radiates, संस्कृति 10 दिन पर लिया छवि. स्केल बार = 100 माइक्रोन.
विरोधी S100 एंटीबॉडी विशिष्ट संस्कृति और सेल morphologies प्रदर्शन के साथ प्राथमिक vestibular schwannoma संस्कृतियों का आंकड़ा 3. Immunostaining. मढ़वाया ट्यूमर टुकड़े, संस्कृति दिन 14. स्केल बार = 200 माइक्रोन. बी से ए) कम बिजली देखें illustrating परिणाम) हायर पाउspindled आकृति विज्ञान, संस्कृति दिन 14. स्केल बार = 100 माइक्रोन के साथ schwannoma कोशिकाओं के एर देखें.
संस्कृति पवित्रता और सेल पहचान की पुष्टि करने के लिए प्राथमिक vestibular schwannoma संस्कृतियों के 4. Immunostaining चित्रा. ए) संस्कृति विरोधी S100 एंटीबॉडी के साथ immunostained. नाभिक DAPI के साथ लेबल रहे हैं. विरोधी P75 एनटीआर एंटीबॉडी के साथ immunostained स्केल बार = 100 माइक्रोन. बी) संस्कृतियों. नाभिक DAPI के साथ लेबल रहे हैं. = 100 माइक्रोन स्केल बार.
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Discussion
इन विट्रो schwannoma संस्कृति का इतिहास
इन विट्रो schwannoma संस्कृतियों में स्थापित करने के प्रयासों खुला शल्य लकीर 1894 12 में हुई प्रारंभिक ध्वनिक न्युरोमा के बाद बस कुछ ही दशकों में शुरू किया. पहले दर्ज संस्कृतियों असफल "फांसी ड्रॉप विधि" 12 से कीमा ट्यूमर विकसित करने का प्रयास किया, जो 1920 के दशक में Kredel से थे . बाद में, डीआरएस. मरे और मोटा पका मानव प्लाज्मा पर हो neurilemomas साथ उनकी इन विट्रो संस्कृति का अनुभव प्रकाशित. दिलचस्प बात यह है कि इस तकनीक को Antoni एक और Antoni बी विशिष्ट टुकड़े अगर द्रवीकरण 13 की अद्वितीय सेलुलर आकारिकी और अंतर दरों के साथ, अलग ढंग से बढ़ी है कि पता चला. Cravioto और लॉकवुड coverglass निकल जाता है और रोलर ट्यूब पर एवियन थक्के में ध्वनिक न्युरोमा संस्कृतियों के आगे टिप्पणियों को प्रकाशित किया. उन्होंने यह भी ट्यूमर के विकास के समय चूक इमेजिंग के लिए गुलाब कक्षों का उपयोग करने के लिए पहले किए गए
Vestibular schwannoma प्राथमिक संस्कृतियों के लाभ
मानव schwannoma tumorigenesis का अध्ययन अक्सर समरूप अमर सेल लाइनों और ट्रांसजेनिक चूहों मॉडल का उपयोग करें. ऐसे उपकरण लाभकारी लेकिन घओ सही जीनोटाइप, phenotypes, और मानव रोग की जटिलता को प्रतिबिंबित नहीं. इसके विपरीत, प्राथमिक संस्कृतियों की संभावना एक अधिक यथार्थवादी मॉडल प्रदान करते हैं. वे और अधिक ईमानदारी से मानव ट्यूमर 15 के साथ जुड़े जीनोमिक और आणविक स्थिति की विविधता पुनरावृत्ति.
Schwannoma संस्कृति की पवित्रता
प्राथमिक टिशू कल्चर के एक चुनौती लक्ष्य सेल पवित्रता को बनाए रखने की है. Schwannomas घने neoplastic श्वान कोशिकाओं 6 से मिलकर, हालांकि संस्कृतियों fibroblast संक्रमण से प्रतिरक्षा नहीं कर रहे हैं. ऐतिहासिक दृष्टि से, तीन श्रेणियों में schwannoma सेल पवित्रता गिरावट के अनुकूलन के लिए तरीके: रासायनिक परिभाषित मध्यम और विशिष्ट वृद्धि कारकों द्वारा 1) चयन; चुंबकीय मनका सेल 7 छँटाई के साथ 2) immunopurification (जैसे,), 3) पूर्ववर्ती तरीकों दोनों के संयोजन. हमारे अनुभव fibroblasts या अन्य गैर schwannoma कोशिकाओं आम तौर पर cultu में कोशिकाओं का कम है कि 5% शामिल मेंपरवाह किए बिना रोगी विशेषताओं (आयु, लिंग), छिटपुट या NF2 जुड़े ट्यूमर, प्राथमिक या माध्यमिक ट्यूमर लकीर, या ठोस ट्यूमर के प्रकार बनाम पित्ताशय की, फिर से. Fibroblasts संस्कृति पर ले जा रही हो दिखाई देते हैं, तो 1-2 मीडिया परिवर्तन के लिए सीरम को दूर करने के लिए काफी प्रतिकूल schwannoma सेल अस्तित्व को प्रभावित किए बिना इस आबादी कम हो जाएगा. Laminin साथ सेल संस्कृति सतहों पूर्व इलाज भी schwannoma सेल के विकास 9 की सुविधा. Cryostorage सबसे पहले दो संस्कृति अंश के भीतर पूरा हो गया है, और संस्कृति प्रयोग बीतने 4-5 से परे की सिफारिश नहीं है - संस्कृतियों का न्यूनतम passaging भी अवांछित सेलुलर संदूषण को कम करने में मदद करता है. संस्कृति प्रयोग गैर cryostored कोशिकाओं के साथ पारित होने में 1-2 से पूरा हो गया है जब हम इष्टतम परिणाम लगता है.
