Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ECM Protein Nanofibers og nanostrukturer Engineered Brug Surface-initierede Assembly

Published: April 17, 2014 doi: 10.3791/51176
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Materials Science and Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

En metode til at opnå nanofibre og komplekse nanostrukturer fra en enkelt eller flere ekstracellulære matrixproteiner er beskrevet. Denne fremgangsmåde anvender protein-overflade vekselvirkninger at skabe fritstående protein-baserede materialer med afstemmelige sammensætning og arkitektur til brug i en række af væv ingeniør-og bioteknologiske anvendelser.

Abstract

Den ekstracellulære matrix (ECM) i væv syntetiseres og samles af celler til dannelse af et 3D-fibrillært protein netværk med stramt reguleret fiberdiameter, sammensætning og organisation. Ud over at yde strukturel støtte, de fysiske og kemiske egenskaber af ECM spiller en vigtig rolle i flere cellulære processer, herunder friktion, differentiering og apoptose. In vivo er ECM samles ved at udsætte kryptiske selvsamling (fibrillogenese) steder indenfor proteiner . Denne proces varierer for forskellige proteiner, men fibronectin (FN)-fibrillogenese er godt karakteriseret og tjener som model for cellemedieret ECM forsamling. Konkret celler bruger integrinreceptorer på cellemembranen til at binde FN dimerer og actomyosin-genereret kontraktile kræfter til at udfolde sig, og eksponere bindingssteder for montage i uopløselige fibre. Denne receptor-medieret proces gør det muligt for cellerne at samle og organisere ECM fra det cellulære til væv SCAles. Her præsenterer vi en metode kaldet overflade-initierede samling (SIA), der sammenfatter cellemedieret matrixopbygning anvendelse af protein-overflade vekselvirkninger at udfolde ECM-proteiner og samle dem til uopløselige fibre. Først ECM-proteiner adsorberet på en hydrofob polydimethylsiloxan (PDMS) overfladen, hvor de delvis denaturering (unfold) og udsætte kryptiske bindende domæner. Udfoldet proteiner overføres derefter i veldefinerede mikro-og nanopatterns gennem microcontact udskrivning på en termisk reagerende poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) overflade. Termisk-udløst opløsning af PIPAAm fører til den endelige samling og frigivelse af uopløselige ECM protein nanofibre og nanostrukturer med veldefinerede geometrier. Komplekse arkitekturer er muligt ved ingeniør definerede mønstre på PDMS stempler til microcontact udskrivning. Ud over FN kan SIA-processen anvendes med laminin, fibrinogen og collagener type I og IV til at skabe flere komponenter ECM nanostructurer. Således kan SIA anvendes til at konstruere ECM protein-baserede materialer med præcis kontrol over proteinsammensætningen fiber geometri og stillads arkitektur med henblik på at rekapitulere strukturen og sammensætningen af ECM in vivo.

Introduction

Den ekstracellulære matrix (ECM) i væv består af multifunktionelle proteiner involveret i fysisk og kemisk regulering af flere celleprocesser, herunder adhæsion, proliferation, differentiering og apoptose 1-3. ECM er syntetiseret, samlet, og tilrettelagt af celler, og de indgående protein fibriller har unikke kompositioner, fiber størrelse, geometrier og indbyrdes forbundne arkitekturer, der varierer med vævstypen og udviklingsstadiet. Nyligt arbejde har vist, at ECM kan give instruktive stikord til at guide cellerne danner manipuleret væv 4, hvilket tyder på, at den gentog ECM i form af sammensætning og struktur kan muliggøre udviklingen af biomimetiske materialer til tissue engineering og bioteknologiske anvendelser.

En række fremstillingsmetoder er blevet udviklet til at konstruere polymere stillads, der kan efterligne aspekter af ECM i væv. For eksempel electrospinning og fase separtion har begge demonstreret evne til at danne porøse matricer af fibre med diametre fra snesevis af mikrometer ned til et tocifret antal nanometer 5-7. Begge teknikker har også vist, at meget porøse matrixer af nanofibers kan støtte celleadhæsion og infiltration i stilladset 8. Men disse tiltag er begrænset i de mulige fiber geometrier, retningslinjer og 3D-arkitekturer, der kan oprettes. Electrospinning producerer typisk stilladser med enten tilfældigt orienterede eller meget aligned fibre henviser faseseparation producerer stilladser med tilfældigt orienterede fibre. Der er også begrænsninger på materialer, med forskere typisk under anvendelse af syntetiske polymerer, såsom poly (ε-caprolacton) 8 og poly (mælke-co-glycolsyre) 9, som efterfølgende overtrukket med ECM-proteiner for at fremme celleadhæsion. Naturlige biopolymerer også anvendes, herunder kollagen type I 10, gelatine 11, fibrinogen 12chitosan 13 og silke 14, men udgør kun en lille delmængde af de proteiner, der findes i native væv. De fleste væv indeholder et større miljø af ECM-proteiner og polysaccharider herunder fibronectin (FN), laminin (LN), collagen type IV og hyaluronsyre, der er vanskelige eller umulige at fremstille nanofibers anvendelse af eksisterende fremgangsmåder.

For at løse denne udfordring, har vi fokuseret vores forskningsindsats på at efterligne den måde celler syntetisere, samle og organisere ECM protein fibriller i deres omgivelser. Mens den specifikke fibrillogenese proces varierer for forskellige ECM-proteiner, typisk en konformationsændring i ECM protein molekyle er udløst af en enzymatisk eller receptor-medieret interaktion, som udsætter kryptiske selvsamlingsproceser sites. Her bruger vi FN som et modelsystem for bedre at forstå fibrillogenese processen. Kort fortalt FN homodimerer binder til integrin-receptorer på celleoverfladen via RGD aminosyre sekvensen i den 10. type IIJeg gentager enhed. Når bundet, integrinerne flytte fra hinanden via actomyosin sammentrækning og udfolde Fn dimerer at eksponere kryptiske selvsamlingsproceser sites. Eksponeringen af disse FN-FN bindingssteder giver Fn dimerer at samle ind i en uopløselig fibril højre på celleoverfladen 15. Arbejde i celle-fri systemer har vist, at kryptiske FN-FN bindingssteder kan afsløres gennem udfoldelsen hjælp denatureringsmidler 16 eller overfladespænding på en luft-væske-faststof grænseflade 17-19. Men Fn fibre skabt af disse teknikker er begrænset til specifikke fiber størrelser og geometrier og er typisk bundet til en overflade.

Her beskriver vi en tilgang betegnes overflade-initierede samling (SIA) 20, der overvinder disse begrænsninger ved at bruge protein-overflade vekselvirkninger til at oprette fritstående uopløselige nanofibre, nanofabrics (2D ark) og andre nanostrukturer, der består af en enkelt eller flere ECM-proteiner (figur 1 ). I denne pprocesmodeller, er ECM-proteiner adsorberes fra en kompakt, kugleformet kropsbygning i opløsning og delvist denatureret (udfoldet) på en mønstret, hydrofob polydimethylsiloxan (PDMS) stempel. ECM-proteiner overføres derefter i denne tilstand på et termisk reagerende poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) overfladen gennem microcontact udskrivning 22. Når hydreret med 40 ° C vand PIPAAm er et fast stof, men når den afkøles til 32 ° C, passerer gennem en nedre kritiske opløsningstemperatur (LCST), hvor det bliver hydrofile, kvælder med vand og derefter opløses, frigiver de samlede ECM nanostrukturer off overfladen. SIA metode giver kontrol over de dimensioner med nanometer-skala præcision. Ved at kontrollere vigtige parametre, såsom sammensætning, fiber geometri og arkitektur, er det muligt at rekapitulere mange egenskaber af ECM fundet in vivo, og udvikle avancerede stativer til vævs-engineering og bioteknologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Fabrikation af Master Mold Brug Fotolitografi

  1. ECM protein nanofibre, nanofabrics og nanostrukturer, der skal fremstilles, er først konstrueret ved hjælp af Computer Aided Design (CAD) software. Dette CAD-filen overføres derefter til en fotomaske. Den type photomask vil afhænge af løsningen af ​​de funktioner; med en gennemsigtighed baseret fotomasken passende for funktionen størrelser ned til ~ 10 um. Mindre funktioner <10 um vil kræve en krom på glas fotomasken. Alle de nanofibers og nanostrukturer præsenteres her blev fremstillet ved hjælp af en gennemsigtighed baseret fotomasken, og således var nanometer-skala i tykkelse, men ikke laterale dimensioner.
    Bemærk: Det er vigtigt at skelne, hvilke områder af fotomasken vil blive mørkt (forhindre UV-lys til at passere igennem), og som vil være gennemsigtig (tillade UV-lys til at passere gennem), da dette sammen med den type af fotoresist (positiv eller negativ) vil diktere den endelige topografi master mug.
  2. Til at begynde fremstillingen af ​​mastermodel, dehydrere en 4 "siliciumskive ved at placere den på en varmeplade indstillet til 150 ° C i 15 min.
  3. Centrer wafer på vakuum aksel med en spin-coater. Hæld SU8 2015 negativ fotoresist på midten af ​​skiven og fortsætte hælde i koncentriske cirkler, indtil omkring to tredjedele af skiven er dækket.
    Bemærk: Hold flaske SU8 tæt på wafer når hælde at minimere dannelsen af ​​bobler.
  4. Programmér spincoater som følger:
    • Spread cyklus: 500 rpm med en acceleration på 100 rpm / sek 10 sek.
    • Spin cyklus: 4.000 rpm med en acceleration på 100 rpm / sek 30 sek.
    Bemærk: Denne Spincoating opskrift vil danne et fotoresistlag der er ~ 10 um i tykkelse. Ved at ændre spindehastigheden eller SU8 formulering kan tykkelsen justeres.
  5. Soft bage wafer ved at placere den på en varmeplade indstillet til 95 ° C i 3 minutter.
  6. Bring wafer med UV-lys gennemfotomaske til en samlet dosis på 140 mJ / cm 2.
    Bemærk: SU8 er en negativ fotodækmiddel derfor regioner, hvor UV-lys er i stand til at passere gennem fotomasken vil være tilbage efter at udvikle og blive rejst funktioner på master mug.
  7. Efter eksponering bage wafer ved at placere den på en varmeplade, indstillet til 95 ° C i 4 min.
  8. Udvikle wafer ved at placere det i SU8 udvikler for 3 min. Efter 3 min, skylles wafer med isopropylalkohol. Hvis en hvid film fremstilles under skylning, er skiven ikke er fuldt udviklet, og det skal placeres tilbage i udvikler i yderligere 30 sek. Skyl igen med isopropylalkohol. Gentag denne proces, indtil en hvid film ikke dannes i isopropylalkohol skylning.
  9. Tør wafer i en strøm af nitrogen og sted i en 150 mm petriskål til at beskytte mod støv.

2.. Gøre PDMS Frimærker

  1. Forbered PDMS præpolymeren ved at kombinere elastomer base og hærder i en10:01 vægt / vægt-forhold. Typisk 80 g base og 8 g hærder bruges til at sikre at der er tilstrækkelige PDMS at dække master mug i et 1 cm tykt lag.
  2. Mix og afgasses PDMS ved hjælp af en centripetal mixer sat til følgende:
    • Mix: 2.000 rpm i 2 min
    • Afgasse: 2.000 rpm i 2 min.
  3. Hvis en mixer er tilgængelig blande PDMS med hånden i 10 min ved anvendelse af en 10 ml serologisk pipette. Afgasses blandingen ved at anbringe den i vakuum i 30 min for at fjerne bobler.
  4. Hæld nok PDMS-præpolymer over mastermodel (mønstrede silicium wafer) til dannelse af et 1 cm tykt lag. Cure PDMS ved bagning ved 65 ° C i 4 timer eller ved stuetemperatur i 48 timer.
  5. Hærdet kan regioner med mønstrene skæres ud til at danne de PDMS frimærker. For at skelne funktionen side fra bagsiden af ​​PDMS stempel, skære et hak ud af et af hjørnerne på bagsiden af ​​stemplet.

3.. Microcontact Printing af ECM Patterns

  1. Rene 25 mm diameter dækglas ved lydbehandling i 95% ethanol i 1 time og derefter tørre i en 65 ° C varm ovn.
  2. Forbered PIPAAm opløsning ved at opløse PIPAAm i 1-butanol ved en koncentration på 10% (vægt / vol, typisk 1 g i 10 ml).
  3. Centrere et dækglas på vakuum borepatron af spincoater og pipetten 200 ul af PIPAAm løsning, så at hele glasoverflade er dækket.
  4. Spincoat dækglasset ved 6.000 rpm i 1 min.
  5. Rengør PDMS stempler ved sonikering i 50% ethanol i 30 minutter og derefter tørre under en strøm af nitrogen.
    Bemærk: Tørring og efterfølgende trin skal udføres i et bio-skab til at opretholde sterilitet til applikationer, hvor ECM nanostrukturer vil blive brugt med celler.
  6. Coat mønstret overflade af hver PDMS stempel med 200 pi af proteinopløsningen, typisk 50 ug / ml i sterilt destilleret vand til FN. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
    Bemærk: Ther belægning volumen til en 1,5 cm 2 PDMS stempel og skal justeres afhængigt af størrelsen af PDMS stempel, ECM-protein, og koncentrationen af ECM protein i opløsning.
  7. Vask PDMS stempler i destilleret vand for at fjerne overskydende protein og tør grundigt under en strøm af nitrogen.
    Bemærk: Enhver vand tilbage på frimærket vil udløse for tidlig opløsning af PIPAAm belægningen på dækglasset og forhindre korrekt protein overførsel.
  8. Til steril fabrikation, placere PIPAAm-coatede dækglas i en lukket petriskål og steriliseres ved hjælp af UV-eksponering, 45 minutter under UV-lys i et bio-kabinet er tilstrækkelig. Hvis sterilitet ikke er nødvendigt dette trin kan udelades.
  9. Udfør microcontact trykning ved at anbringe funktionen side af PDMS stempel i kontakt med PIPAAm-overtrukne dækglas. Hvis det er nødvendigt, bruge pincet til at trykke let på bagsiden af ​​frimærker for at fjerne eventuelle luftbobler og sikre en ensartet kontakt.
  10. Efter 5 kmn, skrælle PDMS stempel fra dækglasset.
  11. På dette stadium, kan yderligere ECM-proteiner være mønstret for at skabe mere komplekse og flerkomponent strukturer. Op til 3 oplag er blevet verificeret til at arbejde med denne proces, og flere kan være mulig.

4.. Frigivelse af ECM Nanofibers og nanostrukturer

  1. Placer mønstrede PIPAAm belagt dækglas i en 35 mm petriskål og inspicere mønster troskab hjælp fasekontrast mikroskopi. Afhængig af mønsteret kan et CCD-kamera være nødvendigt at løse elementer i mønsteret. Fluorescensmikroskopi kan også anvendes til at inspicere det mønster billede ECM proteinerne er fluorescensmærket.
  2. Tilsæt 3 ml 40 ° C destilleret vand til petriskålen, og lade vandet gradvist afkøles.
  3. Kan overvåges Opløsningen af ​​PIPAAm lag og frigivelse af ECM protein mønstre med fasekontrast mikroskopi. Hvis ansøgningen ikke tillader anvendelse af optisk techniques kan frigivelsen overvåges ved at måle opløsningens temperatur. Typisk er vand afkøles til stuetemperatur, og under LCST af PIPAAm (32 ° C), for at sikre ECM protein nanostrukturer er blevet frigivet.
  4. Efter frigivelsen nanofibers, nanofabrics og andre nanostrukturer flyder i vand. For at bruge dem til yderligere applikationer, de har brug for at blive manipuleret. Den nøjagtige fremgangsmåde vil afhænge af eksperimentelle formål og kan omfatte trin, såsom immobilisering på en anden overflade, der bevæger sig med en mikromanipulator system eller indlejring i en hydrogel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SIA er i stand til ingeniør ECM protein nanofibre med præcis kontrol over fiber dimensioner. For at demonstrere dette, blev arrays af FN nanofibre med plane dimensioner 50 x 20 um mønstrede på en PIPAAm coated dækglas (figur 2A). Efter sin løsladelse, fibrene kontrakt, fordi de var under en iboende pre-stress, når mønstret på PIPAAm overflade (figur 2B). Analyse af FN nanofibre afslørede at de var monodisperse pre-release med en gennemsnitlig længde på 50,19 ± 0,49 m og bredde på 19,98 ± 0,17 um (figur 2C). Trods ordregivende mærkbart, FN fibre efter udsætningen var stadig monodisperse med en gennemsnitlig længde på 14,15 ± 0,92 m og bredde på 2,65 ± 0,32 m (figur 2D). Atomic force mikroskopi forudsat en højere opløsning perspektiv for fiber dimensionelle ændringer i forbindelse med SIA release processen. Især fibre pre-release havdeen ensartet tykkelse på ~ 5 nm (figur 2E), mens fibre efter udsætningen havde en heterogen tykkelse på rækkefølgen af flere hundrede nanometer (figur 2F).

Brug SIA-processen er det muligt at konstruere en række ECM protein nanostrukturer med afstemmelig størrelse, form og sammensætning (figur 3). For eksempel FN nanofibers første 20 um i bredden og 1 cm i længden blev mønstret på en PIPAAm-belagt dækglas. Efter afkøling og PIPAAm opløsning nanofibers blev løsladt danner lange tråde (figur 3A). Da endvidere det mønster er defineret af overfladen topografi PDMS stempel, der benyttes til microcontact trykning, er det muligt at konstruere komplekse ECM protein nanostrukturer. Som proof-of-concept, vi skabt flere bevæbnede FN stjerner der bevaret deres generelle form efter frigivelse (figur 3B). Interessant, armene på FN stjerne kontrakt ligesom nanofibers menkroppen af ​​stjernen fastholdt sin størrelse. Mens FN er vigtigt, at vi også ønsket at vise, at SIA virker med andre ECM-proteiner såsom LN, og at flere ECM-proteiner kan indarbejdes i den samme struktur. For eksempel har vi udviklet en 2-D nanofabric består af retvinklede og indbyrdes forbundne nanofibre af FN og LN i et firkantet gitter array (figur 3C). Pre-release Fn nanofibers var 20 um bred og LN nanofibers var 50 um brede. Efter frigivelse begge typer af nanofibre kontrakt, men den overordnede sammenkobling og firkantede gitter struktur blev opretholdt. Disse resultater viser, SIA kan anvendes til at konstruere ECM materialer med forskellige sammensætninger og strukturer.

Tilfælde af mislykkedes SIA ECM nanofibre er vist i fig. 4. En årsag er forkert frigivelse af et ufuldstændigt mønster på grund af dårlig overførsel af ECM proteinet til PIPAAm overfladen under microcontact trykning (figur 4A). Tilstedeværelsen af ​​huller, uregelmæssige kanter, og andre defekter vil skabe nanofibre og nanostrukturer, der er ufuldstændige og udsat for brud og fragmentering ved frigivelse. Hurtig opløsning af PIPAAm kan også forårsage dårlig mønster troskab efter afgivelse (figur 4B). For eksempel ved hjælp rumtemperatur på 20 ° C deioniseret vand allerede under LCST af PIPAAm i stedet for 40 ° C varmt vand vil medføre PIPAAm til hurtigt at svulme op og opløses. Dette kan medføre to problemer; (I) den hurtige ekspansion kan sønderflænge nogle ECM nanofibre og (ii) hurtig ekspansion kan forårsage forstyrrelser af mønstret arrangement efter udgivelsen.

Figur 1
Fig. 1. Skematisk af SIA-processen. (A) en silicium wafer er spundet med SU8 negativ fotoresist og udsættes for UV-lys gennem en fotomaske. Ikke-eksponerede områder udvikles væk forlader et topografisk mønstrede m aster mug. (B) PDMS præpolymer hældes over master mug og hærdet i 4 timer ved 65 ° C. (C) Efter hærdning er en PDMS stempel skæres ud. (D) Stemplet inkuberes derefter med en ECM protein løsning hvor proteinerne adsorberes til stemplet i en delvist udfoldet kropsbygning. (E) Stemplet skylles for at fjerne overskydende protein, tørret og placeret i konform kontakt med en PIPAAm-belagt dækglas. (F) Stemplet fjernes derefter efterlader mønstret ECM proteinet på PIPAAm belagt dækglas er mønstret dikteret af topografi stempel. (G) Dækglasset placeres derefter i en petriskål og dækkes med 40 ° C vand og derefter afkølet til under LCST af PIPAAm (~ 32 ° C), hvilket udløser opløsningen af ​​PIPAAm og frigivelsen af ​​samlede ECM protein nanofibre og / eller nanostrukturer fra overfladen.

tp_upload/51176/51176fig2.jpg "/>
Figur 2. Brug SIA til ingeniør populationer af monodisperse nanofibre. (A) En vifte af FN rektangler 50 um i længden og 20 um i bredden blev mønstret på PIPAAm overfladen. (B) Tilsætning af 40 ° C deioniseret vand og efterfølgende afkøling under LCST af PIPAAm udløste opløsningen af ​​PIPAAm og frigivelsen af ​​fn nanofibre. Efter sin løsladelse, fibrene indgået, da de er under en pre-stress, når mønstret på PIPAAm overfladen. (C) Analyse af nanofiber dimensioner pre-release afslører fibrene er monodisperse med en længde og bredde på 50,19 ± 0,49 m og 19,98 ± 0,17 um, hhv. (D) Efter frigivelse nanofibers kontraheret men forblev monodisperse med post-release længde og bredde af 14,15 ± 0,92 m og 2,65 ± 0,32 mM, hhv. (E) AFM viste, at de pre-release nanofibersvar ~ 5 nm tyk. (F) AFM af post-release nanofibers viste, at tykkelsen var steget til flere hundrede nanometer, mens længden og bredden faldet. -Scale Barer er (A) 50 m og (B) 10 um.

Figur 3
Figur 3.. Brug SIA til ingeniør ECM protein nanofibre og nanostrukturer med tunable størrelse, form og komposition. (A) FN nanofibre blev mønstrede på en PIPAAm-belagt dækglas som 1 cm i længden og 20 um i bredden. Termisk udgivelse resulterede i SIA af lange, intakte FN nanofibre med en reduceret bredde på ~ 3 um. (B) Et eksempel på en mere kompliceret multi-armet FN stjerne, repræsentant for de forskellige nanostrukturer, som kan oprettes ved hjælp af SID. Termisk udløsning resulterede i sammentrækning af armene, men ikke den centrale del af stjernen, hvor armene sammen. (C) Det er ogsåmuligt at integrere flere ECM-proteiner i den samme struktur. For eksempel blev retvinklede, indbyrdes forbundne 20 um brede linjer i FN (rød) og 50 um brede linjer af LN (grøn) linjer integreret i en 2D nanofabric mønstret og derefter løsladt. Selv efter løsladelse, mønsteret bevaret sin oprindelige geometri og sammenkobling. Skalapanelerne er 50 um.

Figur 4
Figur 4.. Eksempler på problemer, der kan forhindre en ordentlig SIA og protein frigivelse fra PIPAAm overfladen. (A) Utilfreds microcontact trykning af ECM-proteiner onto PIPAAm resulterer i opsplitning og andre fejl af en 20 um bred FN linje forhindrer SIA af en kontinuerlig FN nanofiber og i stedet resulterer i dannelsen mange mindre FN-fragmenter. (B) Hurtigt frigiver Fn nanofibre fra PIPAAm substrat kan også påvirke den endelige fiber arrangement. I dette tilfælde vand ent 20 ° C, allerede under LCST af PIPAAm blev tilsat og udløste hurtig opløsning forårsager nanofibers springer tilbage, pause (30 sek) og danner tilfældige uorganiserede konfigurationer (52 sek.) Skalapanelerne er 50 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SID-metoden præsenteres her efterligner cellemedieret matrixopbygning og muliggør konstruktionen af ​​ECM protein nanofibre og nanostrukturer med tunable størrelse, organisation og sammensætning. Selvom det ikke er identisk med celle-genereret ECM, SIA skaber ECM består af nanoskala protein fibriller 20, som undergår reversible folde / udfolde under mekanisk belastning 21 og kan binde celler 20. Dette giver en unik mulighed for at opbygge ECM protein materialer, rekapitulere mange egenskaber af ECM fundet in vivo. For eksempel kan ECM nanofibre fremstilles i bestemte længder og med et niveau af kontrol umuligt med andre teknikker. Vi demonstrerer evnen til at skabe arrays af monodisperse nanofibers (figur 2) med præcis styring af længden og bredden pre-release (Figur 2C) og post-frigivelse (Figur 2D). Disse ECM nanofibers kan være enhver længde, som påvist ved opdigte FN nanofibre i ~ 1 cm længder (figur 3A). I modsætning hertil kan andre fremstillingsteknikker såsom electrospinning og faseseparation skabe nanofibers, men ikke med præcis styring af længden, der producerer hovedsageligt kontinuerlige fibre. Disse teknikker er også begrænset i fiber geometrier og organisation i et stillads. SIA kan bruges til at opbygge ECM nanostrukturer med vilkårlige plane geometri, såsom en stjerne (figur 3B), og 2-D-plader med vilkårlige kontrol fiber organisation, såsom en nanofabric (figur 3C). Yderligere andre fremstillingsmetoder typisk syntetiske materialer eller kun et begrænset antal fysiske dem, såsom chitosan og fibrin. I sammenligning SIA muliggør samling af nanofibre og nanostrukturer sammensat fuldstændigt af ECM-proteiner, såsom FN og LN, som ikke kan fremstilles med disse andre metoder.

Det afgørende skridt i SIA-processen er den termisk-udløst frigivelse fra the PIPAAm overflade. For at sikre korrekt udgivelse, er der et par vigtige skridt, der bør overvejes. Først efter microcontact udskrivning trin, troskab af den overførte ECM mønster bør inspiceres enten via fasekontrast mikroskopi eller fluorescens mikroskopi (hvis ECM-proteiner fluorescens er kodet). Hvis der er nogen fejl i det protein mønster på PIPAAm overflade, så den efterfølgende frigivelse vil producere nanostrukturer, der indeholder disse mangler (som observeret i figur 4A). Hvis en PDMS stempel gentagne gange producerer protein mønstre med defekter, er det sandsynligt, at den micropatterned side af PDMS stempel er blevet ridset eller indeholder fejl og en ny frimærke og potentielt en ny mester skimmel bør gøres. Desuden bør der udvises forsigtighed, når fugtgivende proteinet mønstrede, PIPAAm-belagt dækglas. Vandet skal være på eller i nærheden af ​​40 ° C og skal have lov til at afkøle langsomt. Hvis vandet ikke er varmt nok eller køler for hurtigt, vil PIPAAm svulmend opløses for hurtigt forårsager ECM protein nanofibre og nanostrukturer skal potentielt sønderrevet fra de kræfter og på bedste beskub udgivet sådan, at enhver strukturel organisation ligner den tørre, præ-frigivet stat vil blive tabt (figur 4B).

ECM protein nanofibers, nanostrukturer og nanofabrics samling med SIA har mange anvendelser i biomekanik, tissue engineering, og bioteknologi. For eksempel for nylig tyder på, at de mekaniske egenskaber af ECM protein fibriller regulerer deres biologiske funktionalitet 23. SIA er velegnet til at skabe ECM protein nanofibre i renset form, til mekanisk analyse. For at udføre disse eksperimenter, kan frigives ECM protein nanofibre manipuleres ved hjælp af præcision micropositioners og derefter strakt. Deravi m.fl. for nylig har brugt denne metode til at vise, at FN nanofibers kan tåle op til 8-fold udvidelser, og at de undergår elastisk, plastisk og stregn-afstivende regimer med stigende belastning 21. I vævsmanipulering ECM proteinbaserede stilladser i form af geler (f.eks collagen type I og fibrin) eller decellulariserede væv 4 er meget udbredt. I forhold til disse teknikker, den fordel, SIA er evnen til at konstruere stilladser med en veldefineret arkitektur i 1-D fibre og 2-D ark (figur 3C). For eksempel har vi tidligere vist, at cardiomyocytter kan podes på FN nanofibers til dannelse af funktionelle dele af hjertemusklen 20. Dette viser, at FN nanofibre er celle bindende, og at de kan dirigere anisotrope samling af celler ind tilpasset vævsstrukturer. 2-D nanofabrics kan efterligne sammensætning og laminar struktur af basalmembran til anvendelse i konstruktionen af ​​epitel og endotel væv. Desuden er vi ved at udvikle nye måder at implementere disse ECM nanofibre og nanofabrics i 3-D ved at indlejre dem i hydrogelmatricer.Fra processen beskrevet i denne artikel, er det muligt at anvende SIA til ingeniør ECM protein-baserede, nanostrukturerede materialer til en lang række applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Blev ydet økonomisk støtte til JMS fra NIH Biomekanik i regenerativ medicin T32 Training Program (2T32EB003392), til QJ fra Dowd-ICES Fellowship og AWF fra NIH direktørens New Innovator Award (1DP2HL117750).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm Polysciences 21458-10 40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) Dow Corning Mix 10 parts base with 1 part curing agent. 
Butanol
Fibronectin BD biosciences 354008 Human, 1mg
Laminin BD biosciences 354239 Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist Microchem SU8-2015
SU8 Developer Microchem
Sonicator Branson M3510 Branson Ultrasonic Corporation CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer Thinky Corporation
Spincoater Specialty Coating Systems G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5 Fisher Scientific 12-545-86

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
  2. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  3. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  5. Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
  6. Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
  7. Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
  8. Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
  9. Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
  10. Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
  11. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
  12. Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
  13. Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
  14. Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
  15. Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
  16. Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
  17. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
  18. Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
  19. Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
  20. Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
  21. Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
  22. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
  23. Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).

Tags

Bioteknik Nanofibers Nanofabrics ekstracellulære matrixproteiner Microcontact Printing Fibronektin Laminin Tissue Engineering poly (N-isopropylacrylamid) Overflade-Initierede Assembly
ECM Protein Nanofibers og nanostrukturer Engineered Brug Surface-initierede Assembly
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szymanski, J. M., Jallerat, Q.,… More

Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly. J. Vis. Exp. (86), e51176, doi:10.3791/51176 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter