Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Metodikk for effektiv generering av fluorescerende tagged vacciniavirusproteiner

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/51151
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1
1School of Molecular Bioscience, University of Sydney, 2Department of Medicine, Center for Vascular Research, 3Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science, University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

En rask og modulær protokoll for generering av rekombinante vaccinia-virus som uttrykker fluorescerende merkede proteiner samtidig ved hjelp av metoden for forbigående dominerende utvalg er beskrevet her.

Abstract

Merking av virusproteiner med fluorescerende proteiner har vist seg å være en uunnværlig tilnærming for å fremme vår forståelse av virus-vert interaksjoner. Vaccinia virus (VACV), den levende vaksinen som brukes i utryddelse av kopper, er spesielt egnet til fluorescerende levende cellemikroskopi på grunn av sin store virionstørrelse og hvor enkelt den kan konstrueres på genomnivå. Vi rapporterer her en optimalisert protokoll for å generere rekombinante virus. De minimale kravene til målrettet homolog rekombinasjon under vaccinia-replikering ble bestemt, noe som gjør det mulig å forenkling av konstruksjonsgenerering. Dette gjorde det mulig for alliansen av forbigående dominerende utvalg (TDS) med en fluorescerende reporter og metabolsk utvalg for å gi en rask og modulær tilnærming til fluorescerende merker virale proteiner. Ved å effektivisere genereringen av fluorescerende rekombinante virus, er vi i stand til å legge til rette for nedstrøms applikasjoner som avansert bildeanalyse av mange aspekter av virus-vert-samspillet som oppstår under virusreplikering.

Introduction

Vaccinia virus (VACV) er prototypisk poxvirus og svært relatert til variolavirus, årsaken til kopper. Begge disse virusene er medlemmer av ortopedi slekten som inkluderer andre bemerkelsesverdige patogener som monkeypox og ectromelia virus (mousepox)1. Ortopedivirus har store dobbeltstrengede DNA-genomer (180-220 kb) som koder oppover på 200 anslåtte åpne leserammer2,3. Replikering av disse virusene innebærer dannelse av en perinuclear virusfabrikk, hvor modne virus (MV) er laget, og trans-Golgi-nettverket der en undergruppe av MV kjøper to ekstra membraner for å generere innpakkede virus (WV) (gjennomgått av Roberts og Smith4). Ortopedoksgenomer er svært mottagelige for genetisk manipulasjon på grunn av den høye graden av genetisk rekombinasjon som er en funksjon av VACV genomreplikasjon og formidles av viral DNA-polymerase5. Generering av rekombinante virus er avhengig av homolog rekombinasjon og lineære DNA-molekyler med homologier så små som 12 bp er tilstrekkelig til å megle rekombinasjon i forgjeves virusinfiserte celler6. Fluorescerende merking av vacciniavirus kan gi ekstremt lyse viruspartikler på grunn av den store størrelsen på ortopedokspartikler, noe som gjør det mulig å inkorporere mange fluorescerende proteiner per virion7. Vaccinia har kapasitet til å bære store fragmenter av utenlandsk DNA8, og dessuten kan mangelen på stiv kapsidsymmetri tillate en viss fleksibilitet når man uttrykker virale proteingenfusjoner fra deres endogene loci9. Fluorescerende merking av VACV-proteiner har vist seg uvurderlig for studiet av vertspatogeninteraksjoner på subcellulært nivå, spesielt innen virusinngang10, transport11-13, og morfogenese, spesielt av innpakkede virioner7.

Rekombinante virus kan velges ved redning av en svekket vekst fenotype14,15, metabolsk utvalg16-18, eller ved uttrykk for et markørgen (f.eks X-gal 19 eller fluorescerende protein13,20). Her beskriver vi utvalget av fluorescerende virus ved hjelp av en kraftig kombinasjon av fluorescerende og metabolsk utvalg. Forbigående dominerende utvalgsvektorer (TDS), utviklet av Faulkner og Moss (1990)21, gjør det mulig å integrere markører sammen med ønsket fluorescerende merket gen av interesse. Når metabolsk seleksjon fjernes, kan det oppstå en sekundær rekombinasjonshendelse som utskiller seleksjonsgenene, men etterlater det fluorescerende taggede virusproteinet intakt. Figur 2 nedenfor gir en oversikt over den eksperimentelle prosedyren. Seleksjonsgenene som brukes i denne studien er mCherry og Escherichia coli guanine fosphoribosyltransferase (gpt) gen, begge uttrykt fra en syntetisk tidlig / sen viral promotor og brukt tidligere av Cordeiro et al. 22 I tillegg er det fluorescens av det taggede fusjonsproteinet av interesse. Når metabolsk seleksjon fjernes, utskilles de valgbare markørene (mCherry og gpt), slik at bare fluorescensen til det taggede genet, som tillater identifisering av de riktige rekombinante virusene. Eksisjonen av utvalgsmarkørene gir muligheten til å kombinere flere fluorescerende koder, slik at vi kan lage virus med evnen til å fluorescerende merke flere virusproteiner samtidig. Tidligere studier har bestemt de minimale homologikravene for vaccinia rekombinasjon av lineære og sirkulære DNA-molekyler transfektet til vaccinia virusinfiserte celler6. Vi ønsket å bestemme rekombinasjonseffektiviteten av varierende homologilengder av flankearmer i gpt-mCherry TDS-vektoren gjennom innlemmelsen i det vaccinia virale genomet. Det ble fastslått at homologe regioner på 100 bp i TDS-vektoren er tilstrekkelig til å målrette og formidle innsetting av rekombinant DNA i VACV-genomet ved homolog rekombinasjon (figur 4). Mens mindre homologilengder også ville muliggjøre rekombinasjon, ga 100 bp homologilengder nok rekombinante virus som lett kunne identifiseres med metabolsk og fluorescerende utvalg. DNA-fragmenter av denne størrelsen kan syntetiseres kommersielt til relativt lave kostnader og letter i stor grad produksjonen av flere vektorer for opprettelse av rekombinante virus. Vi valgte å øke homologilengden til 150 bp for å gi større rekombinasjonsfrekvens samtidig som vi holdt ned kostnadene ved syntese av oligonukleotidsekvensen av flankeregioner.

Protocol

1. Opprette rekombinasjonsvektoren

  1. Identifiser 150 bp lange flankeregioner av homologi (referert til som venstre og høyre armer) som kreves for å enten N- eller C-terminalt merke det virale genet av interesse (Se figur 1b).
  2. Design en oligonukleotidsekvens som består av de 150 bp venstre og høyre armene atskilt av et par valgte begrensningssteder. Hele sekvensen må også flankeres av et annet par begrensningsområder (forskjellig fra det første paret) for å tillate innlemmelse i TDS-vektoren når de er syntetisert. Vær forsiktig når du designer oligonukleotidet med begrensningssteder at sekvensene er i ramme med ønsket innsettingssted.
  3. Inkorporer begrensningssteder mellom venstre og høyre armer når du designer oligonukleotidet for syntese, som må samsvare med de som flankerer den åpne leserammen til den fluorescerende taggen du velger (se figur 1b). Det er mulig å bruke et NotI-begrensningssted som en tre aminosyrekobling mellom venstre arm og starten på fluorescerende tag.
  4. Inkorporer de samme begrensningsstedene på hver side av fluorescerende taggen av PCR (se figur 1c).
  5. Klone det syntetiserte fragmentet inn i TDS-vektoren.
  6. Klone fluorescerende kode i den resulterende rekombinasjonsvektoren ved hjelp av begrensningsstedene mellom venstre og høyre arm områder av homologi (se figur 1d).

2. Rekombinant virusgenerering

  1. I henhold til figur 2,infisere en monolayer av BS-C-1 celler med vaccinia virus i serumfrie medier på en Multiplicity of Infection (MOI) > 1.
  2. 1 time etter infeksjon, redningsceller med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) og transfekt med en blanding av rekombinasjonsvektor plasmid og transfeksjonsreagens i et forhold på 3: 1 i serumfrie medier.
  3. Etter 24 timer skraper og gjenoppretter celler i DMEM som ikke inneholder fetal bovint serum (FBS) og utfører tre fryse-tine sykluser for å bryte åpne celler og frigjøre viruspartikler.
  4. Utfør en plakkanalyse med et flytende overlegg på 10 % FBS DMEM- og GPT-seleksjonsreagenser mykophenolic acid (25 μg/ml) og xanthine (250 μg/ml) som følger:
    1. Frø en 6-brønns plate med en monolayer av BS-C-1 celler.
    2. Infiser 100% konfluente cellemonolayers med serielle fortynninger av fryse-tinte celler som inneholder viruspartikler for å sikre tilstrekkelig separasjon av individuelle plakk.
    3. Overlegg med flytende 10% FBS som inneholder DMEM som inneholder GPT-seleksjonsreagenser - mykofenolic acid og xanthine ved endelige konsentrasjoner på henholdsvis 25 μg/ml og 250 μg/ml.
  5. Etter en 24 timers inkubasjon, fjern væskeoverlegget og bruk et fluorescerende mikroskop for å se etter plakk som viser diffus rød fluorescens som tilsvarer inkorporering av mCherry fra TDS-vektoren i viruset. Avhengig av målgenet og valgt fluorescerende tag, kan lokalisert fluorescens av det taggede genet også observeres i samme røde plakk.
  6. Velg flere plakk for hvert rekombinant virus ved lokalisert skraping med pipettespiss og 100 μl 5% FBS som inneholder DMEM for å overføre celler til et Eppendorf-rør, etterfulgt av tre runder med frysetining av skrapede celler for å frigjøre rekombinante virus.
  7. Legg DMEM som inneholder fryse-tint virus til en monolayer av celler i en 12-brønns plate for å forsterke rekombinante virus med GPT utvalg reagenser i vekstmediet. Skrap vellykkede forsterkninger 24 timer etter infeksjon.
  8. Utfør en plakkanalyse av vellykket forsterkede plakk som viser rød fluorescens, denne gangen med et agaroseoverlegg og GPT-utvalg, som følger:
    1. Frø en 6-brønns plate med en monolayer av BS-C-1 celler.
    2. Utfør en seriell fortynning av rekombinante virus og infiser brønner med en økende fortynning av virus i FBS-fri DMEM.
    3. 1 time etter infeksjon, fjern væskemediet og legg hver brønn med 0,5% agarose i minimalt essensiell medium (MEM) som inneholder 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin, sammen med GPT-seleksjonsreagenser.
  9. 2-3 dager etter infeksjon, velg plakk som viser fluorescens som er både rød og fargen på den valgte fluorescerende taggen for å forsterke igjen, denne gangen uten GPT-valg.
  10. Utfør neste plakettanalyse med et agaroseoverlegg uten merking.
  11. Velg plakk som har mistet sin diffuse røde fluorescens, men behold den lokaliserte fluorescensen som tilsvarer den valgte taggen.
  12. Fortsett plakkrensing uten utvalg for å få en ren bestand av rekombinante virus som har mistet mCherry og gpt utvalg gener, men beholde lokalisert fluorescens tilsvarende den valgte koden. Sjekk aksjer er rene av plakkanalyse, alle plakk skal ha en lignende plakk fenotype.
  13. Bruk PCR-screening av genomisk DNA for å sikre at viruslagrene er rene.
    1. Design primere som flankerer det fluorescerende geninnsettingsstedet og primere som forsterker selve det innsatte fluorescerende genet. Ulike kombinasjoner av disse primerne vil produsere PCR-amlikoner som vil oppdage geninnsetting og indikere renhet.
    2. Forsterk virale lagre som skal PCR screenes i en brønn av en 12-brønns platemonolayer av BS-C-1 celler.
    3. 24 timer etter infeksjon, skrap infiserte celler i 250 μl DMEM.
    4. Sentrifuger infiserte celler (18 000 x g i 10 minutter, 4 °C), fjern supernatant og resuspendcellepellet i 500 μl TE (10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA, pH 8) med 0,1 % (v/v) SDS. Virvel til lyse celler.
    5. Tilsett 500 μl fenol-kloroform-isoamyl akohol, snu for å blande. Sentrifuge (18 000 x g i 4 min, 4 °C). Ta supernatanten og gjenta.
    6. Utfør en etanolutfelling på supernatanten ved å tilsette 1 ml 100% etanol (kjølt) og 50 μl natriumacetat, inverter for å blande.
    7. La ved -20 °C over natten eller -80 °C stå i 1 time. Sentrifuge (18 000 x g i 30 min, 4 °C), fjern all væske og la utfelt DNA lufttørke. Resuspend i 50 μl TE.
    8. Bruk dette som mal for genomisk DNA PCR-screening.

3. Generasjon rekombinante virus som bærer mer enn en tag

  1. Coinfect samme celle monolayer med fluorescerende rekombinante virus for å lage dobbelt- eller trippel-merkede virus eller gjenta prosedyre fra Protokoll 1) med en annen tag.
  2. Rense virus basert på plakk fenotype eller PCR screening av virus isolere genomisk DNA.

Representative Results

Figur 1 viser de ulike konstruksjonene som kreves for denne prosedyren, som enten syntetiseres (Figur 1b og 1c) eller opprettes ved å klone trinn (Figur 1d). Figur 2 gir en oversikt over den eksperimentelle prosedyren med representative fluorescerende plakettbilder av en A3-GFP-rekombinant VACV som er avbildet for hvert trinn i utvelgelsesprosessen. I figur 3vises rekombinante vaccinia-virus som uttrykker proteiner merket med fluorescerende markører rettet mot virale strukturelle proteiner A3 og F13, som er en del av henholdsvis den indre viruskjernen23 og den ytrekonvolutten 24. Observasjoner av virale plakk og infiserte celler for hvert av de rekombinante virusene som er opprettet, er avbildet. Effektiviteten av homolog rekombinasjon av vektorer med VACV-genomet, som inneholder så lite som 70 bp-regioner av homologi til det, ble testet og resultatene er avbildet i figur 4. Den relative suksessen med å identifisere virale plakk laget av rekombinasjon med vektorer som inneholder 100 bp homologi var begrunnelsen bak å velge å syntetisere 150 bp lengde venstre og høyre armer av homologi til målgenet.

Figure 1
Figur 1. TDS-rekombinasjonsvektor (Transient Dominant Selection). (a) TDS-vektor med gpt- og mCherry-markeringsmarkører. (b) Homologiens venstre og høyre armer er utformet med spesifikke begrensningssteder i mellom og flankerer homologiens armer. Begrensningssteder mellom venstre og høyre armer som brukes i denne metoden var NotI og BamHI, NotI-nettstedet brukes også som en kobling mellom genet og fluorescerende tag. (c) Fluorescerende koder som er kompatible med denne metoden, flankeres av tilsvarende begrensningssteder. Noen tagger som brukes er GFP (grønt fluorescerende protein), RFP (rødt fluorescerende protein), Cerulean (en forbedring på ECFP, et cyan fluorescerende protein, ved stedsstyrt mutagenese25) og mini-SOG, et fluorescerende protein konstruert fra GFP som skaper et produkt som kan løses av EM ved belysning26. (d) Kloning trinn involvert i generering av den endelige TDS rekombinasjon vektor. Det syntetiserte oligonukleotidet som inneholder venstre og høyre flankearmer, klones først inn i TDS-vektoren. Dette gir en rekombinasjonsvektor der enhver tagg du velger kan transporteres inn og ut ved å klone inn i begrensningsstedene som er innlemmet mellom venstre og høyre armer. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 2
Figur 2. Omriss av den eksperimentelle prosedyren for å skape et rekombinant vaccinia-virus. Hendelser som forekommer på genetiske og cellulære nivåer er avbildet, sammen med representative plakkbilder som skisserer trinnene etter opprettelsen av et A3-GFP-merket fluorescerende vaccinia-virus. (A) Celler infisert med vaccinia virus er transfektert med TDS rekombinasjon vektor. (B) I denne figuren er bare resultatet av venstre rekombinasjon avbildet, og eksemplet bruker GFP som den fluorescerende taggen du velger. Høyre rekombinasjon ville føre til at hele TDS-plasmidet ble innlemmet i genomet på en lignende måte, bortsett fra at taggen ville bli smeltet sammen til hele målgenet i mellomtrinnet, dvs. En plakkanalyse utføres på en cellemonolayer med rekombinasjonsblandingen og utsettes for GPT-seleksjon. (C) Plakk som viser både rød og grønn fluorescens, tilsvarende henholdsvis mCherry- og GFP-uttrykk, plukkes og forsterkes. Når utvelgelsen er fjernet, vil det være tap av rød fluorescens som tilsvarer tapet av gpt- og mCherry-genene (D) og plakk som viser utelukkende grønn fluorescens plukkes og forsterkes (E). Klikk her for å vise større bilde.

Figure 3
Figur 3. Representative resultater fra TDS-rekombinasjonssystemet. Bilder viser hele plakk av rekombinante VACV-infiserte celler etter 48 timer (a, c, e; skala bar 100 μm), ledsaget av et bilde av en enkelt celle infisert av det tilsvarende rekombinante viruset etter 8 timer (b, d, f; skalalinje 10 μm). Gener som tilsvarer virionlokerte proteiner ble valgt for å visualisere viruspartikler. A3 er et kjerneprotein av vaccinia virion (a, b) og F13 (c, d) er et viralt konvoluttprotein. Et dobbeltmerket virus med både fluorescerende merket A3 og F13 (e, f) vises også. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 4
Figur 4. Kvantitativ analyse av rekombinasjonseffektivitet mellom rekombinante vektorer og VACV-genomet. BS-C-1 monolayers ble infisert med VACV og transfected 1 time etter infeksjon med tre rekombinasjonsvektorer som inneholder regioner av homologi av enten 500 bp, 100 bp eller 70 bp til VACV genomet. Hver vektor inneholdt også TDS-kassetten som består av gpt- og mCherry-seleksjonsgener. Celler ble gjenvunnet 24 timer etter infeksjon og lysed for å frigjøre rekombinante virus dannet. Plakkanalyser ble utført på cellelysater med GPT-seleksjonsmedier, og plakk som viste mCherry fluorescens ble regnet som vellykkede rekombinanter. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 5
Figur 5. Kart over gpt-mCherry TDS-vektoren som viser flere kloningssted. Vektoren har blitt beskrevet tidligere22 og vektorkartet ble opprettet ved hjelp av EZ Plasmid Map v1.9 fra Zhang Lab Group (SCU). Klikk her for å vise større bilde.

Discussion

Denne teknikken beskriver en effektiv og modulær protokoll for opprettelse av rekombinante virus som uttrykker fluorescerende merkede virusproteiner. Metoden sikrer at den eneste endringen i viralgenom er tillegg av en tag eller markør, og etterlater ingen valgmarkører. Den korte armlengden som kreves for homolog rekombinasjon muliggjør sin direkte syntese, eliminerer flere tidkrevende runder med PCR og kloning, mens fluorescensen av mCherry og metabolsk GPT-utvalg brukes til å isolere virale rekombinasjonsintermenn. Disse mellomprodukter kan løses, etter fjerning av utvalg, til et virus med et merket gen eller tilbake til foreldretypen. En lignende metode som involverer bruk av både fluorescerende og metabolsk seleksjon har blitt beskrevet tidligere27, selv om metoden som brukes i denne studien bruker kortere, syntetiserte områder av homologi, slik at identifisering av ønsket rekombinant virus ved å forestille seg fluorescensen til det taggede genet av interesse. Dette sekundære utvalget gjelder bare for merking av svært uttrykte virusgener som produserer tilstrekkelig fluorescens i en plakkanalyse. Alternativt kan man se for seg innsetting av en komplett uttrykkskassett, for eksempel et fluorescerende protein under en sterk viral promotor. I dette tilfellet vil venstre og høyre armer definere innsettingspunktet i stedet for det virale genet som skal merkes.

Det er noen viktige trinn som viste seg å være nyttige under den eksperimentelle prosedyren. Væskeoverlegget i trinn 2.3.3 beskrevet ovenfor viste seg å være avgjørende for deteksjon og isolering av røde/grønne fluorescerende plakk. Vi tror at kombinasjonen av GPT-seleksjonsreagenser og agaroseoverlegg avskrekket veksten av rekombinante virus og derfor byttet til et flytende overlegg for det første trinnet med å forsterke virus etter transfeksjon. Det er også viktig å velge fluorescerende plakk som viser lokalisert tagfargefluorescens for berikelse og rensing, da mellomprodukter som følge av venstre arm rekombinasjon kan resultere i diffus fluorescens observert i plakk hvis venstre arm også inneholder en promotorsekvens. mCherry-markørgenet i TDS-vektoren kan også erstattes av gfp, for eksempel for å tillate enkel inkorporering og valg av mCherry som en fluorescerende tag.

Noen teknikker beskrevet ovenfor varierer litt fra etablerte metoder for å skape rekombinant vaccinia virus. For eksempel er MOI av virus som brukes til å lage rekombinanter normalt mindre enn 128, men bruken av høyere MOIer har vært tilstrekkelig for å skape rekombinant vaccinia-virus ved denne metoden. Bruken av GPT-seleksjonsreagenser krever normalt preinkubering av cellene med seleksjonsreagenser18, men å legge dem til i redningsfasen etter infeksjon ga fortsatt tilstrekkelig utvalg av ønskede rekombinanter, spesielt på grunn av tilstedeværelsen av en fluorescerende seleksjonsmarkør også.

Som nevnt tidligere er en av begrensningene i denne teknikken at det sekundære fluorescensvalgtrinnet er avhengig av at det taggede proteinet av interesse blir sterkt uttrykt, på et nivå som muliggjør deteksjon for øye i en plakkanalyse. Uten dette ville det være mulig å rense virus som bare viste mCherry fluorescens, hvorav minst 50% ville inneholde de ønskede rekombinante virusene, som kunne identifiseres ved molekylære strategier som PCR beskrevet i trinn 2.12 ovenfor. En annen begrensning kan være inaktivering av visse proteiner som følge av merkingen. Den fluorescerende taggen kan gjennomgå mutasjoner eller bli utskilt av det rekombinante viruset med passivring over tid. Derfor anbefales regelmessig prøvetaking av rekombinante viruslagre ved mikroskopi og PCR. Til slutt kan det være en grense for antall fluorescerende merkede proteiner som kan innlemmes i et enkelt virus. Et aspekt av dette er evnen til å visualisere dem alle samtidig; gitt den overlappende karakteren av utslippsspektra av tilgjengelige fluorescerende koder, er det viktig å velge dem nøye for å sikre minimal spektral blødning. I tillegg åpner bruk av nært beslektede koder som GFP og Cerulean muligheten for rekombinasjon mellom de to, avhengig av deres plasseringer i det rekombinante genomet.

Den modulære karakteren av denne teknikken muliggjør enkel utskifting av fluorescerende koder basert på kompatibilitet med andre fargestoffer og / eller taggvalg. Ved å utskille valgbare markører tillater TDS-metoden seriell tilsetning av ulike fluorescerende proteiner eller kombinasjonen av TDS-basert merking med TDS-baserte genslettinger for fenotypiske analyser29. Som et eksempel på nytten av denne tilnærmingen ble det generert et dobbeltmerket fluorescerende virus som merker viruskjerner og WV-membranen. Imaging studier med dette viruset kan brukes til å studere bevegelse, morfogenese og innpakning av virus under virusreplikasjon. Ennå ukarakteriserte vaccinia virale proteiner kan også bli merket og studert av denne teknikken.

Vaccinia virus har blitt mye brukt i avbildningsstudier på grunn av mange egenskaper av viruset som er gunstige for levende cellemikroskopi. Fluorescerende koder uttrykkes fra det virale genomet, og eliminerer behovet for transfeksjon, slik at primære celler avledet fra infiserte dyr eller ikke-overførbare celler enkelt kan analyseres. I utgangspunktet ble fluorescerende VACVer brukt til enkel subcellulær sporing av virusbevegelse30, men nyere tilnærminger har utvidet verktøyet til å omfatte FRET-studier31, FRAP ved enkeltviruspartikler32, promotorreportere33, intravital avbildning34og strukturelle studier35-37. Alle disse teknikkene kan være innenfor enklere og nærmere rekkevidde kombinert med denne metoden for å skape rekombinante fluorescerende virus.

Disclosures

Ingen interessekonflikter er erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Australian Research Council Federation Discovery Project grant #1096623.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycophenolic acid Sigma-Aldrich M3536-50MG Dissolve in 0.1 N NaOH
Xanthine Sigma-Aldrich X0626-5G Dissolve in 0.1 N NaoH
FuGENE HD transfection reagent Promega E2311  
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 Olympus, Chroma BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fenner, F. Adventures with poxviruses of vertebrates. FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).
  2. Goebel, S. J., et al. The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus. Virology. 179, 247-266 (1990).
  3. Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat. J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).
  4. Roberts, K. L., Smith, G. L. Vaccinia virus morphogenesis and dissemination. Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).
  5. Gammon, D. B., Evans, D. H. The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination. J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).
  6. Yao, X. D., Evans, D. H. Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination. J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).
  7. Ward, B. Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. Isaacs, S. N. 16, Humana Press. 205-218 (2004).
  8. Smith, G. L., Moss, B. Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000. Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).
  9. Heuser, J. Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic "honeycomb" surface coat. J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).
  10. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. Poxvirus host cell entry. Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).
  11. Ward, B. M. Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions. J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).
  12. Carter, G. C., et al. Vaccinia virus cores are transported on microtubules. J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).
  13. Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).
  14. Rodriguez, J. F., Esteban, M. Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants. J. Virol. 63, 997-1001 (1989).
  15. Blasco, R., Moss, B. Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation. Gene. 158, 157-162 (1995).
  16. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).
  17. Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression. Gene. 47, 193-199 (1986).
  18. Falkner, F. G., Moss, B. Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).
  19. Liu, G. Q., et al. Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker. Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).
  20. Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).
  21. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).
  22. Cordeiro, J. V., et al. F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection. Plos One. 4, (2009).
  23. Jensen, O. N., et al. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).
  24. Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen. J. Virol. 58, 757-764 (1986).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for. 22, 445-449 (2004).
  26. Shu, X. K., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. Plos Biol. 9, (2011).
  27. Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection. J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).
  28. Broder, C. C., Earl, P. L. 62, 173-197 (1997).
  29. Blasco, R., Moss, B. Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein. J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).
  30. Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J. Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus. Viral Transport, Assembly and Egress. Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. , Research Signpost. 155-177 (2011).
  31. Jeshtadi, A., et al. Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).
  32. Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility. Nature. 458, (2009).
  33. Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).
  34. Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors. Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).
  35. Humphries, A. C., et al. Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread. Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).
  36. Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy. J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).
  37. Horsington, J., et al. A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus. PLoS Pathog. 9, (2013).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 83 vacciniavirus fluorescerende protein rekombinant virus forbigående dominerende utvalg avbildning subcellulær transport
Metodikk for effektiv generering av fluorescerende tagged vacciniavirusproteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marzook, N. B., Procter, D. J.,… More

Marzook, N. B., Procter, D. J., Lynn, H., Yamamoto, Y., Horsington, J., Newsome, T. P. Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (83), e51151, doi:10.3791/51151 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter