Summary
Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.
Abstract
O método descrito aqui permite o estudo de migração celular sob confinamento numa dimensão. Ele baseia-se no uso de canais microfabricados, que impõem um fenótipo de células polarizadas por constrangimentos físicos. Uma vez que os canais internos, as células têm apenas duas possibilidades: seguir em frente ou para trás. Esta migração simplificada em que a direcionalidade é restrito facilita o rastreamento automático de células e extração de parâmetros quantitativos para descrever o movimento celular. Estes parâmetros incluem a velocidade da célula, mudanças de direcção e pausas durante o movimento. Microcanais também são compatíveis com a utilização de marcadores fluorescentes e são, portanto, adequados para estudar a localização de organelos e estruturas intracelulares durante a migração celular em alta resolução. Finalmente, a superfície dos canais podem ser funcionalizados com diferentes substratos, permitindo que o controlo das propriedades adesivas dos canais ou o estudo de haptotaxia. Em resumo, o sistema de here descrito destina-se a análise da migração de grandes números de células em condições em que tanto a geometria e a natureza bioquímica do ambiente são controlados, facilitando a normalização e reprodutibilidade de experiências independentes.
Introduction
A migração é uma função celular complexa que é importante para diversos processos fisiológicos em organismos multicelulares, incluindo o desenvolvimento, respostas imunitárias, e a regeneração de tecidos. Além disso, certas situações patológicas, tais como a invasão do tumor e metástases dependem de motilidade celular 1. Por estas razões, a migração celular tornou-se um importante campo de estudo no contexto de investigação fundamental e de translação. In vivo, a maioria dos tecidos são caracterizado por uma matriz extracelular rica e elevada densidade celular. A migração celular, por conseguinte, em condições fisiológicas, ocorre num ambiente confinado complexo. Classicamente, muito provavelmente devido a razões históricas e limites técnicos, a migração de células foi estudada em sistemas 2d plana que não se reproduzem muitas das propriedades ambientais encontradas em tecidos, tais como o confinamento. Além disso, os factores como a adesão de células, que são essenciais para a motilidade em 2D, foram recentemente mostrou não ser necessariamente necessária para a migração in vivo, ou dentro geles, o que sugere que os mecanismos que governam a locomoção das células em 2D e em outros ambientes são distintos 2. Vários sistemas têm sido desenvolvidos para imitar as propriedades do complexo de tecidos, o mais famoso géis de colagénio, sendo que visam recapitulando as propriedades da composição da matriz extracelular 3. Aqui propomos microcanais como método complementar simples que permite a migração de células de estudo em uma dimensão em um ambiente confinado.
Neste sistema, as células migram ao longo de microcanais em que eles entram espontaneamente. Células migratórias então adquirir a forma dos canais, que adopta uma geometria tubular que provavelmente reforça a sua polaridade. O movimento linear das células dos canais permite o seguimento automático de células e a extracção de parâmetros quantitativos obtidos em experiências. Do ponto de vista técnico, este sistema é fácil e flexível. O coating das paredes do canal pode ser manipulado, o tamanho e a forma dos canais pode ser adaptado, e um grande número de células pode ser analisada em experiências individuais. Este sistema pode também ser ampliado para realizar a análise de tela intervalo médio de moléculas envolvidas na motilidade celular. O protocolo aqui descrito foi normalizado utilizando células dendríticas (DC) como um modelo celular. Estas células são a chave para o sistema imunitário que eles participam na iniciação e manutenção de respostas imunitárias específicas 4. In vitro, DCs foram mostrados para migrar espontaneamente em ambientes confinados, e são, portanto, um bom modelo para estudar a motilidade celular em microcanais 5,6 . Importante, este sistema pode ser ampliado para analisar a migração de qualquer outro tipo de células móveis, como os linfócitos T, neutrófilos, células de tumor ou 7-9.
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Protocol
Importante: Este protocolo assume que o molde contendo a forma para os microcanais desejados já foi feita. Outras informações sobre a preparação do molde já foi publicado em 10 de. Este protocolo também assume que DCs medula óssea cultura é conhecido.
1. Chip Fabrication
- Misture o óleo de PDMS e agente de cura em um 10:1 de peso em um copo de plástico. Misturar os dois compostos completamente.
- Lançai a mistura ao longo dos microcanais rolamento do molde. A altura total deve estar compreendida entre 0,5-1 cm.
- Remova as bolhas de ar em uma redoma de vácuo durante 1 hora.
- PDMS endureça no molde, colocando este último num forno durante 2 horas a 65 ° C.
- Uma vez que o PDMS é, à temperatura ambiente, cortado um pedaço grande em torno da estrutura, com uma lâmina de bisturi e retire-a a partir do molde (Figura 1A).
- Faça furos onde as células serão injetadas (tipicamente 2 mm) e redimensionar o PDMScom uma lâmina cirúrgica para ajustar o tamanho de pratos com fundo de vidro em que a migração serão avaliados (Figura 1B). Antes de prosseguir, remover o pó residual do prato usando lente papel de limpeza. Isto favorece a ligação de PDMS de vidro descrito na etapa 1.10.
- Limpe o chip redimensionada PDMS contendo os canais por degola e descamação fita adesiva nas laterais da estrutura.
- Sonicar os pedaços PDMS 30 segundos em 70% de etanol para remover as poeiras e as pequenas partículas de PDMS. Seque-os rapidamente depois soprando ar limpo.
- Ative os PDMS (estruturas para cima) e placas de cultura de ar (ou oxigênio) o tratamento de plasma durante 30 segundos a 300 mTorr.
- Coloque ambas as superfícies ativadas em contato para ficar permanentemente os PDMS ao substrato. Se necessário, utilizar uma pinça metálica para pressionar ligeiramente por cima do PDMS de forçar o contacto entre o polímero e o vidro do prato (Figura 1C).
- Incubar o chip no forno a 65 ° C for 1 hr para fortalecer a ligação.
2. Revestimento de microcanais
- Activar a toda a estrutura por plasma de ar a 300 mTorr durante 1 min. Isto vai promover a entrada de líquido para dentro dos canais no passo seguinte.
- Encher rapidamente os orifícios de entrada do chip com fibronectina a 10 ug / ml em água. Outros substratos, tais como PEG podem ser utilizados para modificar a aderência celular para as paredes do canal. Preste atenção que o líquido se espalha por toda a estrutura. Isto pode ser facilmente verificado por olho sob luz normal ou usando um microscópio de campo claro regular.
NOTA: Em estruturas muito pequenas, nas quais a difusão é mais difícil, a entrada de líquido nos canais podem ser forçados através da colocação da estrutura numa campânula de vácuo durante pelo menos 15 min. Para verificar a eficiência do revestimento de substratos fluorescentes pode ser utilizado (Figura 2). - Incubar 1 hora à temperatura ambiente para permitir a adsorção da fibronectina ou qualquer outro revestimento substtaxa para as paredes dos canais.
- Lavar as estruturas 3x com PBS para remover o substrato nonbound.
- Após a lavagem, passe para protocolo 3 ou armazenar o chip a 4 ° C para um uso posterior (24 máximo hr).
3. Célula de carga
- Remover o PBS a partir da placa e preencher o microsistema com meio celular. Deixe-incubar durante 1 hora para saturar os canais com o meio.
NOTA: Para os experimentos que envolvem drogas como inibidores de molécula, é aconselhável pré-incubar os canais com um meio contendo a droga na concentração correta. Além disso, alguns medicamentos tendem a solubilizar na estrutura PDMS que reduz a concentração eficaz. Algumas soluções têm sido propostas para contrariar este problema 11-12. - Remover DCs flutuantes e recuperar as células semi-aderentes por lavagem com meio de cultura. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
NOTA: Para imagens de núcleo, uma coloração de Hoechst 33342 pode ser conseguido por no antemãocubating 2 x 10 6 células durante 30 minutos com o corante a 200 ng / ml em meio completo. Lavar duas vezes por centrifugação para remover o excesso de corante, antes de continuar o protocolo. - Centrifugar as células a 300 xg durante 5 minutos (o tempo e a velocidade pode ser diferente, dependendo do tipo de célula) e descartar o meio. Dilui-se o sedimento para atingir uma concentração de 20 x 10 6 células / ml.
- Remover o excesso de meio da placa e esvaziar os orifícios de entrada na estrutura de PDMS usando uma micropipeta. Encha as entradas com 5 mL de solução de células para atingir uma quantidade de 1 x 10 5 células em cada orifício de entrada.
NOTA: Alta densidade celular é necessária para favorecer o contacto das células com os canais. Baixa densidade celular pode resultar em menor número de células no interior de canais e fracasso da experiência. - Incubar o microchip durante 30 min a 37 ° C na incubadora. Adicionar 2 ml de meio completo para o ensaio de prato.
NOTA: A estrutura inteira PDMS deve be coberto a fim de evitar a secagem das células durante a experiência. Se 2 ml não é suficiente, adicione mais meio para cobrir completamente a estrutura de PDMS.
4. Imagem
- Limpar a superfície inferior externa dos pratos com tecido de limpeza de lentes antes da colocação das placas sob o microscópio.
- Para analisar a migração em grande número de células, usar ampliação de 10X e de iluminação de campo numa ampla de CO 2 e de temperatura equipado de vídeo-microscópio (Figura 3). Para facilitar o rastreamento de pilha, Hoechst coloração e luz UV pode ser usado (veja o passo 3.2). A migração pode ser também analisados usando microscopia confocal a fim de obter maior resolução de estruturas celulares durante a migração.
- Para a microscopia de lapso de tempo em 10X, escolha uma frequência de tempo de acordo com a velocidade da célula esperada (tipicamente 2 min para as células dendríticas que migram com uma velocidade de 5 mm / min).
Nota: O protocolo descrito aqui faz not incluem a análise dos parâmetros de migração celular. Alguns pontos são listados na discussão para aconselhar os leitores sobre como proceder para extrair informações a partir de filmes de lapso de tempo.
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Representative Results
Em cada experimento, a superfície do PDMS revestido com uma molécula adaptado para o interesse do estudo. Figura 2 mostra os canais revestidos com uma molécula fluorescente, PLL-g-PEG, antes e após a lavagem (passo 2.4). Tal experiência permite o controlo da homogeneidade do revestimento dos canais.
Após o carregamento da célula, microscopia de vídeo pode ser realizada a seguir a migração celular. Figura 3A mostra um exemplo de DC migrando em microcanais, a uma densidade apropriada para acompanhar as células. Ambos, o contraste de fase e coloração Hoechst pode ser utilizado para esta finalidade (ver discussão). A técnica é também compatível com microscopia confocal fluorescente de alta resolução, e pode ser utilizado para rastrear organelos ou estruturas celulares. Figura 4B mostra um exemplo da dinâmica de actina polimerizada na migração DCs expressam LifeActGFP.
Um exemplo de quantificação de célulasmotilidade analisados em DCs migrando é mostrado na Figura 5. Figura 5A mostra kymographs gerados a partir de WT ou Y27632 DCs tratadas. Y27632 é um inibidor bem caracterizada de contractilidade celular e migração, e foi utilizada para verificar a capacidade do sistema para detectar as mudanças de velocidade. Os kymographs pode ser ainda analisada para extrair a posição e tamanho de células em função do tempo, permitindo o estudo de diferentes parâmetros para descrever a migração celular. Figura 5B mostra a velocidade de migração rastreados por imagiologia posicionamento núcleo usando um software caseiro 13. DCs têm uma velocidade média próxima a 6 um / min. O tratamento com Y27632 diminui significativamente a sua velocidade. Este exemplo mostra a potência da técnica, que permite a quantificação de um grande número de células em experiências individuais e a utilidade do sistema para detectar diferenças induzidos por tratamentos com medicamentos. Isto pode ser alargado ao uso de siRNA e rastreio de toupeira léculas envolvida no controle da migração.
Figura 1. Passos na montagem canais. Chip de PDMS foi replicado a partir de um molde de canal. (A) O chip contendo os canais foi extraído directamente a partir do molde. (B) O chip redimensionada para caber o prato experimental e um buraco foi feito para permitir a entrada das células. (C) O chip foi finalmente colado na parte superior do prato de vidro. (D e E), a representação esquemática do dispositivo. (D) Vista superior. (E) Vista lateral. Objetos verdes representam células dentro ou fora canais (azul). Bar 1 cm.
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Figura 2. Revestimento de canais com um substrato fluorescente. (A) 5 mm x 5 mm canais incubadas com PEG de fluorescência a 100 ug / ml durante 1 hora. (B) Imagem representativa do PEG fluorescente restante após lavagem em PBS dos canais. Bar de 50 um.
Figura 3. Células migrando ao longo de microcanais. Fase contraste (cinza) e núcleo coloração (azul) de células que migram em 5 mm x 5 mm canais microfabricated. (A) Imagem única extraída de um filme de DCs migrando ao longo dos canais. (B) Montagem mostrando o deslocamento de uma selecçãoted DC migrando ao longo dos canais. As setas brancas indicam células migratórias. Timescale 1 img / 2 min. Bar de 50 um.
Figura 4. Exemplo de células de alta resolução em microcanais. De alta resolução de imagem de DCs migrando junto microcanais individuais. (A) Montagem de imagens de contraste de fase (1 img/20 seg) de um DC migrar num microcanal (amplificação de 100X). (B) Montagem de um lifeact expressar DC (destaques polimerizado actina) mostrando a compatibilidade do sistema com imagens de fluorescência (1 img/20 seg, ampliação 60X, secção óptica single). Actina polimerizada é mostrado em preto. Tamanho do canal 10 m de largura x 5 mm de altura. Bar de 10 um.
Figura 5. Resultados representativos de DCs migrando ao longo de microcanais. Esta figura ilustra o tipo de análise que pode ser feita a partir de filmes de células migrando ao longo de microcanais. Figura 5A mostra kymographs gerados a partir de imagens de contraste de fase de lapso de tempo de WT ou Y27632 DCs tratadas migrando em microcanais (10X, 1 img / 2 min). Figura 5B mostra um exemplo de quantificação de velocidade celular obtido depois de localizar o núcleo DC utilizando coloração Hoechst e um software caseiro 13. Os dados são analisados utilizando um teste t não paramétrico (teste de Mann-Whitney). Bar 100 um.
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Discussion
Descrevemos aqui um dispositivo composto por microcanais como um método para estudar as propriedades migratórias de grande número de células em experiências individuais. Este sistema experimental imita as restrições ambientais confinados encontradas em tecidos de células migratórias endógenos. No entanto, forçando a migração de uma única dimensão, que facilita o controle automático de células e a extracção da mensuráveis (Figura 5). Também mostram que o nosso dispositivo é compatível com a microscopia de fluorescência e, portanto, pode ser adaptado para estudar posicionamento organelo durante as diferentes fases da motilidade celular (Figura 4).
Um passo crítico no âmbito do protocolo é a qualidade dos canais. É importante controlar a boa aderência do PDMS na superfície do vidro. Quando os problemas de aderência aparecer os primeiros itens a serem verificados são a limpeza de ambas as superfícies e um dos mais limpo plasma. Outro parâmetro que pode ser crítico é the densidade de células carregadas. A migração espontânea exige proximidade das células para os canais para facilitar a entrada dos tubos, e o número ideal deve ser avaliado para cada tipo de célula.
Como um exemplo, que têm mostrado a migração espontânea de DCs, mas o sistema pode ser utilizado para analisar a migração de outros tipos de células. No laboratório, testámos os linfócitos T, macrófagos primários, bem como linhas de células de tumor (dados não mostrados) e as referências 7-9.
Para analisar a migração de células nos canais, dois protocolos principais foram testados. O primeiro requer imagiologia por contraste de fase (10X), e baseia-se na detecção e geração de kymographs de células migrantes 3 (Figura 5A). Velocidade, o tamanho das células e persistência são, entre outros, dos parâmetros que podem ser extraídos a partir de kymographs. Este sistema é limitada pela qualidade dos kymographs e para o desenvolvimento deo software para gerar e analisar. A segunda e mais fácil maneira de quantificar a dados é baseado num controlo semi-automatizada do núcleo utilizando a coloração de Hoechst (Figura 3). O uso de fluorescência permite o acompanhamento ea análise da migração com o software de imagem padrão. Um exemplo de tal estratégia tem sido desenvolvido para a primeira corrida celular do mundo 12.
Dado que a superfície do PDMS pode ser adsorvido com virtualmente qualquer proteína, microcanais pode ser utilizada para avaliar o impacto de proteínas da matriz extracelular na migração de células. A geometria dos canais pode também ser modificado, o que facilita o estudo da incidência de restrições físicas na migração de células.
Finalmente, este sistema experimental pode ser adaptado para adquirir várias condições em experiências individuais. Isto, juntamente com uma análise semi-automatizada, é compatível com projeções de rendimento médio para a descoberta de novos atores envolvemd na migração de células cancerosas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem grandemente a plataforma PICT IBISA no Institut Curie (CNRS UMR144). Este trabalho foi financiado por concessões: o Conselho Europeu de Investigação para AM.LD (Strapacemi 243103), a Associação Nationale pour la Recherche (ANR-09-piri-0027-PCVI), a fundação InnaBiosanté (Micemico) para MP e PM. LD ea ERC Strapacemi jovem concessão investigador AM.LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H.
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
