Summary
Vestibulär Schwannomas (VSS) är icke-maligna tumörer Schwann cell (SC) ursprung av, i samband med mutationer i NF2 tumörsuppressorgenen. Vi rapporterar en reproducerbar, effektivt protokoll för primär mänsklig VS cellkultur som möjliggör molekylära och cellulära experimentell manipulation och analys och rekapitulerar den heterogena karaktären av mänskliga sjukdomar.
Abstract
Vestibulära schwannomas (VSS) representerar Schwann cell (SC) tumörer i vestibulära nerven, kompromissa 10% av alla intrakraniella tumörer. VSS förekommer i antingen sporadiska eller familjära (Neurofibromatos typ 2, NF2) former, både i samband med inaktive defekter i NF2 tumorsuppressoren genen. Behandling för VSS är i allmänhet kirurgisk resektion eller strålkirurgi, men dödligheten i sådana förfaranden har drivit utredningar av mindre invasiva behandlingar. Historiskt sett har bristande tillgång till färska vävnadsprover och det faktum att schwannom celler inte förevigade avsevärt försvåras användningen av primärkulturer för utredning av schwannom tumörbildning. För att övervinna den begränsade tillgången på primära kulturer, var den immortaliserade HEI193 VS cellinje genereras genom transduktion med HPV E6-och E7-onkogener. Denna onkogen transduktion infört betydande molekylära och fenotypiska förändringar till cellerna, vilket begränsar deras användning som modell för mänskliga schwannoma tumörer. Vi illustrerar därför en förenklad, reproducerbar protokoll för odling av primära humana VS celler. Denna lätt behärskar tekniken möjliggör molekylära och cellulära utredningar som mer exakt rekapitulera komplexiteten i VS sjukdom.
Introduction
Vestibulära schwannomas (VSS) representerar Schwann cell (SC) tumörer i vestibulära nerven, kompromissa 10% av alla intrakraniella tumörer 1-3. VSS förekommer i antingen sporadiska eller familjära (Neurofibromatos typ 2, NF2) former, både i samband med inaktive defekter i NF2 tumorsuppressoren genen. Behandling för VSS är i allmänhet kirurgisk resektion eller strålkirurgi, men dödligheten i sådana förfaranden inkluderar dövhet, ansikts neuropatier, ryggmärgsvätskan läcka, obalans, och tumöråterväxt 1. Dessutom inte alla patienter är acceptabla kirurgiskt eller strålnings kandidater. En sådan hög sjuklighet samt en brist på alternativa terapier har drivit utredningen i det unika molekylärbiologi av VSS i hopp om att utveckla nya behandlingar 3,4.
Cellodlings möjliggör snabb, lättköpt, och djupgående analys av molekylära och cellulära beteende och screening av potentiella terapeutiska compounds. Historiskt sett har bristande tillgång till färska vävnadsprover och det faktum att schwannom celler inte förevigade avsevärt försvåras användningen av primärkulturer för utredning av schwannom tumörbildning. För att övervinna den begränsade tillgången på primära kulturer, var den immortaliserade HEI193 VS cellinje genereras genom transduktion med HPV E6-och E7-onkogener 5. Denna onkogen transduktion infört betydande molekylära och fenotypiska förändringar till cellerna, vilket begränsar deras användning som modell för mänskliga schwannom tumörer. SC kulturer som härrör från transgena mus linjer som saknar en funktionell NF2 gen representerar ett annat alternativ för att undersöka NF2-beroende SC tumorigenesis in vitro. Dessa kulturer misslyckas dock att rekapitulera den heterogena karaktären av mänskligt VSS eller konto för mänsklig specifikt beteende. De flesta tidigare VS odlingstekniker krävs relativt långa handläggningstider och komplicerade selektiva odlingstekniker 6-8.Här presenterar vi en enkel, reproducerbar protokoll för primär VS cellodling med fullständig bearbetning på under 3 timmar, med 95% av tumörceller renhet bestämd genom immunfärgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Uttalande: användning av humana tumörprover i detta protokoll godkändes av University of Iowa Institutional Review Board (IRB).
1. Setup dagen innan tumör Harvest
- Coat cellodlingsplattor: I en steril kultur huva, lägga tillräckligt med poly-L-ornitin (0,01% lösning) för att täcka botten av en polystyren / plast kultur väl / skål, byt locken och låt vila i rumstemperatur i minst 2 tim. Glas eller täckglas kan ersätta polystyren för experiment som kräver avbildning.
- Efter 2 timmar, ta bort poly-L-ornitin-lösning med sugning och låta plattorna torka helt i ett sterilt odlings huvor. Lägg tillräckligt med laminin lösning (10 mikrogram / ml i Ca2 + / Mg2 +-fri HBSS [HBSS-/ -]) för att helt täcka odlingsplattor, byta lock, sedan antingen 1) plats i svalt 4 ° C kylskåp över natten, eller 2) placeras i 37 ° C inkubator i åtminstone 2 timmar. Om plattorlagras över natten eller längre, linda plattorna i plastfolie för att förhindra avdunstning / uttorkning.
2. Inställning Dag Tumör Harvest
- Förbered Kultur Media: Media görs färskt på dagen för tumör skörd och bearbetning, förvaras vid 4 ° C, och värms till 37 ° C i inkubator omedelbart före media tillägg / ändringar.
- Schwannom odlingsmedia är hög-glukos (4,5 mg / ml) DMEM (med fenolrött) med 0,1 mg / ml penicillin och 0,1 mg / ml streptomycin; N2 medier kompletterar slutlig spädning 1:100; Bovint insulin 5 | j, g / ml; Fetalt bovint serum till 10% totala volymen. Filtrera alla medier genom 0,22 ìm filter.
- Förbered Specimen Transport Kylare: Skicka ett is fylld kylare med 1-2 (beroende på mängden av tumör som ska skördas) sterila 50 ml koniska rör med 25 ml HBSS med Ca2 + / Mg2 + (HBSS + / +) på operationssalen för överföring och transport tumörprov.
- Förbered individual tumör dissociation rör - fylla sterila 2 ml rundbottnade rör med 1 ml HBSS + / + och placera på is. (Rören kommer att användas för skarp dissektion / dissociation av tumörprover).
- För dissociation, förbereda ungefär en dissociation rör för varje 0,5 cm 3 av skördad vävnad; till exempel, kommer ett tumörprov som mäter 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm 3) kräver två HBSS + / + dissociation rören.
- Ultraviolett ljus sterilisering: Placera vävnad sax, små pincett, skalpell handtag, 1x normal petriskål, P1000 pipett och pipettspetsar i en steril kultur huva och lämna under ultraviolett ljus för ~ 15 minuter före ankomst och behandling av tumörvävnad.
3. Prov Isolering och transport
- Isolera tumörprover från kirurgisk resektion.
- Placera omedelbart tumorprov i iskall HBSS + / + så snabbt som möjligt efter att de avlägsnats från patienten. När all tissue prover samlas in, prover transporter (på is) från den operativa teatern till labbet för vidare bearbetning.
4. Vävnadsdissociering och rivning
- Efter standardsterilteknik i en huv med laminärt flöde, ta med koniskt rör med tumörprov i odlings huv, och tvätta prover genom att vända röret och tumör 50x. Låt fragment att falla till botten av röret, och sedan ta bort HBSS + / +. Fyll på med 30 ml HBSS + / +, och skaka / invertera 50x igen. Upprepa inversion / media borttagning för totalt 4x.
- Åter avbryta tumörfragment i 30 ml HBSS + / + för sista gången, häll sedan blandningen i en sterile100 mm petriskål, och separat tumör i 0,5 cm 3 grupperingar. Om större tumörfragment påträffas, använd vävnads sax eller skalpell (# 11 eller # 15 blad) för att klippa i mindre bitar.
- Använd pincett för att placera vävnadstyper 0,5 cm 3 i det enskilda HBSS + / + fyllda, 2 ml rund koniskaal-rör, allt på is. Använd vävnads sax för att skräda tumörfragment in i sub-1 mm fragment-suspensionen ska ha en "snowglobe" utseende (Figur 1). Finhacka tumören endast tills majoriteten av fragmenten är sub-1 mm; inte "over-färs" tumörprover. Placera helt malet vävnad röret tillbaka på is, och upprepa med alla extra provrören.
- Överför alla fragmenterade tumörprover till en enda 15 ml koniska rör. En P1000 pipett med ett snitt / modifierat steril tips fungerar bra för detta steg. Var extra HBSS + / + för att spola / skölja 2 ml dissociation rör för att se till att all tumörprov har samlats i 15 ml tub. Centrifugera ner blandningen i centrifug vid 23 ° C, vid 73 x g under 5 min.
- Sug bort HBSS + / + och lämnar cellpelleten. Åter avbryta fragment i 1:1 blandning av 0,25% trypsin: 0,2% kollagenas (löst i HBSS-/ -) - lägg bara tillräckligt för att hålla tumörfragment i tät suspension. Ersätt skruvlock, och placera i 37 ° C inkubator under 30 min. Skaka cellblandningen åtminstone en gång under inkubationen för att hålla fragmenten i suspension. Placera schwannom odlingsmedia i inkubatorn för att värma den vid denna tid också.
- Efter inkubering tillsätt 100 | il FBS till varje rör för att inaktivera trypsin, och därefter centrifugera provet vid 23 ° C, 73 x g under 5 min. Med pipett försiktigt suga bort så mycket supernatanten som möjligt utan att störa cellpelleten. Lägg det uppvärmda odlingsmediet (N2/insulin/5% FBS) till tumörfragment till ett slutligt förhållande av 01:02 tumörfragment: odlingsmedia (exempelvis om det finns en ml av tumörfragment, lägg i 2 ml värmdes media).
- Förbered för tumör finfördelning genom att klippa av spetsen av en P1000 pipett tips till en diameter på cirka 1-2 mm. Långsamt mal sönder cellsuspension med hjälp successivt mindre och mindre pipett diameter tips, tills du lätt kan pipettera lösningen genom en unaltställda P1000 pipettspetsen. Omedelbart flytta till ett mindre tips när du enkelt kan pipett tumören lösningen genom spetsen - inte över mal sönder provet. Om ett enda större bit av vävnadsblock aspiration under triturering, knacka pipettspetsen på botten av den koniska röret tillåter ofta fortsatt pulverisering.
5. Cell Plating
- En 0,5 mm 3 fragment av vävnad är tillräckligt för att seeda 1 x 100 mm skål, eller 4 x 8-well/4-well diabilder. Precis före tillsats av media / cellblandningen, avlägsna laminin lösning från odlingsplattorna men låt inte plattorna torka.
- För varje 100 mm skål, lös tumörfragment i 10 ml uppvärmd odlingsmedier.
- För varje brunn i en 4-väl slide, 750 pl värmde kultur media (3 ml för hela glaset).
- För varje brunn på en 8-bra slide, 400 pl värmde kultur media (3,2 ml för hela slide).
- Inkubera kulturerna i 37 &# 160; ° C, 100% fuktighet, 6% CO2. Låt kulturerna ensam i minst 36 timmar, och sedan byta media om lösningen gulnat (surt). Annars ändra media vid 72 timmar, därefter var 2-3 dagar, eller när medierna blir sura. Om mediet blir sur dagligen under flera dagar i rad, är detta vanligen en indikation av potentiell bakteriell eller jästkontamination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt tumör fragmentering är nödvändigt för optimal sådd och utväxt i vävnadsodlingsplattor (figur 1). Identifiering av schwannom celler under de första dagarna efter plätering är ofta svårt, på grund av skymmande mängder av cellrester och röda blodkroppar. Genom den 4: e eller 5: e dagen, kommer cell förlängningar nära vidhäftande tumörfragment skapa igenkännbar "snörning" mönster bland spillrorna. Efterföljande medie förändringar avlägsna allmänhet majoriteten av icke-vidhäftande celler från den andra veckan. Med denna metod kan 90% sammanflödet förväntas mellan dag 7-14, beroende på den ursprungliga vitalitet tumörfragment före hackning och plätering densitet (Figur 2). Såsom tidigare beskrivits, schwannom kulturer förefaller att växa utåt från små fragment av vidhäftande tumörfragment 9,10. Sådan utväxt är detekterbar i slutet av den första veckan. Figur 2 visar brightfield avbildning av schwannom cell utväxt från en enda tumörfragment, som skisseras i rött i nedre högra hörnet. Figur 3 visar den "överbryggande" utväxt som sker mellan två olika tumörfragment, i odlingsbrunnar immun med polyklonala kanin anti-S100 antikropp. Vi rutinmässigt immunostain kulturer med anti-S100 eller anti-p75 NTR-antikroppar för att kontrollera renheten av kulturer och positivt identifiera schwannom celler för analys (Figur 4). Med dessa metoder över> 95% av cellerna i dessa kulturer representerar schwannom celler. Schwannom celler märka också med gliafibrillärt surt protein (GFAP) och ErbB2, bland andra markörer 11.
Figur 1. Jämförelse av samma tumörprov både före (A) och bakreER (B) malning. Prov upprättats i 1,5 ml HBSS + / + med fenolrött i 2,0 ml rund botten koniska rör.
Figur 2. Typiskt utseende kulturer på bright mikroskopi. Spindled schwannom cell utväxt utstrålar från tumörfragment, bild tagen på kultur dag 10. Skala bar = 100 nm.
Figur 3. Immunfärgning av primära vestibulära schwannoma kulturer med anti-S100-antikroppar visar typiska kultur-och cell morfologier. A) Låg effekt som illustrerar utväxt från pläterade tumörfragment, kultur dag 14. Skala bar = 200 nm. B) Högre powER vy av schwannom celler med spindled morfologi, kultur dag 14. Scale bar = 100 | im.
Figur 4. Immunfärgning av primära vestibulära schwannoma kulturer för att bekräfta kultur renhet och cellidentitet. A) Kulturer immun med anti-S100-antikroppar. Kärnor är märkta med DAPI. Skala bar = 100 ìm. B) Kulturer immun med anti-p75 NTR-antikroppar. Kärnor är märkta med DAPI. Scale bar = 100 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historia av in vitro schwannom kulturer
Arbetet med att etablera in vitro schwannom kulturer började bara några decennier efter den första akustiska neurom öppen kirurgisk resektion inträffade år 1894 12. De första inspelade kulturer var med Kredel på 1920-talet, som utan framgång försökt växa malet tumör med "hängande släpp-metoden" 12 . Senare, Dr. Murray och Stout publicerade sin in vitro-kultur upplevelse med neurilemomas odlas på koagulerat humanplasma. Intressant nog visade denna teknik att Antoni A och Antoni B specifika fragment växte annorlunda, med unika cellulär morfologi och differentierade agar kondensering 13. Cravioto och Lockwood publicerade ytterligare observationer av akustiska neurom kulturer i fågelproppar på coverglass halk-och rullrören. De var också först med att använda Rose kammare för time-lapse avbildning av tumörtillväxt
Fördelar med Vestibulär schwannom Primära kulturer
Studier av mänskligt schwannom tumorigenesis använder ofta homogena odödliga cellinjer och transgena möss modeller. Sådana verktyg är bra men do inte korrekt återspeglar de genotyper, fenotyper och komplexiteten i mänskliga sjukdomar. Däremot primärkulturer sannolikt ge en mer realistisk modell. De rekapitulera mer troget heterogenitet iska och molekylär status i samband med mänskliga tumörer 15.
Renhet av schwannom kulturer
En utmaning för primär vävnadskultur är att upprätthålla målcellen renhet. Schwannomas övervägande delen bestå av neoplastiska Schwann celler 6, men kulturer är inte immuna från föroreningar fibroblaster. Historiskt, metoder för optimering schwannom cell renhet delas in i tre kategorier: 1) val av kemiskt definierat medium och specifika tillväxtfaktorer; 2) immunorening (t.ex. med magnetisk pärla cellsortering 7), 3) en kombination av båda metoderna ovan. Enligt vår erfarenhet fibroblaster eller andra icke-schwannom celler omfattar i allmänhet mindre än 5% av cellerna i kulture, oavsett patientens egenskaper (ålder, kön), sporadiska eller NF2-associerade tumörer, primär eller sekundär tumör resektion, eller cystisk vs solida tumörtyper. Om fibroblaster tycks ta över kulturen, kommer avlägsnande av serum för 1-2 medieförändringar avsevärt minska denna befolkning utan att negativt påverka schwannom cellöverlevnad. Förbehandling av cellodlingsytor med laminin underlättar också schwannom celltillväxt 9. Minimal passage av kulturerna bidrar också till att minska oönskade cellkontaminering - cryostorage är bäst klar inom de första två kultur passager, och kultur experiment rekommenderas inte längre passage 4-5. Vi finner optimala resultat när kulturen experiment fullbordas genom passage 1-2 med icke-cryostored celler.
Vi använder både immunfärgning (anti-S100, DAPI) och mikroskopiska utseende cellulär och nukleär morfologi som kvalitetskontroll i våra schwannom kulturer. Ibland är detär bra att immunostain en delmängd av kulturer för monocyter (CD68) eller fibroblast specifika markörer för att ytterligare verifiera kultur renhet 9. Under experimentella analyser av cellbeteende (t.ex. spridning eller celldöd), vi alltid immunostain med anti-S100 eller anti-p75 NTR-antikroppar för att kontrollera att resultaten är schwannom cellspecifika.
Kultur morfologi och tillväxtmönster
Schwannom tumörkulturer visar vanligtvis unika tillväxtmönster som påminner om Antoni A (hög celltäthet, tätt organiserat, indikationer på Verocay kroppsformationer) och sällan av Antoni B (jämförelsevis glesa kärnor, riklig cellulära processer, mindre organisation) mönster ses i histopatologi av opererande schwannom tumörer 16. Nästan alla schwannom celler visar den klassiska långa, spindled, bipolär cellform i samband med både Schwann och schwannom celler 6,17 men andra cell morphologies, såsom beskrivits av Cravioto (Amoeboid Mikroglia-liknande celler, spolformad Celler, racket-formade celler och Kite-formade celler) förekommer ibland 14. Sammantaget, celltillväxt och spridning är mycket långsamma i vår bas medium (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 tillägg). Tillsättning av kända mitogena faktorer såsom forskolin och β1-neuregulin ökar betydligt celldelning 18.
Kritiska Protocol Steps
Vår schwannom vävnadsodling protokollet är enkelt och ganska förlåtande; men det finns flera viktiga steg som garanterar framgång. För det första, är korrekt tumörhantering kritisk. Expect bästa resultat när tumören är placerad direkt i iskall HBSS + / + så snart som möjligt när de avlägsnats från patienten. Detta är i motsats till den vanliga kirurgiska sig på insamling opererande tumör i steril koksaltlösning sedan skicka den sammanlagda vävnad för bearbetning i patologi vid utgången av ärendet. För det andra, hålla vävnad samples så cool som möjligt under processen. Det är viktigt att den opererande tumören hålls iskall, och att behandlingen sker så ändamålsenligt som möjligt efter att de tagits. Gör så mycket av vävnadsbehandling som möjligt på is också. För det tredje, aggressivt tvätta tumörprover. Detta hjälper till att minska risken för bakterie-eller jästkontamination. För det fjärde, inte över-Köttfärs tumörprover. Tumör triturering beror på en semi-subjektiv bedömning av när man ska fortsätta med en mindre diameter P1000 pipettspetsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Support: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin mouse protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100 mm round culture dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4-well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8-well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction filter flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50 ml Conical tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2 ml Round bottom tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small scissors | FST | 14058-11 | |
| Small forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-tissue culture 100 mm round Petri dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, non-filtered P1000 pipette tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated ice cooler | |||
| Culture hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine insulin (1 mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T.
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al.
- Kaasinen, S., et al.
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd,, et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
