Summary
Bu protokol soydaş GFP gazetecilere ve flow sitometri aracılığı GFP ifade uyarmak için atfs yeteneği ölçümü ile yapay transkripsiyon faktörleri (atfs) hızlı inşası için deneysel bir prosedür açıklanmaktadır.
Abstract
Sentetik biyoloji rasyonel tasarım ve istenen niceliksel özelliklere sahip sentetik devreleri kurmak, yanı sıra yerli kumanda devrelerinin yapısını sorgulamak için araçları sağlamayı amaçlamaktadır. Her iki durumda da, herhangi bir hedef dışı etkileri olan, hızlı bir şekilde ayarlanabilir ve gen ifadesini program yeteneği yararlı olabilir. Biz, insan östrojen reseptörü ve VP16 ligand bağlayıcı etki alanı, ardından bir URA3 kasetinin ACT1 promoter üst akışında içeren maya suşları inşa ettiler. URA3 varlığı karşısında bir DNA bağlama alanı ve seçilmesini ihtiva eden bir doğrusal bir PCR ürünü ile bu türünün dönüştürülmesi ile, bir kurucu olarak ifade yapay transkripsiyon faktörü (ATF) homolog rekombinasyon ile üretilebilir. Bu şekilde tasarlanmış atfs bu şekilde hedef dışı aktivasyonu ve yaygın olarak kullanılan Conditi ile bulunan fizyolojik olmayan büyüme koşulları hem de ortadan kaldırılması, indükleyici mevcudiyetinde benzersiz bir hedef geni aktive edebilironal gen ekspresyon sistemleri. Ilgi konusu bir doğal ya da yapay bir transkripsiyon faktörüne yanıt, özellikle GFP raportör plazmidin hızlı yapımı için basit bir yöntem de sağlanmaktadır.
Introduction
Maya genetik anahtarları geliştirilmesi akademik hem de endüstriyel araştırma büyük ilgi olduğunu. İdeal durumda, genetik anahtarları deneyi tarafından arzu sadece belirli bir gen (ya da gen kümesi) aktif hale getirmek için kullanılabilir. Alt sentetik bir promotörün yerleştirilen bir genin kodlayıcı sekansı, bir uyaran molekül olmadan ifade edilmez: inducer ilave edildikten sonra hızlı bir şekilde gen ifade edilmelidir. Sadece son zamanlarda bu tür bir anahtar indükleyici yokluğunda, soy bir silme fenotipi gösterir, ancak uyarıcının mevcudiyetinde ekspresyon bütün hücrelerde indüktör düzeyi ile orantılı olarak aktif maya içinde tasarlanmış olabilir gösterilmiştir 1,2. Tarihsel olarak, mayada koşullu ifade sistemleri MET, PHO ve GAL promoterler (aktiviteler metionin, fosfat dışı düzeyde duyarlı olan, ve de dahil olmak üzere besleyici duyarlı DNA dizileri, üzerine ağır yararlanmıştırgalaktoz, sırasıyla). Koşullu ifade elde edilebilir olsa da, önemli pleitropik etkilerin pahasına geliyor.
Örneğin, insan östrojen reseptörleri olarak hormon reseptörleri ökaryotlarda 3,4 etkili anahtarları olduğu kanıtlanmıştır. Hormonu yokluğunda, bir hormon reseptörüne bağlanmak için bir kaynaşık protein, Hsp90 şaperon kompleksi ile etkileşim sitoplazma içinde tecrit edilebilir. Uygun ligand bağlayıcı üzerine, alıcı bu Hsp90 şaperon kompleksten serbest kalmasına neden olur ve bir nükleer lokalizasyon sinyali açığa, yapısal bir değişiklik olur. Belirli bir hormon reseptörü içeren proteinin lokalizasyonu dinamikleri gözlemlemek için, Gal4dbd.ER.VP16 (GEV'in, Gal4p DNA bağlama alanı, insan östrojen reseptörünün ligand bağlanma alanı içeren sentetik bir transkripsiyon faktörü, bir C-terminal füzyon oluşturulan ve VP16) GFP 2. Nükleer lokalizasyon eklenmesinden sonra 8 dakika içinde gözlenmiştirhangi yabani tip maya tamamen etkisiz olan, indükleyici, beta-estradiol miktarda doyurarak. Bu zamana kadar, hücrelerin çoğunluğu (floresan in situ hibridizasyon yoluyla tahlil) GEV hedef genleri için açıkça görünür aktif transkripsiyon siteleri yanı sıra, tam olgun mRNA'ları 2,5 var. GEV hedef genler bu çekirdeğe transloke DNA bağlama ve transkripsiyonu aktif hale getirmek için <kimerik aktifleştirici için 2.5 dakika sürer gösteren, 2.5 dakika, 2,6 (mikrodizileri kullanılarak ölçülmüştür) olan sentezleme> 2-kat artmıştır.
Birkaç on-anahtarları diğer hiçbiri hızı elde ettik (Escherichia coli gelen klasik doksisiklin bazlı anahtarları 7,8 ve Arabidopsis thaliana'dan bir indigo tabanlı anahtar 9 da dahil olmak üzere), çeşitli küçük moleküller ya da uyuşturucu kullanan maya içinde uygulanmış olsa da, özgüllük, ya da hormon bazlı anahtarları tarafından sergilenen düzenleme gerginlik. Bu t kayda değer olduğunuhat hızlı anahtarlar kapalı da maya içinde geliştirilmiştir, ve tipik olarak sekans 2,10,11,12 hedefleyen bir proteaz veya ubikitin ligazı için bir gen füzyon çalışır. Hızlı bir hücreden bir hedef proteinin ayrılması için yeteneği elzem genlerin çalışma hem de 10 silindiğinde genetik baskı yatkındır genleri kolaylaştırır.
Bu protokol açıklanan yöntemler bina ve on-anahtarları mayada sentetik karakterize içindir. İlk olarak, hızlı bir şekilde ilgi konusu bir DNA bağlanma alanından oluşan genomik entegre füzyon proteinlerini oluşturmak için nasıl gösterir, ligand, insan östrojen reseptörü bağlama alanı, ve VP16 (DBD-en EV). Protokolde sonra, füzyon proteini bir ACT1 promotöründen eksprese edilir. Biz o ATF için bir soydaş muhabiri plazmid yaratmak ve akış sitometri kullanarak işlevselliğini sınamak için nasıl gösterir. Bu muhabir plazmidler yeni atfs (Şekil 1) ile kullanılan öngörülüyor rağmen, onlar be de bir yerli transkripsiyon aktivatörü için gazetecilere olarak kullanılır. Son olarak, 96 oyuklu plakalar içerisinde, hücre büyümesi üzerindeki ATF aktivasyon etkisini test etmek için ve uyarılabilir genomik alelleri mühendislik Ayrıntılar için verilmiştir.
Protocol
Şekil 2, protokol bölümleri 1-3 bir şemasını içerir.
1.. Atfs Yaratılış
- PCR ilgi konusu DNA bağlama alanını yükseltmek için primerler oluşturur. ACT1 promoter ve hormon reseptörüne homoloji (Şekiller 3 ve 4 'de tarif edildiği gibi) gerilme yMN15 içine doğru rekombinasyonu kolaylaştırmak için PCR ile ilave edilir.
- PCR, bir yüksek sadakat polimeraz kullanarak ilgi DBD yükseltmek.
- , Lityum asetat metodu kullanılarak 13 mayaya saflaştınlmış PCR ürünü> 1 ug dönüşümü.
- Mikrosantrifüjde 15 saniye boyunca en yüksek hızda dönüşüm, spin hücreleri aşağıdaki ve dönüşüm karışımı kaldırmak.
- YPD'de steril su ve plaka ~ 200 ul yeniden süspanse.
- Ertesi gün, YPD ikinci kopya plaka 5-FOA plakalar üzerine 13, (Cold Spring Harbor Maya Kılavuzunda tarif edildiği gibi 5-FOA plakaları yapılır).
- 2-4 d büyüme izinAYS, ve restreak en az 5-10 koloniler YPD'de üzerine. Dahil doğrulamak için Tablo 1 ve sırayla primerler kullanılarak bir koloni PCR gerçekleştirin.
2. ATF Plazmid Reporter Yaratılış
- (Literatürden gelmesi en muhtemel) ATF bağlama bölgesini belirler.
- (Gerekirse, ya Ultramers) Sipariş oligolardan gibi bağlayıcı bölgeyi istenen. Tablo 2'de gösterildiği gibi, Notl ve Xbal için doğru çıkıntılar ile üst ve alt iplikler olarak sipariş.
- Eşit molar konsantrasyonlarda (100 uM) için oligolar seyreltin.
- T4 polinükleotid kinaz ile bir PCR sonra tavlama işlemi kullanılarak fosforile. Reaksiyon koşulları Tablo 3'te bulunmaktadır.
- Digest 1-2 ~ 37 ° C (Tablo 4'te reaksiyon koşulları) 1 saat için HF-Notl ve Xbal ile pMN8 ug.
- Jel omurga bant arındırmak.
- 10 ng / ul saflaştırılmış omurga seyreltin.
- Çift sarmallı, fosforil seyreltinul başına omurgasının molar konsantrasyonunu 5x'e bağlanma yeri ated.
- T4 DNA ligazı kullanılarak, 30 dakika boyunca (Tablo 5), oda sıcaklığında sindirildi omurgasına bağlanma siteleri ligate.
- Transformasyon için, bir standart 50 ul, örneğin XL1-Blue ya da DH5-alfa, kimyasal olarak kompetan Escherichia coli için yarım ligasyon reaksiyonu ekleyin.
- Daha sonra, bir ısı şoku 42 ° C su banyosu içinde 45 saniye için hücre ve 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
- Dönüşüm reaksiyonuna SOC ortamı içinde 900 ul ekleyin.
- Bir silindir tambur üzerinde, 1 saat boyunca 37 ° C'de büyür.
- LB + amp (100 ug / ml) plaka başına 100-200 ul hücre yayıldı ve bir gece boyunca inkübe edilir.
- E. büyümek LB + amp içerisinde coli sıvı ve hasat plazmid DNA. Seri primeri 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 'kullanılarak ligasyon koloniler yeni raportör plazmid olun.
- ATF-içeren maya str yeni bir raportör plazmid Dönüşümülityum asetat dönüşümünü kullanarak Bölüm 1 ain.
3. GFP Reporter kullanarak Gen İfade ATF İndüksiyonunun etkisini ölçmek
Örneklerinin hazırlanması:
- 25 mM β-estradiol stok (β-estradiyol etanol + 0,0681 g 10 mi) olun. Buzdolabında tutun.
- ATF + 5ml SC-URA gecede gerginlik Reporter içeren büyütün.
- Elde dokuz 250 ml şişeler sallamak ve her 25 ml SC-URA ekleyin.
- 0 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM veya 10 uM β-estradiol ekleyin. Bu, en kolay şekilde, 25 mM β-estradiyol stoklar 10-kat seri dilüsyonları yaparak yapılır. 10 uM β-östradiolün bir son konsantrasyon için, SC-URA 25 ml için 25 mM β-estradiyol stoklar 10 ul ekle.
- Şişelere (1:200 seyreltme) ile gece boyunca kültürler 125 ul ekleyin.
- 2 kalan şişelere, bir konstitütif GFP üreten Strai ile inokülen ve GFP yoksun bir gerginlik. Bu akış sitometresi kalibre edilmesi için ihtiyaç vardır.
- 12-18 saat boyunca 30 ° C'de 200 rpm'de çalkalanır.
Not: Optimal inkübasyon süresi GFP indüksiyon artık değişiklik β-estradiyol ilave edildikten sonra zaman belirlenmesi ile belirlenir. - Her kültürün 500 ul alır ve ayrı 1.7 ml mikrosantrifüj tüpler aşağı spin.
- Aspire SC-URA.
- 1 ml PBS +% 0.1 Tween-20 ve aspirasyon kez yıkayın.
- PBS +% 0.1 Tween-20 ve tekrar süspansiyon 1 ml ilave edilir.
- Falcon tüplerine PBS +% 0.1 Tween-20 içinde 1 ml ilave edilir.
- 5 ml tüpler (son hacim = 2 mi) ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ekleyin (birkaç gün boyunca 4 ° C de muhafaza edilebilir).
- İsteğe bağlı: dağılmasından hafifçe sonicate hücreler, herhangi clumped hücreleri.
Akış sitometri analizi: Genel Bakış: 10.000-100.000 hücrelerinin floresan tipik haliyle numune başına analiz edilir. Veri FlowJo veya MATLAB özel komut dosyalarını kullanarak ya da işlenebilirR. GFP pozitif ve negatif kontrolleri kullanarak GFP kanalın voltajı kalibre emin olun. FCS içerik dışa sonra, bu fonksiyon fca_readfcs (birlikte Şekil 6'da tek bir komut http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader ) işlemek için kullanılabilir Veri. - Akım sitometri gerçekleştirin.
- Maya hücreleri tanımlamak için kullanın ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC).
- ~ 3,000 hücre / sn akış hızını ayarlayın.
- GFP (FITC kanal) ölçün.
- Veriler toplandığında, ihracat. FCS dosyaları
- MATLAB yükleyin.
- . FCS dosyaları fcs_readfcs.m, ve Şekil 6, aynı klasöre edilene benzer bir komut dosyası taşıyın.
- Veri ve komut dosyalarını içeren klasörü mevcut çalışma dizini değiştirin.
- (Not Şekil 6 komut dosyasını çalıştırın:efsane elle) Şekil 7'de görüldüğü neler üretmek için girildi.
4. Hücre Büyüme ATF İndüksiyonunun etkisini ölçmek
- Dondurulmuş stokları, hem dışarı çizgi (1) ayrı YPD plakalar üzerine bir ATF içeren suşu (örneğin yMN15 olarak) (2) bir ATF-eksik suşu.
- Büyüme 2 gün sonra, her bir suş ile YPD sıvı ihtiva eden ayrı bir 5 ml kültür tüpleri inoküle ve 30 ° C de bir gece boyunca büyümeye
- 10-kat% 100 etanol içinde 10.000 kat (0.025 uM β-estradiyol) bir 0.25 mM β-estradiyol stok çözelti seri seyreltmeleri yapın.
- YPD sıvı (1-250 seyreltme) 10 ml gece boyunca kültürler 40 ul ekle.
- Ve her bir suş için, 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına 18 seyreltilmiş 96 ul hücre ilave edin.
- Hücrelere β-estradiyol 4 ul ekleyin. Önemli bir nokta, her kuyu toplam etanol aynı miktarda emin olmaktır. (Alternatif olarak, mo β-estradiyol konsantre stok kullanılmış ve daha sonra noktasına seyreltilebilir yeniden büyümesi üzerindeki etkisi, etanol içinde) ölçülebilir değildir.
- Üç kez yapın. Her bir suş için kuyu üç etanol okunur kontrol olmalıdır.
- Gaz geçirgen bir zarın içinde 96 oyuklu plaka örtün.
- Plaka okuyucu büyüme (OD 600) izleyin.
- Gibi maksimum eğim bulgu olarak standart yöntemlerin herhangi biri kullanılarak büyüme oranlarını ölçmek.
Not: R programlama ortamında çalışır açık kaynak yazılım paketi grofit 14 ile iyi bir başarı elde ettik Bu söz değer olduğunu 96-plaka deneyleri hesaplanan büyüme oranları (25 ml kültür)-şişeleri sallamak göre ise. ille (nedeniyle fizyolojisi ve enstrümantasyon hem de farklılıklar), biz (bu her zaman böyle olmayabilir ama) göreceli büyüme oranları benzer olduğunu tespit ettik aynı.
- PMN10, (zıt oryantasyonda) KanMX kaynaşmış pMN8 arasındaki ATF-duyarlı promoteri ile bir noncentromeric plazmid elde edilir.
- Kısıtlama, Bölüm 2'deki gibi vektör omurgası ve jel özü sindirimi.
- Tavlama, fosforile ve Bölüm 2'de tarif edildiği gibi uygun bir bağlama siteleri içeren ligate oligolar.
- Dizisi doğrulayın. Bu durumda plazmit, uyarılabilir alel yaratmak için, bir DNA şablonu olarak hizmet edecektir.
- Ilgi konusu karşılık gelen ATF ifade eden maya suşu elde edilir.
- PCR Tablo 6 primerleri kullanılarak KanMX-Promoter kaseti (~ 2 kb) yükseltmek.
- , Lityum asetat metodu kullanılarak ATF-ifade suşu içine PCR ürünü dönüşümü.
- YPD'de + G418 ertesi gün üzerine YPD'de ve çoğaltma plaka üzerinde plaka.
- Inci ileri primeri (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') ve ters primer iç kullanılarak promotörün uygun ekleme teyitolan promoter gen e değiştirilmiştir. Ters primer genellikle ilk ATG 15 bp alt akışında 200-300 arasında olacak şekilde tasarlanmıştır. Nihai PCR ürünü, ~ 1.2 kb'dir.
Representative Results
Şekil 5, zaman içinde Z 3 EV, Z 4 EV ya GEV'in GFP endüklenmesini gösterir. Bağlayıcı alanlar nonyeast DNA içeren atfs tepki olarak GFP üretimindeki artışı not edin. Biz son zamanlarda bu maya genomu 1 tek-gen özelliğin sağlanması bu faktörlerden kaynaklanan iddia. Z 3 EV ve Z'nin 4 EV sadece alt uygun bağlama bölgesine (5'-GCGTGGGCG-3 've 5'-ihtiva eden sentetik bir promotörün yerleştirilmiş bir hedef genin ifadesini aktive ise tek başına GEV indüksiyonu, yüzlerce genin aktivasyonu / bastırılmasına yol açar GCGGCGGAGGAG-3 ', sırasıyla) 1. Şekil 7, sisteme (saptanabilir GFP hiçbir indükleyici results) ve tüm hücreler bir dizi boyunca GFP indükleme Z 3 EV becerisi indüktöre tepki olarak bağlı olsun sıkı bir düzenleme gösteriyor β-estradiol konsantrasyonları, Şekil 8 'de gösterilmiştir.
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 1,. Β-estradiyol ATF bağlandığı zaman yapay transkripsiyon faktörleri β-estradiyol. Yokluğunda Hsp90 ile etkileşim, Hsp90 ATF çekirdeğe girmek ve plazmid raportör ekspresyonu aktive etmek için izin ayrışmaktadır.
Şekil 2.. Yapay transkripsiyon faktörlerini ve bina / soydaş GFP gazetecilere test içeren mühendislik suşları için protokol şematik.
load/51153/51153fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg "/>
Şekil 3,. LEU2 lokusundaki suşu yMN15 in ACT1pr-URA3-EV dizisi.
Başarılı bir şekilde yMN15 dönüştürüldüğü zaman, yeni bir füzyon proteini oluşturmak için ek sekans homolojisi ile ilgi konusu bir DNA bağlanma alanı amplifiye etmek için PCR primerleri Şekil 4.. Tasarımı.
Şekil 5,. GFP indüksiyon 1 uM β-estradiyol tepki olarak üç farklı ATF-promoter çifti. '/ P>
Şekil 6.. Veri sitometri işlem akışı için bir MATLAB komut dosyası. Bu script uyarlanmıştır http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data .
0 μ M β-estradiol ve indüksiyon 18 saat sonra 1 uM β-estradiyol tepki olarak Z 3 EV GFP Şekil 7.. Indüksiyonu. Floresans ölçümleri de olduğuZ 3 EV sistemi sıkı bir düzenleme göstermek için GFP içermeyen hücrelerden ölçüldü. Bu şekil, Şekil 6'da kodu kullanılarak oluşturulmuştur.
Şekil 8,. Indükleyici konsantrasyonu ve sentezleme çıkışı arasındaki ilişki, 1 ve a Hill katsayısı ile değerlendirilir. (A) β-estradiyol konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, GFP ifade dağılımı. (B) (A) 'dan dağılımlarının ortalama floresan. Veriler D β-estradiyol dozdur = G dakika + (G-G max min) D n / (n + K D n), G ve G min maksimum minimum olan fonksiyonu G (D) için uygun olan ve maksimum GFP değerler, respectively, n Hill katsayısı ve K ½ (G maksimum + G dakika) elde edildi β-estradiyol dozdur.
| Oligonükleotid Dizi | Isim |
| 5'-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 ' | DBD İleri edin |
| 5'-tccagagac ttcagggtgct-3 ' | DBD Tersine |
Tablo 1. Östrojen reseptörünün ilgilendiren DBD'nin doğru füzyon doğrulanması için primerler. Ileri primer olarak homolog olan ACT1 promoter ve ters primer östrojen reseptörü ile homologdur. Tipik DBDleri (~ 300 bp) için PCR ürünü <1.5 kb'dir.
| Oligonükleotid Dizi | Isim |
| 5'-ggccgc ... DBD binging sitesi ... t-3 ' | En oligo |
| 5'-ctaga ... DNA bağlama sahası ters ... gc-3 ' | Alt oligo |
| 5'-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 ' | En oligo + 6x Zif268 Bağlayıcı Yer |
| 5'-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 ' | Taban oligo + 6x Zif268 Bağlayıcı Yer |
Ilgi çekici bağlama siteleri içeren dsDNA oluşturmak için primerler Tablo 2. S tructure. Z 3 EV-duyarlı promotör oluşturmak için, oligonükleotidler en oligo + 6x Zif268 Bağlama Alanı ve alt oligo + 6x Zif268 Cilt kullanılmıştır.Doğru DNA çıkıntıları oluşturmak için küçük harflerle diziler bulunmaktadır. Zif268 konsensüs bağlanma sitesi, GCGTGGGCG, üst oligo altı çizilir.
| Reaktif | Miktar |
| T4 polinükleotid Kinaz Tamponu | 5 ul |
| T4 polinükleotid kinaz (10.000 ünite / ml) | 1 ul |
| Top oligo (100 mikron) | 1.5 ul |
| Alt oligo (100 uM) | 1.5 ul |
| Su | 41 ul |
Tablo 3. Fosforile ve yukarıda tarif edilen reaksiyon 50 ul kullanılarak bir PCR primer tavlama. Iki PCR adım vardır. Adım 1: 37 ° C 30 dakika (fosforile) ve aşama 2: 95 ° C 30 saniye (Tavlama); 4 ° C kadar 1 ° C aşağı her 30 sn adım.
| Reaktif | Miktar |
| Xbal | 1 ul |
| NotI-HF | 1 ul |
| Plazmid DNA, | 5 ul (1-2 ug) |
| 10x Cut Akıllı Tampon | 5 ul |
| Su | 38 ul |
Tablo 4. Xbal ve Notl ile plazmid pMN8 Kısıtlama özet.
| Reaktif | Miktar |
| T4 ligaz Buffer | 2 ul |
| T4 ligaz | 0.2 ul |
| 10 ng / ul @ omurga | 1 ul |
| 5x molar konsantrasyon / ul @ bağlama sekanslar | 1 ul |
| Su | 15.8 ul |
Tablo 5. Plasmid DNA'ya bağlanma yerleri Arter.
| Astar boya | Tanım |
| ~ 40 bp üst baş arasında ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 ' | KanMX-Promoter yükseltilmesi için ileri primer |
| 5'-ters tamamlayıcı (ATG + ~ 37 bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 ' | PRI tersKanMX-Promoter yükseltmek için mer |
| 5'-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 ' | GCN4 organizatörü takas yapmak için ileri primer. |
| 5'-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 ' | GCN4 organizatörü takas yapmak için astar ters. |
Tablo 6. PCR titratible alel yapmak için KanMX-Promoter yükseltmek.
Discussion
Burada tarif edilen hormon bazlı anahtarları, in vivo olarak bir DNA sekansı hedef ilgi konusu bir DNA bağlama alanı yeteneğini test etmek için yerel hücre biyolojisi inceleyerek, sayısız uygulamalar vardır. Sistem indüserinin, hızlı aksiyon ve sıkı düzenlemeye kademeli bir yanıt dahil birçok arzu özelliklere sahiptir (yani. Ölçülebilir sızmaları, bkz. Şekil 7). Ancak, iyileştirme ve genişleme için oda hala var.
Sentetik biyolojinin son iş çoklayıcı sentetik sistemleri vurguladı ve iyi karakterize, programlanabilir DNA parçalarının 16 repertuarını genişletiyor. Ayrı hedef genlerin bağımsız olarak, birden çok koşullu ifade uyarıcıları ve üst üste spesifısitesi olmayan DNA bağlanma alanlarını gerektirir. Projelendirilmiş ve doğal olarak oluşan reseptörlerin durumu yeni yapay transkripsiyon faktörlerini geliştirmek için hangi parçaları geniş bir dizi sağlar. Genişleyenkarşılıklı ortogonal anahtarları repertuarı büyük ölçüde 17,18 yaklaşımlar yönlendirilmiş evrim tarafından yardım görmüştür. Bizim yapay transkripsiyon faktörlerinin ligand-bağlanma özgüllüğünü yeniden programlamak için gösterilen çabalar, gelecekte sunulacaktır.
Daha önce, gen silinmesi / aşırı ifadesinin fenotipik sonuçlarının Mayada 19,20 yaygın olarak incelenmiştir. Ancak, bu ekspresyon seviyeleri, bir dizi farklı fenotipe ifadesinin etkisini incelemek için kolay olmamıştır. Bu buluşta sunulan sistemin bir birinci özelliği, kademeli doğası (Şekil 8) 'dir. Genellikle kabul ederken, gen ifadesi ve ilgi fenotipler arasındaki ilişki mutlaka monotonik olmayabilir. Böyle Z 3 EV ve Z 4 EV gibi yapay transkripsiyon faktörleri basit gen ifadesinde değişikliklere fenotipik yanıtları tahlil etme görevi yapacaktır.
Son olarak, protokolleri tartışmakbu yazının ed mühendislik ve-estraidol β yanıt yapay transkripsiyon faktörlerini tanımlamak için olmakla birlikte, önemli bir alternatif kimyasal duyarlı alanları (örneğin PhyB/Pif3, lov ve BLUF gibi) ışık duyarlı alanların kullanımı, Kendilerinin faaliyetleri kültür büyüme ortamı 21-23 perturb kalmadan geri dönüşümlüdür. Işık bazlı sistemler uzaysal gen ekspresyonunun kontrolü, protein-protein etkileşimleri, iyon taşıma, ve daha önce 21-26 güçlü olduğu kanıtlanmıştır enzimatik aktivite, kolaylaştırır.
Sonuç olarak, maya, indüklenebilir, yapay transkripsiyon faktörlerinin hızlı yapımı için yöntemler sunulmuştur. Bu protokol, aynı kökten gelen GFP muhabir yapı ile birlikte, hem de akış sitometrisi kullanılarak, raportör verilerin analiz edilmesi ve büyüme ATF aktivasyon etkisini test etmek için yöntemler için bir model sunmaktadır.
Disclosures
McIsaac, Noyes ve Botstein (diğerleri ile) bir patent Açıklanmasına olarak bu sistemin bir parçası gönderdiniz.
Acknowledgments
RSM NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu fon kabul eder. MBG bir Lewis-Sigler Kardeşliği fon ve Peter Lewis donatılmış hediye kabul eder. DB NIH (GM046406) Sayısal Biyoloji (GM071508) Genel Tıp Bilimleri Merkezi Ulusal Enstitüsü fon kabul eder. Biz akım sitometri deneyler ile yardım için Christina DeCoste kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
| Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
| XbaI | NEB | R0145S | |
| NotI-HF | NEB | R3189S | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
| Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
| Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
| Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
| Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
| EQUIPMENT: | |||
| LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
| MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
| R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
| Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| 1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
| 250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
| 96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
| Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
| Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
| Thermocycler | various companies | Various models | |
| SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
| 5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |
References
- McIsaac, R. S., et al. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic acids res. 41, e57 (2013).
- McIsaac, R. S., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).
- Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131, 129-134 (1993).
- Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).
- McIsaac, R. S., et al. Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (76), e50382 (2013).
- McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).
- Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).
- Hickman, M. J., et al. Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast. Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).
- Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron. Mol. Syst. Biol. 5, 267 (2009).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat. methods. 6, 917-922 (2009).
- Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. grofit: Fitting Biological Growth Curves with R. J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).
- Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150, 647-658 (2012).
- Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).
- McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold. Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).
- Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast. Science. 297, 395-400 (2002).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol. cell. 21, 319-330 (2006).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).
- Losi, A., Gartner, W. Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors. Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).