हम immunostaining (एंटी S100, DAPI) और हमारे schwannoma संस्कृतियों में गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के रूप में सेलुलर और परमाणु आकारिकी की सूक्ष्म उपस्थिति दोनों का उपयोग करें. कभी कभी यहआगे संस्कृति पवित्रता 9 सत्यापित करने के लिए एककेंद्रकश्वेतकोशिका (CD68) या fibroblast विशिष्ट मार्करों के लिए संस्कृतियों का एक सबसेट immunostain के लिए उपयोगी है. सेल व्यवहार (जैसे, प्रसार या कोशिका मृत्यु) की प्रयोगात्मक विश्लेषण के दौरान, हम हमेशा निष्कर्ष विशिष्ट schwannoma सेल हैं कि सत्यापित करने के लिए विरोधी S100 या विरोधी P75 एनटीआर एंटीबॉडी के साथ immunostain.
संस्कृति आकृति विज्ञान और विकास पैटर्न
Schwannoma ट्यूमर संस्कृतियों आमतौर पर अनोखी विकास पैटर्न (, उच्च घनत्व सेल कसकर संगठित, Verocay शरीर संरचनाओं का संकेत) Antoni एक की याद ताजा करती है और शायद ही कभी Antoni बी (अपेक्षाकृत विरल नाभिक, प्रचुर मात्रा में सेलुलर प्रक्रियाओं, कम संगठन) resected schwannoma के ऊतकविकृतिविज्ञानी में देखा पैटर्न प्रदर्शित 16 ट्यूमर. लगभग सभी schwannoma कोशिकाओं श्वान और schwannoma कोशिकाओं 6,17 हालांकि अन्य सेल Morpho दोनों के साथ जुड़े क्लासिक लंबा, spindled, द्विध्रुवी सेल आकार प्रदर्शितLogies, Cravioto (अमीबाभ Microglia कोशिकाओं की तरह, धुरी के आकार की कोशिकाओं, रैकेट के आकार की कोशिकाओं, और पतंग के आकार की कोशिकाओं) द्वारा वर्णित के रूप में कभी कभी 14 होते हैं. कुल मिलाकर, सेल के विकास और प्रसार के लिए हमारे आधार मध्यम (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 पूरक) में बहुत धीमी गति से कर रहे हैं. ऐसे forskolin और β1-Neuregulin के रूप में जाना जाता है mitogenic कारकों के अलावा काफी सेल प्रसार 18 बढ़ जाती है.
क्रिटिकल प्रोटोकॉल कदम
हमारे schwannoma टिशू कल्चर प्रोटोकॉल सरल और काफी क्षमा है; हालांकि सफलता सुनिश्चित है कि कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सबसे पहले, सही ट्यूमर से निपटने के लिए महत्वपूर्ण है. ट्यूमर के रूप में जल्द ही एक बार रोगी से हटा संभव के रूप में ठंडा HBSS + + / में सीधे रखा जाता है जब सबसे अच्छा परिणाम की उम्मीद है. यह बाँझ खारा तो मामले के अंत में विकृति में प्रसंस्करण के लिए कुल ऊतक भेजने में resected ट्यूमर एकत्रित की सामान्य शल्य चिकित्सा अभ्यास के विपरीत है. दूसरा, ऊतक samp रखनाप्रोसेसिंग के दौरान जितना संभव हो शांत लेस. यह resected ट्यूमर बर्फ का ठंडा रखा जाता है कि महत्वपूर्ण है, और कि प्रसंस्करण हटाने के बाद यथासंभव जल्दी से उत्पन्न होती है. के रूप में अच्छी तरह से बर्फ पर संभव के रूप में ऊतक प्रसंस्करण के रूप में इतना भी नहीं. तीसरा, आक्रामक तरीके से ट्यूमर के नमूनों धो लो. यह जीवाणु या खमीर संक्रमण के जोखिम को कम करने में मदद करता है. चौथा, पर-कीमा ट्यूमर नमूनों नहीं करते. ट्यूमर विचूर्णन एक छोटे व्यास P1000 विंदुक टिप के साथ पर जारी रखने के लिए जब एक अर्द्ध व्यक्तिपरक आकलन पर निर्भर करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष का खुलासा करने के लिए.
Acknowledgments
समर्थन: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040 -17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
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