Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Metodik för effektiv generering av fluorescerande märkta vacciniavirusproteiner

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/51151
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1
1School of Molecular Bioscience, University of Sydney, 2Department of Medicine, Center for Vascular Research, 3Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science, University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Ett snabbt och modulärt protokoll för generering av rekombinanta vacciniavirus som uttrycker fluorescerande märkta proteiner samtidigt med hjälp av metoden för övergående dominerande urval beskrivs här.

Abstract

Märkning av virusproteiner med fluorescerande proteiner har visat sig vara ett oumbärligt tillvägagångssätt för att främja vår förståelse av virus-värdinteraktioner. Vacciniavirus (VACV), det levande vaccinet som används vid utrotning av smittkoppor, är särskilt mottagligt för fluorescerande levande cellmikroskopi på grund av dess stora virionsstorlek och den lätthet med vilken det kan konstrueras på genomnivå. Vi rapporterar här ett optimerat protokoll för att generera rekombinanta virus. De minimala kraven för riktad homolog rekombination under vaccinia replikering fastställdes, vilket möjliggör förenkling av konstruktion generation. Detta möjliggjorde alliansen av transient dominerande urval (TDS) med en fluorescerande reporter och metaboliskt urval för att ge en snabb och modulär strategi för fluorescerande etikett virala proteiner. Genom att effektivisera genereringen av fluorescerande rekombinanta virus kan vi underlätta nedströmsapplikationer som avancerad bildanalys av många aspekter av virus-värd samspelet som uppstår under virusreplikation.

Introduction

Vaccinia virus (VACV) är prototypiska poxvirus och mycket relaterade till variola virus, orsakssambandet till smittkoppor. Båda dessa virus är medlemmar av ortopoxläktet som innehåller andra anmärkningsvärda patogener som monkeypox och ectromelia virus (mousepox)1. Ortopedvirus har stora dubbelsträngade DNA-genom (180-220 kb) som kodar uppemot 200 förväntade öppna läsramar2,3. Replikering av dessa virus innebär bildandet av en perinukleär virusfabrik, där mogna virus (MV) tillverkas, och trans-Golgi-nätverket där en delmängd av MV förvärvar ytterligare två membran för att generera inslagna virus (WV) (granskas av Roberts och Smith4). Ortopedigenom är mycket mottagliga för genetisk manipulering på grund av den höga graden av genetisk rekombination som är ett inslag i VACV-genomreplikation och förmedlas av den virala DNA-polymerasen5. Att generera rekombinanta virus bygger på homolog rekombination och linjära DNA-molekyler med homologier så små som 12 bp är tillräckliga för att medla rekombination i vaccinia virusinfekterade celler6. Fluorescerande märkning av vacciniavirus kan ge extremt ljusa viruspartiklar på grund av den stora storleken på ortopoxpartiklar, vilket gör det möjligt att införliva många fluorescerande proteiner per virion7. Vaccinia har kapacitet att bära stora fragment av främmande DNA8 och dessutom kan bristen på styv kapsidsymmetri tillåta en viss flexibilitet när man uttrycker virala proteingenfusioner från deras endogena lokus9. Fluorescerande märkning av VACV-proteiner har visat sig vara ovärderlig för studier av värdpatogeninteraktioner på subcellulär nivå, särskilt inom området för virusinmatning10,transport11-13, och morfogenes, särskilt av inslagna virioner7.

Rekombinanta virus kan väljas genom räddning av en försvagad tillväxtfenotyp 14,15,metaboliskturval 16-18, eller genom uttryck av en markörgen (t.ex. X-gal19 eller fluorescerande protein13,20). Här beskriver vi valet av fluorescerande virus med hjälp av en kraftfull kombination av fluorescerande och metaboliskt urval. Transient dominerande urval (TDS) vektorer, utvecklat av Faulkner och Moss (1990)21, tillåter markörer att integreras tillsammans med den önskade fluorescerande taggade genen av intresse. När metaboliskt urval tas bort kan en sekundär rekombinationshändelse inträffa som tar bort urvalsgenerna, men lämnar det fluorescerande märkta virusproteinet intakt. Figur 2 nedan ger en översikt över försöksförfarandet. De urvalsgener som används i denna studie är mCherry och genen Escherichia coli guanine fosforibosyltransferase (gpt), båda uttryckta från en syntetisk tidig/sen viral promotor och används tidigare av Cordeiro et al. 22 Dessutom finns det fluorescens av det märkta fusionsproteinet av intresse. När metaboliskt val tas bort strukits de valbara markörerna (mCherry och gpt) och lämnar endast fluorescensen hos den märkta genen, vilket gör det möjligt att identifiera rätt rekombinanta virus. Excisionen av urvalsmarkörerna ger möjlighet att kombinera flera fluorescerande taggar, vilket gör det möjligt för oss att skapa virus med förmågan att fluorescerande märka flera virusproteiner samtidigt. Tidigare studier har fastställt de minimalahomologiska kraven för vaccinia rekombination av linjära och cirkulära DNA-molekyler transfecterade till vaccinia virusinfekterade celler6. Vi ville fastställa rekombination effektivitet av varierande homology längder av flankerande armar i gpt-mCherry TDS vektor genom dess införlivande i vaccinia viral genom genom. Det fastställdes att homologa regioner på 100 bp i TDS-vektorn är tillräckliga för att rikta in sig på och förmedla införandet av rekombinant DNA i VACV-genomet genom homolog rekombination (figur 4). Medan mindre homologi längder skulle också möjliggöra rekombination, 100 bp homology längder gav tillräckligt rekombinanta virus som lätt kan identifieras med metabola och fluorescerande urval. DNA-fragment av denna storlek kan syntetiseras kommersiellt till relativt låg kostnad och underlättar i hög grad produktionen av flera vektorer för att skapa rekombinanta virus. Vi valde att öka homologi längd till 150 bp att ge större rekombination frekvens samtidigt hålla nere kostnaderna för syntes av oligonucleotide sekvensen av flankerande regioner.

Protocol

1. Skapa rekombinationsvektorn

  1. Identifiera 150 bp långa flankerande regioner inom homologin (kallas vänster och höger armar) som krävs för att antingen N- eller C-terminalt märka den virala genen av intresse (se figur 1b).
  2. Designa en sekvens av oligonukleotid som består av de 150 bp vänster och högra armarna åtskilda av ett par restriktionsplatser. Hela denna sekvens måste också flankeras av ett andra par begränsningsplatser (som skiljer sig från det första paret) för att tillåta införlivande i TDS-vektorn när den syntetiserats. Var försiktig när du utformar oligonukleotid med begränsningsplatser att sekvenserna är i ram med önskad insättningsplats.
  3. Inkorporera begränsningsplatser mellan vänster och höger arm när oligonukleotid utformas för syntes, som måste matcha dem som flankerar den öppna läsramen på den fluorescerande taggen (se figur 1b). Det är möjligt att använda en NotI begränsning webbplats som en tre aminosyra länkare mellan vänster arm och början av fluorescerande taggen.
  4. Införliva samma begränsningsplatser på vardera sidan av den fluorescerande taggen med PCR (se figur 1c).
  5. Klona det syntetiserade fragmentet till TDS-vektorn.
  6. Klona den fluorescerande taggen till den resulterande rekombinationsvektorn med hjälp av begränsningsplatserna mellan homologins vänstra och högra armområden (se figur 1d).

2. Rekombinant virusgenerering

  1. Enligt figur 2infekterar du ett monolager av BS-C-1-celler med vacciniavirus i serumfria medier vid en multiplikitet av infektion (MOI) > 1.
  2. 1 timme efter infektion, räddningsceller med Dulbeccos Modifierade Örn medium (DMEM) och transfekt med en blandning av rekombination vektorplasmid och transfection reagens i ett förhållande av 3:1 i serum-fria medier.
  3. Efter 24 timmar skrapa och återhämta celler i DMEM som inte innehåller något fetalt bovint serum (FBS) och utför tre frys-tina cykler för att bryta öppna celler och frigöra viruspartiklar.
  4. Utför en plackanalys med ett flytande överlägg på 10% FBS DMEM och GPT urval reagenser mykophenolsyra (25 μg/ml) och xantin (250 μg/ml) enligt följande:
    1. Frö en 6-brunnsplatta med ett monoskikt av BS-C-1-celler.
    2. Infektera 100% konfluenta cellmonoskikt med seriella utspädningar av de frys tinade cellerna som innehåller viruspartiklar för att säkerställa adekvat separation av enskilda plack.
    3. Överlägg med flytande 10% FBS innehållande DMEM som innehåller GPT-urvalsreagenserna - mykophenolsyra och xantin vid slutliga koncentrationer på 25 μg/ml respektive 250 μg/ml.
  5. Efter en 24 timmars inkubation, ta bort vätskeöverlägget och använd ett fluorescerande mikroskop för att leta efter plack som uppvisar diffus röd fluorescens som motsvarar införlivandet av mCherry från TDS-vektorn i viruset. Beroende på målgenen och vald fluorescerande tagg kan lokaliserad fluorescens av den taggade genen också observeras i samma röda plack.
  6. Välj flera plack för varje rekombinant virus genom lokaliserad skrapning med en pipettspets och 100 μl 5% FBS som innehåller DMEM för att överföra celler till ett Eppendorf-rör, följt av tre omgångar frysupptining av skrapade celler för att frigöra rekombinanta virus.
  7. Tillsätt DMEM som innehåller frys tinat virus till ett monolager av celler i en 12-brunnsplatta för att förstärka rekombinanta virus med GPT-urvalsreagenser i tillväxtmedierna. Skrapa framgångsrika förstärkningar 24 timmar efter infektion.
  8. Utför en plackanalys av framgångsrikt förstärkta plack som uppvisar röd fluorescens, den här gången med ett agarose-överlägg och GPT-urval, enligt följande:
    1. Frö en 6-brunnsplatta med ett monoskikt av BS-C-1-celler.
    2. Utför en seriell utspädning av rekombinanta virus och infektera brunnar med en ökande utspädning av virus i FBS-fria DMEM.
    3. 1 timme efter infektion, ta bort vätskemediet och överlagra varje brunn med 0,5% agarose i minimalt essentiellt medium (MEM) som innehåller 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin, tillsammans med GPT-valreagenserna.
  9. 2-3 dagar efter infektion, välj plack som visar fluorescens som är både röd och färgen på den valda fluorescerande taggen för att förstärka igen, den här gången utan GPT-val.
  10. Utför nästa plackanalys med ett agaroseöverlägg utan val.
  11. Välj plack som har förlorat sin diffusa röda fluorescens men behåller den lokaliserade fluorescensen som motsvarar den valfria taggen.
  12. Fortsätt plackrening utan val för att få ett rent lager av rekombinanta virus som har förlorat mCherry och gpt urval gener men behålla den lokaliserade fluorescens som motsvarar den valda taggen. Kontrollera lager är rena genom plack analys, alla plack bör ha en liknande plakett fenotyp.
  13. Använd PCR-screening av genomiskt DNA för att säkerställa att viruslagren är rena.
    1. Designprimrar som flankerar den fluorescerande geninsättningsplatsen och primers som förstärker den infogade fluorescerande genen själv. Olika kombinationer av dessa primers kommer att producera PCR amplicons som kommer att upptäcka gen insättning och indikera renhet.
    2. Förstärk viruslager för att PCR-skärmas i en brunn i en 12-brunns plattmonager av BS-C-1-celler.
    3. 24 timmar efter infektion, skrapa infekterade celler i 250 μl DMEM.
    4. Centrifugera infekterade celler (18 000 x g i 10 min, 4 °C), avlägsna supernatant och återanvänd cellpellet i 500 μl TE (10 mM Tris-HCl och 1 mM EDTA, pH 8) med 0,1% (v/v) SDS. Virvel att lysa celler.
    5. Tillsätt 500 μl fenol-kloroform-isoamylakohol, invertera för att blanda. Centrifug (18 000 x g i 4 min, 4 °C). Ta supernaten och upprepa.
    6. Utför en etanolutfällning på supernatanten genom att tillsätta 1 ml 100% etanol (kyld) och 50 μl natriumacetat, inverterat för blandning.
    7. Låt 20 °C vara över natten eller -80 °C i 1 timme. Centrifuger (18 000 x g i 30 min, 4 °C), avlägsna all vätska och låt utfällt DNA lufttorka. Återanvänds i 50 μl TE.
    8. Använd detta som mall för genomisk DNA PCR-screening.

3. Generering av rekombinanta virus som bär mer än en tagg

  1. Coinfect samma cell monolayer med fluorescerande rekombinanta virus för att skapa dubbel- eller trippelmärkta virus eller upprepa proceduren från protokoll 1) med en annan tagg.
  2. Rena virus baserat på plack fenotyp eller PCR screening av virus isolera genomiskt DNA.

Representative Results

Figur 1 innehåller en förteckning över de olika konstruktioner som krävs för detta förfarande, som antingen syntetiseras (figurerna 1b och 1c) eller skapas genom kloningssteg (figur 1d). Figur 2 ger en översikt över det experimentella förfarandet med representativa fluorescerande plackbilder av en A3-GFP-rekombinant VACV avbildad för varje steg i urvalsprocessen. I figur 3visas rekombinanta vacciniavirus som uttrycker proteiner märkta med fluorescerande markörer riktade mot virusstrukturproteinerna A3 respektive F13, som ingår i det inre virusetskärna 23 respektive yttrekuvert 24. Observationer av virala plack och infekterade celler för var och en av de rekombinanta virus som skapas avbildas. Effektiviteten av homolog rekombination av vektorer med VACV-genomet, som innehåller så låga som 70 bp regioner av homologi till det, testades och resultaten avbildas i figur 4. Den relativa framgången med att identifiera virala plack gjorda av rekombination med vektorer som innehåller 100 bp homologi var resonemanget bakom valet att syntetisera 150 bp längd vänster och höger armar av homologi till mål genen.

Figure 1
Figur 1. Transient dominant val (TDS) rekombination vektor. a)TDS vektor med gpt och mCherry markeringsmarkörer. b)Homologins vänster- och högerarmar är konstruerade med särskilda begränsningsplatser däremellan och flankerar homologins armar. Begränsningsplatser mellan vänster och höger armar som används i denna metod var NotI och BamHI, NotI-platsen används också som en länkare mellan genen och fluorescerande taggen. c)Fluorescerande taggar som är kompatibla med denna metod flankeras av motsvarande begränsningsplatser. Några taggar som används är GFP (grönt fluorescerande protein), RFP (rött fluorescerande protein), Cerulean (en förbättring av ECFP, ett cyanfluorescerande protein, genom platsstyrd mutagenesis25) och mini-SOG, ett fluorescerande protein konstruerat från GFP som skapar en produkt som kan tröstas av EM på belysning26. d)Kloningssteg som är involverade i utvecklingen av den slutliga rekombinationsvektorn TDS. Den syntetiserade oligonukleotid som innehåller vänster och höger flankerande armar klonas först till TDS vektor. Detta ger en rekombinationsvektor där alla valfria taggar kan transporteras in och ut genom kloning till de begränsningsplatser som ingår mellan vänster och höger arm. Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 2
Figur 2. Översikt över det experimentella förfarandet för att skapa ett rekombinant vacciniavirus. Händelser som inträffar på genetiska och cellulära nivåer avbildas, tillsammans med representativa plackbilder som beskriver stegen efter skapandet av ett A3-GFP-märkt fluorescerande vacciniavirus. (A) Celler infekterade med vacciniavirus transfekteras med TDS rekombinationsvektor. B) I denna siffra avbildas endast resultatet av vänster rekombination och exemplet använder GFP som den fluorescerande taggen. Höger rekombination skulle leda till att hela TDS-plasmiden införlivas i genomet på ett liknande sätt, förutom att taggen skulle smältas till hela målgenen i mellansteget, dvs steg C. En plackanalys utförs på ett cellmonoskikt med rekombinationsblandningen och utsätts för GPT-val. (C) Plack som uppvisar både röd och grön fluorescens, motsvarande mCherry respektive GFP uttryck, plockas och förstärks. När urvalet har tagits bort kommer det att bli förlust av röd fluorescens motsvarande förlusten av gpt- och mCherry-generna (D)och plack som uppvisar uteslutande grön fluorescens plockas och förstärks (E). Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 3
Figur 3. Representativa resultat av TDS rekombinationssystem. Bilder visar hela plack av rekombinanta VACV-infekterande celler efter 48 timmar(a, c, e; skalstreck 100 μm), åtföljd av en bild av en enda cell infekterad av motsvarande rekombinant virus efter 8 timmar (b, d, f; skalstång 10 μm). Gener som motsvarar virion-lokaliserade proteiner valdes för att visualisera viruspartiklar. A3 är ett kärnprotein i vaccinia virion (a, b) och F13 (c, d) är ett viralt kuvertprotein. Ett dubbelmärkt virus med både fluorescerande märkt A3 och F13 (e, f) visas också. Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 4
Figur 4. Kvantitativ analys av rekombinationseffektivitet mellan rekombinanta vektorer och VACV-genomet. BS-C-1 monolayers smittades med VACV och transfected 1 timme post-infection med tre rekombination vektorer som innehåller regioner av homology av antingen 500 bp, 100 bp eller 70 bp till VACV genomet. Varje vektor innehöll också TDS kassett bestående av gpt och mCherry urval gener. Cellerna återfanns 24 timmar efter infektion och lysed för att frigöra rekombinanta virus bildas. Plack analyser utfördes på cell lysates med GPT urval media och plack som visar mCherry fluorescens räknades som framgångsrika rekombinanter. Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 5
Figur 5. Karta över gpt-mCherry TDS vektor som visar flera kloning webbplats. Vektorn har beskrivits tidigare22 och vektorkartan skapades med hjälp av EZ Plasmid Map v1.9 från Zhang Lab Group (SCU). Klicka här om du vill visa större bild.

Discussion

Denna teknik beskriver ett effektivt och modulärt protokoll för skapandet av rekombinanta virus som uttrycker fluorescerande taggade virusproteiner. Metoden säkerställer att den enda ändringen av virusgenomet är tillsats av en tagg eller markör, vilket inte lämnar några markeringsmarkörer bakom sig. Den korta armlängds avstånd som krävs för homolog rekombination möjliggör dess direkta syntes, vilket eliminerar flera tidskrävande rundor PCR och kloning, medan fluorescensen av mCherry och metaboliskt GPT-urval används för att isolera viral rekombination mellanliggande ämnen. Dessa intermediärer kan lösas, efter borttagning av urval, till ett virus med en taggad gen eller tillbaka till föräldratypen. En liknande metod som omfattar användning av både fluorescerande och metaboliska urval har beskrivitstidigare 27 även om metoden som används i denna studie använder kortare, syntetiserade regioner av homologi, vilket gör det möjligt att identifiera önskat rekombinant virus genom att avbilda fluorescensen hos den taggade genen av intresse. Detta sekundära urval är endast tillämpligt för märkning av starkt uttryckta virusgener som producerar tillräcklig fluorescens i en plackanalys. Alternativt kan man tänka sig att en komplett uttryckskassett införs, till exempel ett fluorescerande protein under en stark viral promotor. I detta fall skulle vänster och höger armar definiera insättningspunkten snarare än den virala genen som ska märkas.

Det finns några viktiga steg som visade sig vara till hjälp under experimentproceduren. Vätskeöverlägget i steg 2.3.3 som beskrivs ovan visade sig vara avgörande för detektion och isolering av röda/gröna fluorescerande plack. Vi tror att kombinationen av GPT urval reagenser och agarose överlägg avskräckte tillväxten av rekombinanta virus och därför bytte till ett flytande överlägg för det första steget att förstärka virus efter transfection. Det är också viktigt att plocka fluorescerande plack som visar lokaliserad taggfärg fluorescens för berikning och rening, eftersom intermediärer som härrör från vänster arm rekombination kan resultera i diffus fluorescens observeras i plack om vänster arm också innehåller en promotorsekvens. MCherry markör genen i TDS vektor kan också ersättas av gfp, till exempel för att möjliggöra enkel införlivande och val av mCherry som en fluorescerande tagg.

Vissa tekniker som beskrivs ovan varierar något från etablerade metoder för att skapa rekombinant vaccinia virus. Till exempel är moi av virus som används för att skapa rekombinanter normalt mindre än 128, men användningen av högre MOI har varit tillräcklig för att skapa rekombinant vacciniavirus med denna metod. Användningen av GPT urval reagenser kräver normalt preincubation av cellerna med urval reagenser18, men lägga till dem under räddningsfasen post-infektion fortfarande gav tillräckligt urval av önskade rekombinanter, särskilt på grund av förekomsten av en fluorescerande urvalsmarkör också.

Som nämnts tidigare är en av begränsningarna i denna teknik att det sekundära fluorescensvalsteget förlitar sig på att det märkta proteinet av intresse uttrycks högt, på en nivå som möjliggör dess upptäckt med öga i en plackanalys. Utan detta skulle det vara möjligt att rena virus som bara uppvisade mCherry fluorescens, varav minst 50% skulle innehålla önskade rekombinanta virus, som kan identifieras av molekylära strategier som PCR beskrivs i steg 2.12 ovan. En annan begränsning kan vara inaktivering av vissa proteiner som ett resultat av deras märkning. Fluorescerande taggen kan genomgå mutationer eller strukits av det rekombinanta viruset med passaging över tiden. Därför rekommenderas regelbunden provtagning av rekombinanta viruslager genom mikroskopi och PCR. Slutligen kan det finnas en gräns för antalet fluorescerande märkta proteiner som kan införlivas i ett enda virus. En aspekt av detta är förmågan att visualisera dem alla samtidigt; Med tanke på att utsläppsspektrat av tillgängliga fluorescerande taggar överlappar varandra är det viktigt att välja dem noggrant för att säkerställa minimal spektralblödning. Dessutom öppnar användningen av närbesläktade taggar som GFP och Cerulean möjligheten till rekombination mellan de två, beroende på deras platser i det rekombinanta genomet.

Den modulära karaktären hos denna teknik möjliggör enkel ersättning av fluorescerande taggar baserat på kompatibilitet med andra färgnings- och / eller taggval. Genom att excising valbara markörer möjliggör TDS-metoden seriell tillsats av olika fluorescerande proteiner eller kombinationen av TDS-baserad märkning med TDS-baserade genborttagningar för fenotypiska analyser29. Som ett exempel för nyttan av den här metoden genererades ett dubbelmärkt fluorescerande virus som märker viruskärnor och WV-membranet. Imaging studier med detta virus kan användas för att studera rörelse, morfogenes och inslagning av virus under virus replikering. Ännu okarakteriserade vaccinia virala proteiner kan också märkas och studeras med denna teknik.

Vacciniavirus har använts i stor utsträckning i bildstudier på grund av många egenskaper hos viruset som är gynnsamma för levande cellmikroskopi. Fluorescerande taggar uttrycks från det virala genomet, vilket eliminerar behovet av transfection, vilket gör det möjligt att enkelt analysera primärceller som härrör från infekterade djur eller icke-överförbara celler. Ursprungligen användes fluorescerande VACVs för enkel subcellulär spårning av virusrörelse30, men nyare metoder har utökat sitt användbarhet till att omfatta FRET-studier31,FRAP vid enstaka viruspartiklar32, promotorreportrar33, intravital avbildning34och strukturellastudier 35-37. Alla dessa tekniker kan vara inom enklare och närmare räckvidd i kombination med denna metod för att skapa rekombinanta fluorescerande virus.

Disclosures

Inga intressekonflikter har deklarerats.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av Australian Research Council Federation Discovery Project grant #1096623.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycophenolic acid Sigma-Aldrich M3536-50MG Dissolve in 0.1 N NaOH
Xanthine Sigma-Aldrich X0626-5G Dissolve in 0.1 N NaoH
FuGENE HD transfection reagent Promega E2311  
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 Olympus, Chroma BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fenner, F. Adventures with poxviruses of vertebrates. FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).
  2. Goebel, S. J., et al. The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus. Virology. 179, 247-266 (1990).
  3. Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat. J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).
  4. Roberts, K. L., Smith, G. L. Vaccinia virus morphogenesis and dissemination. Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).
  5. Gammon, D. B., Evans, D. H. The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination. J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).
  6. Yao, X. D., Evans, D. H. Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination. J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).
  7. Ward, B. Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. Isaacs, S. N. 16, Humana Press. 205-218 (2004).
  8. Smith, G. L., Moss, B. Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000. Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).
  9. Heuser, J. Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic "honeycomb" surface coat. J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).
  10. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. Poxvirus host cell entry. Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).
  11. Ward, B. M. Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions. J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).
  12. Carter, G. C., et al. Vaccinia virus cores are transported on microtubules. J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).
  13. Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).
  14. Rodriguez, J. F., Esteban, M. Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants. J. Virol. 63, 997-1001 (1989).
  15. Blasco, R., Moss, B. Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation. Gene. 158, 157-162 (1995).
  16. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).
  17. Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression. Gene. 47, 193-199 (1986).
  18. Falkner, F. G., Moss, B. Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).
  19. Liu, G. Q., et al. Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker. Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).
  20. Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).
  21. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).
  22. Cordeiro, J. V., et al. F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection. Plos One. 4, (2009).
  23. Jensen, O. N., et al. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).
  24. Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen. J. Virol. 58, 757-764 (1986).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for. 22, 445-449 (2004).
  26. Shu, X. K., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. Plos Biol. 9, (2011).
  27. Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection. J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).
  28. Broder, C. C., Earl, P. L. 62, 173-197 (1997).
  29. Blasco, R., Moss, B. Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein. J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).
  30. Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J. Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus. Viral Transport, Assembly and Egress. Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. , Research Signpost. 155-177 (2011).
  31. Jeshtadi, A., et al. Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).
  32. Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility. Nature. 458, (2009).
  33. Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).
  34. Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors. Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).
  35. Humphries, A. C., et al. Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread. Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).
  36. Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy. J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).
  37. Horsington, J., et al. A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus. PLoS Pathog. 9, (2013).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 83 vacciniavirus fluorescerande protein rekombinant virus övergående dominerande urval avbildning subcellulär transport
Metodik för effektiv generering av fluorescerande märkta vacciniavirusproteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marzook, N. B., Procter, D. J.,… More

Marzook, N. B., Procter, D. J., Lynn, H., Yamamoto, Y., Horsington, J., Newsome, T. P. Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (83), e51151, doi:10.3791/51151 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter