Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Metode til effektiv generering af fluorescerende mærkede Vaccinia Virus Proteiner

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/51151
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1
1School of Molecular Bioscience, University of Sydney, 2Department of Medicine, Center for Vascular Research, 3Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science, University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

En hurtig og modulær protokol for generering af rekombinante vacciniavirus, der udtrykker fluorescerende mærkede proteiner samtidig ved hjælp af metoden til forbigående dominerende udvælgelse, er beskrevet her.

Abstract

Mærkning af virale proteiner med fluorescerende proteiner har vist sig at være en uundværlig tilgang til at fremme vores forståelse af virus-vært interaktioner. Vacciniavirus (VACV), den levende vaccine, der anvendes til udryddelse af kopper, kan især tilskrives fluorescerende mikroskopi i levende celler på grund af dens store virionsstørrelse og den lethed, hvormed den kan konstrueres på genomniveau. Vi rapporterer her en optimeret protokol til generering af rekombinante vira. De minimale krav til målrettet homolog rekombination under vaccinia replikation blev bestemt, hvilket gør det muligt at forenkle konstruktionsgenereringen. Dette gjorde det muligt for alliancen af forbigående dominerende udvælgelse (TDS) med en fluorescerende reporter og metabolisk udvælgelse at give en hurtig og modulær tilgang til fluorescerende etiket virale proteiner. Ved at strømline generering af fluorescerende rekombinante vira, er vi i stand til at lette downstream applikationer såsom avanceret billedbehandling analyse af mange aspekter af virus-host samspil, der opstår under virus replikering.

Introduction

Vaccinia virus (VACV) er prototypisk poxvirus og stærkt relateret til variola virus, det forårsagende middel af kopper. Begge disse vira er medlemmer af orthopox slægten, der omfatter andre bemærkelsesværdige patogener såsom monkeypox og ectromelia virus (mousepox)1. Orthopoxvirus har store dobbeltstrengede DNA-genomer (180-220 kb), der koder op mod 200 forudsagte åbne læserammer2,3. Replikering af disse vira indebærer dannelsen af en perinuklear virusfabrik, hvor modne vira (MV) fremstilles, og trans-Golgi-netværket, hvor en delmængde af MV erhverver to ekstra membraner til at generere indpakkede vira (WV) (gennemgået af Roberts og Smith4). Orthopox genomer er meget modtagelige for genmanipulation på grund af den høje grad af genetisk rekombination, der er et træk ved VACV genomreplikation og formidles af den virale DNA polymerase5. Generering af rekombinante vira er afhængig af homolog rekombination og lineære DNA-molekyler med homologier så små som 12 bp er tilstrækkelige til at mægle rekombination i vaccinia virusinficerede celler6. Fluorescerende mærkning af vacciniavirus kan give ekstremt lyse viruspartikler på grund af orthopoxpartiklernes store størrelse, hvilket gør det muligt at inkorporere mange fluorescerende proteiner pr. Virion7. Vaccinia har kapacitet til at bære store fragmenter af udenlandsk DNA8, og desuden kan manglen på stiv kapitidsymmetri tillade en vis fleksibilitet, når de udtrykker virale proteingenfusioner fra deres endogene loci9. Fluorescerende mærkning af VACV-proteiner har vist sig at være uvurderlig for undersøgelsen af interaktioner mellem vært og patogen på subcellulært niveau, navnlig inden for virusindtræden10, transport11-13og morfogenese , især af indpakkede virions7.

Rekombinant virus kan vælges ved redning af en svækket vækst fænotype14,15, metabolisk udvælgelse16-18, eller ved udtryk for en markør gen (f.eks X-gal19 eller fluorescerende protein13,20). Her beskriver vi udvælgelsen af fluorescerende vira ved hjælp af en kraftig kombination af fluorescerende og metabolisk udvælgelse. Forbigående dominerende udvælgelsesvektorer (TDS), udviklet af Faulkner og Moss (1990)21, gør det muligt at integrere markører sammen med det ønskede fluorescerende mærkede gen af interesse. Når metabolisk udvælgelse fjernes, kan der forekomme en sekundær rekombinationshændelse, som punktafgifter udvælgelsesgener, men efterlader det fluorescerende mærkede virusprotein intakt. Figur 2 nedenfor giver et overblik over forsøgsproceduren. De udvælgelsesgener, der anvendes i denne undersøgelse, er mCherry og Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase(gpt) genet,begge udtrykt fra en syntetisk tidlig / sen viral promotor og brugt tidligere af Cordeiro et al. 22 Desuden er der fluorescens af det mærkede fusionsprotein af interesse. Når metabolisk udvælgelse fjernes, fjernes de valgbare markører (mCherry og gpt), så kun det mærkede gens fluorescens efterlades, hvilket gør det muligt at identificere de korrekte rekombinante vira. Udskæringen af udvælgelsesmarkørerne giver mulighed for at kombinere flere fluorescerende tags, så vi kan skabe vira med evnen til at fluorescerende mærke flere virale proteiner samtidigt. Tidligere undersøgelser har bestemt de minimale homologiske krav til vaccinia rekombination af lineære og cirkulære DNA-molekyler, der er omdannet til vaccinia virusinficerede celler6. Vi ønskede at bestemme rekombination effektivitetsgevinster af varierende homologi længder af flankerende arme i gpt-mCherry TDS vektor gennem dens inkorporering i vaccinia virale genom. Det blev fastslået, at homologe regioner på 100 basispoint i TDS-vektoren er tilstrækkelige til at målrette og mægle i indsættelsen af rekombinant DNA i VACV-genomet ved homolog rekombination (figur 4). Mens mindre homologi længder også ville muliggøre rekombination, 100 bp homologi længder forudsat nok rekombinant virus, der let kunne identificeres med metaboliske og fluorescerende udvælgelse. DNA-fragmenter af denne størrelse kan kommercielt syntetiseres til relativt lave omkostninger og letter i høj grad produktionen af flere vektorer til oprettelse af rekombinante vira. Vi valgte at øge homologilængden til 150 basispoint for at give større rekombinationsfrekvens, samtidig med at vi holdt omkostningerne ved syntesen af oligonukleotidsekvensen i flankerende regioner nede.

Protocol

1. Oprettelse af rekombination Vector

  1. Identificer 150 bp lange flankerende regioner af homologi (benævnt venstre og højre arme), der kræves for enten N- eller C-terminalt at mærke det virale gen af interesse (se figur 1b).
  2. Design en oligonukleotidsekvens bestående af de 150 bp venstre og højre arme adskilt af et par begrænsende steder efter eget valg. Hele denne sekvens skal også flankeres af et andet par begrænsningssteder (forskellig fra det første par) for at tillade inkorporering i TDS-vektoren, når den er syntetiseret. Vær forsigtig, når du designer oligonukleotid med begrænsning websteder, at sekvenserne er i ramme med den ønskede indsættelse site.
  3. Der skal være begrænsninger mellem venstre og højre arme, når du designer oligonukleotid til syntese, som skal svare til dem, der flankerer den åbne læseramme for det foretrukne fluorescerende mærke (se figur 1b). Det er muligt at bruge et NotI-begrænsningssted som tre aminosyreforbindelse mellem venstre arm og starten af fluorescerende tag.
  4. Indarbejde de samme begrænsningssteder på begge sider af fluorescerende tag ved PCR (se figur 1c).
  5. Klon det syntetiserede fragment ind i TDS-vektoren.
  6. Klon fluorescerende tag i den resulterende rekombination vektor ved hjælp af begrænsning steder i mellem venstre og højre arm regioner homologi (se figur 1d).

2. Rekombinant virusgenerering

  1. I henhold til figur 2skal du inficere et monolag af BS-C-1-celler med vacciniavirus i serumfrie medier ved en multiplicitet af infektion (MOI) > 1.
  2. 1 time efter infektion, redningsceller med Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) og transfect med en blanding af rekombination vektor plasmid og transfekt reagens i et forhold på 3:1 i serum-fri medier.
  3. Efter 24 timer skrabes og genvindes celler i DMEM, der ikke indeholder føtalt kvægserum (FBS), og der udføres tre fryseoptøende cyklusser for at bryde åbne celler og frigive viruspartikler.
  4. Der foretages en plakanalyse med et flydende overlejringsdrab på 10 % FBS DMEM og GPT-udvælgelsesreagenser mycophenolsyre (25 μg/ml) og xanthin (250 μg/ml) som følger:
    1. Seed en 6-brønds plade med et monolag af BS-C-1 celler.
    2. Inficere 100% sammenficeringscellemonomerer med serielle fortyndinger af de fryseoptøede celler, der indeholder viruspartikler, for at sikre tilstrækkelig adskillelse af individuelle plaques.
    3. Overlejring med flydende 10% FBS indeholdende DMEM, der indeholder GPT-udvælgelsesreagenserne - mycophenolsyre og xanthin ved endelige koncentrationer på henholdsvis 25 μg/ml og 250 μg/ml.
  5. Efter en 24 timers inkubation skal du fjerne det flydende overlay og bruge et fluorescerende mikroskop til at lede efter plaques, der udviser diffus rød fluorescens svarende til inkorporering af mCherry fra TDS-vektoren i virussen. Afhængigt af målgenet og det valgte fluorescerende mærke kan lokaliseret fluorescens af det mærkede gen også observeres i den samme røde plak.
  6. Vælg flere plaques for hver rekombinant virus ved lokaliseret skrabning med en pipettespids og 100 μl af 5% FBS indeholdende DMEM for at overføre celler til et Eppendorf-rør efterfulgt af tre runder af fryseoprydning af skrabede celler for at frigive rekombinante vira.
  7. Tilsæt DMEM indeholdende fryseopvøet virus til et monolag af celler i en 12-brønds plade for at forstærke rekombinante vira med GPT-udvælgelsesreagenser i vækstmedierne. Skrab vellykkede forstærkninger 24 timer efter infektion.
  8. Udfør en plakanalyse af forstærkede plaques, der udviser rød fluorescens, denne gang med et agaroseoverlay og GPT-valg, som følger:
    1. Seed en 6-brønds plade med et monolag af BS-C-1 celler.
    2. Udfør en seriel fortynding af de rekombinante vira og inficere brønde med en stigende fortynding af vira i FBS gratis DMEM.
    3. 1 time efter infektion, fjern det flydende medie og overlejr hver brønd med 0,5% agarose i minimalt essentielt medium (MEM), der indeholder 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin sammen med GPT-udvælgelsesreagenserne.
  9. 2-3 dage efter infektion, pick plaques viser fluorescens, der er både rød og farven på den valgte fluorescerende tag til at forstærke igen, denne gang uden GPT udvælgelse.
  10. Udfør den næste plakanalyse med et agaroseoverlejring uden valg.
  11. Vælg plaques, der har mistet deres diffuse røde fluorescens, men bevarer den lokaliserede fluorescens svarende til tag valg.
  12. Fortsæt plakrensning uden valg for at opnå et rent lager af rekombinante vira, der har mistet mCherry- og gpt-udvælgelsesgenerene, men bevarer den lokaliserede fluorescens, der svarer til det valgte tag. Check bestande er rene ved plak analyse, bør alle plaques have en lignende plak fænotype.
  13. Brug PCR-screening af genomisk DNA for at sikre, at virale lagre er rene.
    1. Design primere, der flankerer det fluorescerende genindføringssted og primere, der forstærker selve det indsatte fluorescerende gen. Forskellige kombinationer af disse primere vil producere PCR amplicons, der vil opdage genindsættelse og angive renhed.
    2. Amplify viral bestande, der skal PCR screenes i en brønd af en 12-brønd plade monolayer af BS-C-1 celler.
    3. 24 timer efter infektion skrabes inficerede celler i 250 μl DMEM.
    4. Centrifugeinficerede celler (18.000 x g i 10 minutter, 4 °C), fjern supernatant og resuspend cellepille i 500 μl TE (10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA, pH 8) med 0,1% (v/v) SDS. Hvirvel til lyse celler.
    5. Tilsæt 500 μl phenol-chloroform-isoamylalkohol, inverter for at blande. Centrifuge (18.000 x g i 4 min., 4 °C). Tag supernatanten og gentag.
    6. Der skal foretages en ethanoludfældning på supernatanten ved at tilsætte 1 ml 100% ethanol (kølet) og 50 μl natriumacetat, inverteres for at blande.
    7. Lad ved -20 °C natten over eller -80 °C stå i 1 time. Centrifuge (18.000 x g i 30 min,4 °C), fjern al væske og lad udfældet DNA lufttørre. Genbrugt i 50 μl TE.
    8. Brug dette som skabelon til genomisk DNA PCR-screening.

3. Generation af rekombinant virus transporterer mere end ét tag

  1. Coinfect den samme celle monolayer med fluorescerende rekombinant virus til at skabe dobbelt-eller tredobbelt-mærket virus eller gentage procedure fra protokol 1) med en anden tag.
  2. Rense virus baseret på plak fænotype eller PCR screening af virus isolere genomisk DNA.

Representative Results

Figur 1 viser de forskellige konstruktioner, der kræves til denne procedure, som enten syntetiseres (Figur 1b og 1c) eller oprettes ved kloningstrin (figur 1d). Figur 2 giver en oversigt over forsøgsproceduren med repræsentative fluorescerende plakbilleder af en A3-GFP-rekombinant VACV afbildet for hvert trin i udvælgelsesprocessen. I figur 3vises rekombinante vacciniavirus, der udtrykker proteiner mærket med fluorescerende markører rettet mod virale strukturelle proteiner A3 og F13, som er en del af henholdsvis den indre viruskerne23 og den ydre ramme24. Observationer af virale plaques og inficerede celler for hver af de rekombinante vira, der skabes, er afbildet. Effektiviteten af homolog rekombination af vektorer med VACV-genomet, der indeholder så lavt som 70 bp-regioner af homologi til det, blev testet, og resultaterne er afbildet i figur 4. Den relative succes med at identificere viral plaques lavet af rekombination med vektorer, der indeholder 100 bp homologi var ræsonnementet bag at vælge at syntetisere 150 bp længde venstre og højre arme af homologi til målet genet.

Figure 1
Figur 1. TDS-rekombinationsvektor (Transient Dominant Selection). (a) TDS-vektor med gpt- og mCherry-markeringsmarkører. b)Homologiens venstre og højre arme er konstrueret med specifikke begrænsningssteder mellem og flankerende homologiske arme. Begrænsningssteder mellem venstre og højre arme, der blev brugt i denne metode, var NotI og BamHI, Hvor NotI-stedet også blev brugt som linker mellem genet og fluorescerende tag. c) Lysstofrør, der er kompatible med denne metode, flankeres af tilsvarende restriktionssteder. Nogle anvendte tags er GFP (grøn fluorescerende protein), RFP (rødt fluorescerende protein), Cerulean (en forbedring af ECFP, et cyan fluorescerende protein, ved site-directed mutagenesis25) og mini-SOG, et fluorescerende protein manipuleret fra GFP, som skaber et produkt, der kan løses af EM på belysning26. d) Kloningstrin, der er involveret i generering af den endelige TDS-rekombinationsvektor. Det syntetiserede oligonukleotid, der indeholder venstre og højre flankerende arme, klones først i TDS-vektoren. Dette giver en rekombination vektor, hvor ethvert tag valg kan shuttled ind og ud ved kloning i begrænsning steder indarbejdet i mellem venstre og højre arme. Klik her for at se større billede.

Figure 2
Figur 2. Oversigt over forsøgsproceduren for at skabe en rekombinant vacciniavirus. Hændelser, der forekommer på det genetiske og cellulære niveau, afbildes sammen med repræsentative plaquebilleder, der skitserer trinene efter oprettelsen af en A3-GFP-mærket fluorescerende vacciniavirus. (A) Celler inficeret med vaccinia virus er transfected med TDS rekombination vektor. (B) I dette tal er det kun resultatet af rekombinationen, der er tilbagekombinering, der er afbildet, og eksemplet bruger GFP som det foretrukne fluorescerende mærke. Højre rekombination ville resultere i, at hele TDS plasmid blev indarbejdet i genomet på samme måde, bortset fra at mærket ville blive smeltet sammen til hele målgenet i det mellemliggende trin, dvs. En plakanalyse udføres på en cellemonomer med rekombinationsblandingen og udsættes for GPT-udvælgelse. (C) Plaques, der udviser både rød og grøn fluorescens, svarende til henholdsvis mCherry- og GFP-udtryk, plukkes og forstærkes. Når udvælgelsen er fjernet, vil der være tab af rød fluorescens svarende til tabet af gpt og mCherry gener (D) og plaques udstiller udelukkende grøn fluorescens er plukket og forstærket (E). Klik her for at se større billede.

Figure 3
Figur 3. Repræsentative resultater af TDS-rekombinationssystemet. Billeder viser hele plaques af rekombinant VACV, der inficerer celler efter 48 timer (a, c, e; skalastang 100 μm), ledsaget af et billede af en enkelt celle inficeret med den tilsvarende rekombinant virus efter 8 timer (b, d, f; skalastang 10 μm). Gener svarende til virion-lokaliserede proteiner blev udvalgt til at visualisere viruspartikler. A3 er et kerneprotein af vaccinia virion (a, b) og F13 (c, d) er et viralt kuvertprotein. Der vises også en dobbeltmærket virus med både fluorescerende mærket A3 og F13 (e, f) . Klik her for at se større billede.

Figure 4
Figur 4. Kvantitativ analyse af rekombinationseffektivitet mellem rekombinante vektorer og VACV-genomet. BS-C-1 monolayers blev smittet med VACV og transfected 1 time efter infektion med tre rekombination vektorer, der indeholder regioner af homologi på enten 500 bp, 100 bp, eller 70 bp til VACV genom. Hver vektor indeholdt også TDS-kassetten bestående af gpt- og mCherry-udvælgelsesgener. Celler blev genvundet 24 timer efter infektion og lysed at frigive rekombinant virus dannet. Plaque assays blev udført på celle lysater med GPT udvælgelse medier og plaques viser mCherry fluorescens blev talt som vellykket rekombinanter. Klik her for at se større billede.

Figure 5
Figur 5. Kort over gpt-mCherry TDS-vektoren, der viser multikloningsstedet. Vektoren er blevet beskrevet tidligere22 og vektor kortet blev oprettet ved hjælp af EZ Plasmid Map v1.9 fra Zhang Lab Group (SCU). Klik her for at se større billede.

Discussion

Denne teknik beskriver en effektiv og modulær protokol til oprettelse af rekombinante vira, der udtrykker fluorescerende mærkede virale proteiner. Metoden sikrer, at den eneste ændring af det virale genom er tilføjelsen af et mærke eller en markør, der ikke efterlader nogen markeringsmarkører. Den korte armlængde, der kræves til homolog rekombination, muliggør dens direkte syntese, hvilket eliminerer flere tidskrævende runder pcr og kloning, mens fluorescensen af mCherry og metabolisk GPT-udvælgelse bruges til at isolere viral rekombinations intermediates. Disse mellemprodukter kan efter fjernelsen af udvælgelsen løses til en virus med et mærket gen eller tilbage til forældretypen. En lignende metode, der indebærer anvendelse af både fluorescerende og metabolisk udvælgelse, er blevet beskrevet tidligere27, selv om den metode, der anvendes i denne undersøgelse, anvender kortere, syntetiserede homologiske regioner, hvilket gør det muligt at identificere det ønskede rekombinante virus ved at billed fluorescensen af det mærkede gen af interesse. Denne sekundære udvælgelse gælder kun for mærkning af stærkt udtrykte virale gener, der producerer tilstrækkelig fluorescens i en plakanalyse. Alternativt kunne man forestille sig indsættelse af en komplet ekspressionskassette, for eksempel et fluorescerende protein under en stærk viral promotor. I dette tilfælde ville venstre og højre arme definere indsætningspunktet i stedet for det virale gen, der skal mærkes.

Der er nogle vigtige trin, der viste sig nyttige under forsøgsproceduren. Det ovenfor beskrevne flydende overlay i trin 2.3.3 viste sig at være afgørende for påvisning og isolering af røde/grønne lysstofrør. Vi mener, at kombinationen af GPT udvælgelse reagenser og agarose overlay afskrækket væksten af rekombinant virus og derfor skiftede til en flydende overlay for det første skridt af forstærkende vira efter transfekt. Det er også vigtigt at vælge fluorescerende plaques, der viser lokaliseret tagfarve fluorescens til berigelse og rensning, da mellemprodukter som følge af rekombination af venstre arm kan resultere i diffus fluorescens observeret i plaques, hvis venstre arm også indeholder en promotorsekvens. MCherry-markørgenet i TDS-vektoren kan også erstattes af gfp, for eksempel for at give mulighed for nem inkorporering og valg af mCherry som et fluorescerende tag.

Nogle teknikker, der er beskrevet ovenfor, varierer lidt fra etablerede metoder til at skabe rekombinant vacciniavirus. For eksempel er MOI af virus, der bruges til at skabe rekombinanter, normalt mindre end 128, men brugen af højere MOI'er har været tilstrækkelig til oprettelse af rekombinant vacciniavirus ved denne metode. Brugen af GPT-udvælgelsesreagenser kræver normalt forbehandling af cellerne med udvælgelsesreagenser18, men hvis de tilføjes under redningsfasen efter infektionen, er der stadig tilstrækkeligt udvalg af de ønskede rekombinanter, især på grund af tilstedeværelsen af en fluorescerende markeringsmarkør.

Som tidligere nævnt er en af begrænsningerne ved denne teknik, at det sekundære fluorescensvalgstrin er afhængig af, at det mærkede protein af interesse udtrykkes højt på et niveau, der gør det muligt at detektere det med øjet i en plakanalyse. Uden dette ville det være muligt at rense vira, der kun udviste mCherry-fluorescens, hvoraf mindst 50% ville indeholde de ønskede rekombinante vira, som kunne identificeres ved molekylære strategier som PCR beskrevet i trin 2.12 ovenfor. En anden begrænsning kunne være inaktivering af visse proteiner som følge af deres mærkning. Det fluorescerende mærke kan gennemgå mutationer eller blive fjernet af rekombinant virus med passaging over tid. Derfor anbefales regelmæssig prøveudtagning af rekombinante viruslagre ved mikroskopi og PCR. Endelig kan der være en grænse for antallet af fluorescerende mærkede proteiner, der kan indarbejdes i en enkelt virus. Et aspekt af dette er evnen til at visualisere dem alle samtidigt; I betragtning af emissionsspektre af tilgængelige lysstofrør er det vigtigt at udvælge dem omhyggeligt for at sikre minimal spektralblødning. Derudover åbner brug af nært beslægtede tags som GFP og Cerulean muligheden for rekombination mellem de to, afhængigt af deres placeringer i det rekombinante genom.

Den modulære karakter af denne teknik gør det muligt at erstatte fluorescerende tags baseret på kompatibilitet med andre farvning og / eller tag valg. Ved at ekscisere markører, der kan vælges, giver TDS-metoden mulighed for seriel tilsætning af forskellige fluorescerende proteiner eller kombination af TDS-baseret mærkning med TDS-baserede gensletninger til fænotypiske analyser29. Som et eksempel på nytten af denne tilgang blev der genereret en dobbeltmærket fluorescerende virus, der mærker viruskerner og WV-membranen. Imaging undersøgelser med denne virus kan bruges til at studere bevægelse, morfogenese og indpakning af virus under virus replikation. Endnu ukarakteriserede vaccinia virale proteiner kan også mærkes og studeres ved denne teknik.

Vaccinia virus er blevet flittigt brugt i billeddiagnostiske undersøgelser på grund af mange egenskaber ved virus, der er gunstige for levende celle mikroskopi. Fluorescerende tags udtrykkes fra det virale genom, hvilket eliminerer behovet for transfekt, hvilket gør det muligt let at analysere primære celler fra inficerede dyr eller ikke-transfektable celler. I første omgang, fluorescerende VACVs blev brugt til simple subcellulære sporing af virus bevægelse30, men nyere tilgange har udvidet deres nytte til at omfatte FRET undersøgelser31, FRAP på enkelt virus partikler32, promotor reportere33, intravital imaging34, og strukturelle undersøgelser35-37. Alle disse teknikker kunne være inden for lettere og tættere rækkevidde kombineret med denne metode til at skabe rekombinante fluorescerende vira.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af The Australian Research Council Federation Discovery Project tilskud #1096623.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycophenolic acid Sigma-Aldrich M3536-50MG Dissolve in 0.1 N NaOH
Xanthine Sigma-Aldrich X0626-5G Dissolve in 0.1 N NaoH
FuGENE HD transfection reagent Promega E2311  
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 Olympus, Chroma BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fenner, F. Adventures with poxviruses of vertebrates. FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).
  2. Goebel, S. J., et al. The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus. Virology. 179, 247-266 (1990).
  3. Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat. J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).
  4. Roberts, K. L., Smith, G. L. Vaccinia virus morphogenesis and dissemination. Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).
  5. Gammon, D. B., Evans, D. H. The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination. J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).
  6. Yao, X. D., Evans, D. H. Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination. J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).
  7. Ward, B. Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. Isaacs, S. N. 16, Humana Press. 205-218 (2004).
  8. Smith, G. L., Moss, B. Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000. Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).
  9. Heuser, J. Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic "honeycomb" surface coat. J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).
  10. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. Poxvirus host cell entry. Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).
  11. Ward, B. M. Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions. J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).
  12. Carter, G. C., et al. Vaccinia virus cores are transported on microtubules. J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).
  13. Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).
  14. Rodriguez, J. F., Esteban, M. Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants. J. Virol. 63, 997-1001 (1989).
  15. Blasco, R., Moss, B. Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation. Gene. 158, 157-162 (1995).
  16. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).
  17. Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression. Gene. 47, 193-199 (1986).
  18. Falkner, F. G., Moss, B. Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).
  19. Liu, G. Q., et al. Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker. Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).
  20. Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).
  21. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).
  22. Cordeiro, J. V., et al. F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection. Plos One. 4, (2009).
  23. Jensen, O. N., et al. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).
  24. Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen. J. Virol. 58, 757-764 (1986).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for. 22, 445-449 (2004).
  26. Shu, X. K., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. Plos Biol. 9, (2011).
  27. Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection. J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).
  28. Broder, C. C., Earl, P. L. 62, 173-197 (1997).
  29. Blasco, R., Moss, B. Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein. J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).
  30. Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J. Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus. Viral Transport, Assembly and Egress. Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. , Research Signpost. 155-177 (2011).
  31. Jeshtadi, A., et al. Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).
  32. Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility. Nature. 458, (2009).
  33. Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).
  34. Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors. Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).
  35. Humphries, A. C., et al. Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread. Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).
  36. Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy. J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).
  37. Horsington, J., et al. A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus. PLoS Pathog. 9, (2013).

Tags

Immunologi og infektion Problem 83 vaccinia virus fluorescerende protein rekombinant virus forbigående dominerende udvælgelse billeddannelse subcellulær transport
Metode til effektiv generering af fluorescerende mærkede Vaccinia Virus Proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marzook, N. B., Procter, D. J.,… More

Marzook, N. B., Procter, D. J., Lynn, H., Yamamoto, Y., Horsington, J., Newsome, T. P. Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (83), e51151, doi:10.3791/51151 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter