Summary
Bakterier kan ophobes enten skadelige eller gavnlige mutationer i løbet af deres levetid. I en population af celler personer, der har akkumuleret gavnlige mutationer kan hurtigt udkonkurrere deres medmennesker. Her præsenterer vi en simpel procedure for at visualisere intraspecies konkurrence i en bakteriel cellepopulation over tid ved hjælp af fluorescerende mærkede individer.
Abstract
Mange mikroorganismer såsom bakterier formere sig ekstremt hurtigt, og befolkningen kan nå høje celletætheder. Små fraktioner af celler i en population har altid akkumulerede mutationer, der enten er skadelige eller gavnlige for cellen. Hvis fitnesseffekten af en mutation giver delpopulationen en stærk selektiv vækstfordel, kan individerne af denne delpopulation hurtigt udkonkurrere og endda helt eliminere deres umiddelbare stipendiater. Små genetiske ændringer og udvælgelsesdrevet akkumulering af celler, der har erhvervet gavnlige mutationer, kan således føre til et fuldstændigt skift af genotypen for en cellepopulation. Her præsenterer vi en procedure for at overvåge den hurtige klonudvidelse og eliminering af henholdsvis gavnlige og skadelige mutationer i en bakteriecellepopulation over tid ved cocultivation af fluorescerende mærkede individer af grampositiv modelbakterien Bacillus subtilis. Metoden er let at udføre og meget illustrativ at vise intraspecies konkurrence blandt individerne i en bakteriel cellepopulation.
Introduction
Jordbakterier er normalt udstyret med fleksible reguleringsnetværk og bred metabolisk kapacitet. Begge funktioner gør det muligt for cellerne at justere deres katabolske og anabolske veje for at konkurrere med deres medmennesker og andre mikroorganismer for næringsstofferne, som er tilgængelige i en given økologisk niche1. Men hvis bakterierne ikke er i stand til at tilpasse sig deres miljø andre mekanismer kan tegne sig for overlevelse af en art. Faktisk, som mange bakterier formere sig hurtigt og befolkningen kan nå høje celletætheder delpopulationer kan have spontant akkumuleret gavnlige mutationer, der giver cellerne med en selektiv vækst fordel og derfor øge deres egnethed. Desuden kan mutationelle hotspots og stress-induceret adaptiv mutagenese lette udviklingen af en maladapted bakterie2,3. Således er akkumulering af mutationer og vækst under kontinuerlig udvælgelse oprindelsen til den enorme mikrobielle mangfoldighed, selv inden for samme slægt4,5. Som i naturen forekommer formning af bakterielle genomer også i laboratoriet på grund af kontinuerlig dyrkning under udvælgelse. Dette er eksemplificeret ved domesticering af Gram-positive bakterie B. subtilis, som bruges på verdensplan i grundforskning og i industrien. I 1940'erne B. subtilis blev behandlet med DNA-skadelige røntgenstråler efterfulgt af dyrkning under en bestemt vækst tilstand6. De mutationer, der er akkumuleret i bakterierne under deres domesticering, tegner sig for tabet af mange vækstegenskaber, dvs.
I dag, for de bedst studerede modelbakterier Escherichia coli og B. subtilis, er en række kraftfulde værktøjer tilgængelige for genetisk at manipulere deres genomer for at løse specifikke videnskabelige spørgsmål. Nogle gange forårsager inaktivering af et interessegen en alvorlig vækstfejl, som derefter er tydeligt synlig på standardvækstmedium9. I modsætning hertil ignoreres mutationer, der forårsager en svag vækstfejl og dermed kun lidt påvirker belastningens egnethed, ofte. Men i begge tilfælde resulterer langvarig inkubation og passaging af mutantstammerne i flere generationer normalt i akkumulering af suppressor mutanter, der har genoprettet fænotypen af moderstammen2,9. Karakteriseringen af suppressor mutanter og identifikationen af de mutationer, der har genoprettet vækstfejlen i den overordnede mutantstamme, er en meget nyttig tilgang, der tillader belysning af vigtige og ofte nye cellulære processer10,11.
Vi er interesseret i kontrollen med glutamathomøostase i B. subtilis12. I lighed med E. coli, B. subtilis reagerer på turbation af glutamathomøostase (dvs.blok i glutamatforringelse2) ved akkumulering af suppressor mutanter. De genomiske ændringer i disse suppressor mutanter, der blev erhvervet ved spontan mutation, viste sig hurtigt at genoprette glutamathomøostase9,13. Derfor er det ikke overraskende, at tilpasningen af B. subtilis til en bestemt væksttilstand under domesticering af bakterien afspejles i enzymsyntese og i de udviklede enzymatiske aktiviteter, som er involveret i glutamatmetabolisme12. Det er blevet antydet, at manglen på eksogen glutamat i vækstmediet under domesticeringsprocessen var drivkraften bag fremkomsten og fikseringen af det kryptiske glutamat dehydrogenase (GDH) gudBCR-genet i laboratoriestammen 1682,14. Denne hypotese understøttes af vores observation af, at den reducerede mængde GDH-aktivitet i laboratoriestammen giver bakterierne en selektiv vækstfordel, når eksogen glutamat er knap2. Desuden resulterer dyrkning af en B. subtilisstamme, der syntetiserer GDH GudB, i mangel af eksogen glutamat i akkumulering af suppressor mutanter, der har inaktiveret gudB-genet 2. Det er klart, at tilstedeværelsen af et katabolisk aktivt GDH er ufordelagtigt for cellen, fordi endogent produceret glutamat, der ellers kunne anvendes til anabolisme, nedbrydes til ammonium og 2-oxoglutarat (figur 1). I modsætning hertil, når glutamat leveres af mediet, har en B. subtilis-stamme udstyret med højt niveau GDH-aktivitet en selektiv vækstfordel i forhold til en stamme, der syntetiserer kun et funktionelt GDH. Det er rimeligt at antage, at GDH-aktivitet på højt niveau gør det muligt for bakterierne at udnytte glutamat som en anden kulstofkilde ud over andre kulstofkilder fra mediet2 (se figur 1). Således påvirker GDH-aktivitet stærkt bakteriernes egnethed, afhængigt af tilgængeligheden af eksogen glutamat.
Her præsenterer vi en meget illustrativ metode til at overvåge og visualisere intraspecies konkurrence mellem to B. subtilis stammer, der adskiller sig i en enkelt locus på kromosomet (Figur 2). De to stammer blev mærket med yfp og cfp gener kodning fluorophores YFP og CFP, og cocultivated under forskellige ernæringsmæssige forhold. Ved at udtage prøver over tid og ved at forgylde passende fortyndinger på agarplader kunne de overlevende i hver af kulturerne let overvåges ved hjælp af et fælles stereofluorescensmikroskop. Den procedure, der er beskrevet i dette papir, er let at udføre og egnet til at visualisere den hurtige klonudvidelse og eliminering af henholdsvis gavnlige og skadelige mutationer i en cellepopulation over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Agar Plader, Kultur Medier, Cryostocks, og Precultures
- Forbered vækstmedier og påkrævede reagenser (se tabellen over materialer og reagenser).
- Stribe B. subtilis stammer(f.eks. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) og BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) udtrykker henholdsvis en og to aktive GDH'er2, der vil blive brugt i konkurrenceeksperimentet på SP mellemstore agarplader for at få enkelte kolonier. Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
- Tag enkelte kolonier og pod sterile dyrkningsrør, der indeholder 4 ml LB flydende medium. Bakterierne dyrkes natten over ved 28 °C og 220 omdrejninger i minuttet.
- Vokse natten kulturer ved 28 °C for at undgå, at cellerne lyse eller spores.
- Den optiske tæthed af kulturerne måles ved en bølgelængde på 600 nm (OD600)ved hjælp af et standardspektrofotometer.
- Hvis kulturerne harnået en OD på 600 af 2,0, blandes 0,75 ml af kulturerne med 0,75 ml steril 50% glycerolopløsning i 1,5 ml reaktionsrør. Den endelige OD600 skal være 1,0 for at opnå kryostocks, der indeholder ca.10 8 celler/ml.
- Rørene opbevares ved -80 °C.
- Lav tre prækulturer af hver stamme mærket med den fælles fiskeripolitik og yfp kodning fluorophore gener. Prækulturerne (sterile dyrkningsrør indeholdende 4 ml LB flydende medium) podes med 1 μl celler fra -80 °C kryostocks. Inkuber kulturerne natten over ved 28 °C og 220 omdrejninger i minuttet.
2. Cocultivation af bakterier, prøveopsamling og prøveopbevaring
- Der fremstilles et minimalt medium på 100 ml C-Glc og CE-Glc (se tabellen over reagenser og materialer), og der overføres 20 ml af hvert medium til sterile 100 ml shakekolber.
- Der tages 0,1 ml af de prækulturer, der blev dyrket natten over, fortyndes med 0,9 ml LB-medium i en 1,5 ml cuvette, og OD600bestemmes .
- For konkurrencen eksperiment, tage de prækulturer af de forskellige stammer, der har en lignende OD600 mellem 1,0-1,5.
- For at opnå blandede cellepopulationer fortyndes cellerne i de prækulturer, der havde den relevante OD600 til en OD600 på 0,05 i 20 ml C-Glc og CE-Glc minimal medium suppleret i 100 ml rystekolber. Til konkurrenceeksperimentet skal de to stammer blandes i et 1:1-forhold.
- Der udtages 10 ml prøver fra kolberne, de overføres til 15 ml plastrør, cellerne høstes ved centrifugering i 10 minutter ved 4.000 x g i en standardcentrifuge på bordpladen, og supernatanten kasseres.
- Resuspend cellerne i 0,5 ml frisk LB medium, og overføre cellerne til en steril 1,5 ml reaktion kop. Der tilsættes 0,5 ml steril glycerol på 50%, suspensionen blandes ved streng hvirvelstrømning, og prøverne opbevares i en fryser på -80 °C indtil videre.
- Inkuber de celler, der er tilbage i rystekolberne i op til 24 timer ved 37 °C og 220 omdrejninger i minuttet. Hold rystekolberne i mørke for at forhindre fotoblegning af fluorrørene.
- Der udtages yderligere prøver på 0,1 ml efter 7 timer og 24 timers vækst. Prøvernes OD600 på 1:10 fortyndinger (i C-Glc eller CE-Glc minimal medium) måles og noteres.
- Tag den passende mængde celler fra hver kultur til at gøre cryostocks, der har en OD600 af 1,0. Prøverne opbevares ved -80 °C indtil videre behandling.
3. Prøvebehandling, plating og inkubation til kvantitative analyser
- Efter indsamling af alle prøver optøes kryostocks og fortyndes cellerne i en 0,9% saltvandsopløsning (se tabellen over reagenser og materialer) op til 10-3.
- Plade 0,1 ml af de 10-3 fortyndinger på SP medium agar plader og distribuere cellerne ved hjælp af sterile glas pipetter.
- Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C i mørke, indtil der er opstået enkelte kolonier.
4. Optælling af overlevende ved Stereo Fluorescens Mikroskopi til kvantitativ analyse
- Del bunden af agarpladen med en sort pen i fire dele for en bedre orientering, mens du tæller de overlevende under stereo fluorescensmikroskopet.
- Placer pladen på hovedet under mikroskopet og bringe kolonierne i fokus ved hjælp af den kolde lyskilde.
- Når kolonierne er i fokus, skal du skifte til det passende filtersæt for den fælles fiskeripolitik for at visualisere de overlevende celler i den fælles fiskeripolitik-mærket stamme. Tæl de overlevende fra denne stamme ved at mærke kolonierne med en pen og notere nummeret.
- Fjern etiketterne med ethanol, og skift til YFP-filteret for at visualisere de overlevende celler i den yfp-mærkedestamme. Tæl de overlevende igen ved at mærke kolonierne med en pen og notere nummeret.
5. Prøvebehandling og mikroskopi til semikvantitative analyser
- For illustrative tal skal du få øje på 10 μl af fortyndingen på10-4 (ca. 100 celler) fra trin 3.1 på en SP agarplade (se figur 3).
- Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C i mørke, indtil der er opstået enkelte kolonier.
- Placer petriskålen uden låg under mikroskopet, og sæt stedet i fokus ved hjælp af den kolde lyskilde.
- Tag billeder af pletterne til illustrative figurer. Vælg en passende eksponeringstid for at tage billeder af kolonierne med den kolde lyskilde.
- Uden at flytte pladen, skift til den fælles fiskeripolitik filter sæt, justere eksponeringstiden og tage et billede. Gør det samme med YFP-filtersættet, og gem billederne til yderligere analyser.
6. Dataanalyse
- Brug software som Excel til de kvantitative dataanalyser. Baseret på de optalte kolonier skal du beregne procentdelen af gule og blå kolonier i forhold til hele antallet af kolonier, som er indstillet til 100%.
- Brug de beregnede tal til at oprette et stablet søjlediagram (se Figur 4 og Figur 5). Brug et billedbehandlingsprogram som Adobe Photoshop til at konstruere flettede billeder af de billeder, der er taget fra de forskellige steder. Alternativt kan den frit tilgængelige software ImageJ, der kan downloades fra http://rsbweb.nih.gov/ij/, bruges til billedbehandling.
- Åbn billederne fra ét sted, der blev taget med filtersættet til den fælles fiskeripolitik og YFP-filtersættet. Optimer kontrasten og lysstyrken for at reducere eventuelle baggrundslyscens fra medierne.
- Gå til et af billederne, og marker alle. Kopier billedet, og indsæt det på det andet billede.
- Brug enten funktionen "color dodge" til at flette billederne eller overlejre de fluorescerende billeder ved hjælp af fanen kanaler. Fusionerede billeder af kolonierne fra forskellige medier og forskellige tidspunkter repræsenterer væksten af de forskellige stammer inden for den flydende kultur.
7. Specifikke tips: Dye Switch Eksperiment og cocultivation af isogene stammer mærket med cfp og yfp
Udtrykket af en af de to fluorophore-kodning gener i B. subtilis kan påvirke fitness og dermed vækstraten for bakterierne. Det anbefales derfor at udføre følgende forsøg for at udelukke, at elimineringen af en konkurrentstamme fra cellepopulationen under dyrkning simpelthen skyldes en negativ effekt af fluorophoren:
- Gentag hele eksperimentet, og cocultivate inverst mærkede stammer(f.eks. er den tidligere fælles fiskeripolitik-mærkedestamme nu mærket med yfp-genet og omvendt). Selv om de opnåede resultater er inverse, bør de være sammenlignelige med den foregående bemærkning om, at den ene stamme har en selektiv vækstfordel i forhold til den anden stamme.
- Gentag hele eksperimentet og cocultivate isogene stammer mærket med yfp og cfp (f.eks BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) og BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Anslå den negative effekt af en af de to fluorophorer på bakteriernes egnethed ved at følge cellepopulationens sammensætning over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den her beskrevne metode blev anvendt med succes til at visualisere intraspecieskonkurrence i en cellepopulation bestående af B. subtilisstammer, der var mærket med henholdsvis den fælles fiskeripolitik og yfp-gener, der kodede henholdsvis fluorophores CFP og YFP. Som vist i figur 3kan metoden bruges til at visualisere intraspecieskonkurrence på en meget illustrativ måde. Ved at spotte prøverne på små områder blev cellepopulationens kloniske sammensætning gjort synlig med et øjeblik. Selv om denne fremgangsmåde ikke er egnet til kvantitative analyser, er den nyttig til groft at vurdere virkningen af forskellige vækstparametre(dvs.kvælstofkilde) på udviklingen af en cellepopulation, der oprindeligt indeholdt begge stammer i lige store mængder (figur 3). Desuden kan egnetheden af forskellige B. subtilisstammer, der blev dyrket under samme væksttilstand, testes ved hjælp af en enkelt agarplade i en mindre tilgang. Ved kvantitative analyser anbefales det at udbrede prøverne over hele overfladen af en agarplade. Dette vil forhindre overlejring af kolonierne og dermed giver mulighed for særskilt identifikation og optælling af kolonier, der opstod fra enkelte celler. Ved at forgylde passende fortyndinger på agarplader kan cellepopulationens kloniske sammensætning over tid bestemmes præcist ved blot at tælle de gule og blå fluorescerende kolonier (se figur 4). Som vi tidligere har rapporteret, påvirker GDH-aktivitet stærkt egnetheden af B. subtilis afhængigt af tilgængeligheden af eksogen glutamat2. Det er klart, at i mangel af eksogen glutamat er gdh-aktivitet på højt niveau ufordelagtig for bakterierne, da enzymerne RocG og GudB nedbryder glutamat, der er behov for i anabolisme (se figur 1 og figur 4A). I modsætning hertil, hvis det leveres til bakterierne, kan glutamat tjene som en aminogruppedonor i transaminationsreaktioner. Desuden kan glutamat tilføres kulstofmetabolisme og anvendes som energikilde på grund af tilstedeværelsen af de katabolisk aktive GDHs RocG og GudB (figur 1 og figur 4B). Som det fremgår af figur 4C og 4D, blev der opnået lignende resultater i et farvekontakteksperiment. Igen blev bakterier udstyret med høj BNP-aktivitet udkonkurreret af celler med reduceret GDH-aktivitet i vækstmedier, der manglede glutamat. I modsætning hertil blev bakterier, der syntetiserede kun et aktivt GDH, elimineret fra kulturen, da mediet blev suppleret med glutamat. Som det fremgår af figur 5A og 5B, forblev den oprindelige sammensætning af den blandede cellepopulation næsten konstant over tid. I konkurrenceeksperimentet skyldtes elimineringen af en af de to stammer, der var udstyret med forskellige mængder GDH-aktivitet, således ikke en vækstfejl forårsaget af fluorrørene (se figur 4). Samlet set er brugen af fluorophorer et kraftfuldt værktøj til overvågning af intraspecies konkurrence i en bakteriel cellepopulation.
Figur 1. Forbindelsen mellem kulstof og kvælstof metabolisme i B. subtilis. Når glutamat ikke leveres af mediet, syntetiseres den største aminodonor, der er nødvendig for anabolisme, fra ammonium og 2-oxoglutarat ved den kombinerede virkning af glutaminsynetase (GS) og glutamatsyntase (GOGAT). I modsætning hertil kan det katabolisk aktive GDHs RocG og/eller GudB i nærværelse af eksogen glutamat nedbryde glutamat til ammonium og 2-oxoglutarat, som derefter fungerer som kulstofkilde.
Figur 2. Eksperimentel arbejdsgang. Stamme 1 (mærket med yfp)og stamme 2 (mærket med cfp)adskiller sig i et locus fra hinanden. I eksemplet her har vi sammenlignet effekten af eksogen glutamat (effektor) på det genotypiske skift i cellepopulationen, der oprindeligt indeholdt 50% af rocG+ gudB+ (kodning af to aktive GDH'er) og 50% af rocG+ gudBCR (kodning af en aktiv GDH) celler. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Semikvantitativ tilgang til visualisering af intraspecifik konkurrence på en beskrivende måde (se afsnit 5). Før cocultivation (0 timer), og efter 7 timer og 24 timers vækst fortyndinger (10-4)af celler blev spottet på SP agar plader. De overlevende celler, der har dannet kolonier efter 12 timers inkubation ved 37 °C, blev identificeret ved stereo fluorescensmikroskopi. Eksponeringstid, 0,6 sek. skalastang, 1 mm. Dette tal blev ændret fra Gunka et al. 20132.
Figur 4. Kvantificering af intraspecifik konkurrence. Efter prøvefortynding og formering af cellerne (se trin 3.1-3.3) på SP-medium blev pladerne inkuberet natten over ved 37 °C. Gule og blå kolonier blev kvantificeret som beskrevet i protokol 4 og 6. De sorte fejllinjer repræsenterer standardafvigelser for mindst fire uafhængigt gentagne eksperimenter. Hver agar plade indeholdt mindst 100 tællelige kolonier. (A) I mangel af eksogen glutamat er B. subtilisstammen BP40 (gul) udstyret med kun én funktionel GDH-udkonkurreringsstamme BP54 (blå), som syntetiserer både glutamatnedbrydende enzymer, RocG og GudB. (B) Derimod er syntese af to funktionelle GDH'er fordelagtig for bakterierne, når der er exogen glutamat til rådighed, fordi glutamat ud over glukose anvendes som kulstofkilde. Som det fremgår af (C) og (D), blev der opnået sammenlignelige resultater i et farvestofskifteeksperiment. Dette tal blev ændret fra Gunka et al. 20132. Klik her for at se større billede.
Figur 5. Kontroleksperiment til vurdering af effekten af fluorophore-kodningsprægede og yfp-gener på bakteriernes egnethed. Blandede populationer af isogene stammer BP40 (rocG+ gudBCR amyE::yfp) og BP41 (rocG+ gudBCR amyE::cfp) eller BP52 (rocG+ GudB+ amyE::cfp) og BP156 (rocG+ gudB+ amyE::yfp) blev dyrket i fravær (A) og i nærværelse (B) af udefrakommende glutamat. De overlevende celler blev talt som beskrevet i protokol 1-4 og 6. Søjlerne repræsenterer standardafvigelser for mindst fire uafhængigt gentagne eksperimenter. Dette tal blev ændret fra Gunka et al. 20132. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere metoder er blevet udviklet til at analysere konkurrencedygtige egnethed af bakterier16. I mange tilfælde bakterierne var mærket med forskellige antibiotikaresistens kassetter17. I lighed med vores tilgang gør mærkning af cellerne med antibiotikaresistenskassetter det muligt at evaluere bakteriernes konkurrencedygtige egnethed under cocultivation under definerede vækstbetingelser. Desuden kan denne metode bruges til at bestemme konkurrencedygtig egnethed af celler, der adskiller sig fra hinanden i et bestemt locus på kromosomet17. Der er dog nogle ulemper ved hjælp af antibiotikaresistens kassetter til at overvåge konkurrencedygtige fitness. Da ekspressionen af resistensgener for det meste er drevet af initiativtagere, der har ulige styrke, produceres enzymerne, der giver resistens over for antibiotika, sandsynligvis på forskellige niveauer. Derfor kan svage fitnesseffekter muligvis ikke påvises med denne tilgang. I vores tilgang blev begge fluorophore gener integreret med den samme udvælgelsesmarkør, og deres udtryk er drevet af de samme initiativtagere2. En anden ulempe at overvåge konkurrencedygtige fitness med antibiotikaresistens kassetter kan være, at den fremgangsmåde er mere besværligt som to typer af agar plader suppleret med de relevante antibiotika er nødvendige for kolonien tælle. Alternativt kan bakteriernes egnethed bestemmes ved blot at overvåge vækstraten og ved beregningen af et såkaldt fitnessindeks16. Det er klart, at dette er den mest præcise tilgang, fordi bakterierne dyrkes individuelt, og giftige forbindelser, der kan produceres af en stamme med en bestemt genotype, vil ikke påvirke væksten af den konkurrerende stamme. Desuden er der ingen grund til at bruge antibiotika, der kan påvirke væksten af cellerne. Begge tilgange er dog ikke særlig illustrative, da de tal, der beskriver konkurrencemæssig egnethed, kun kan præsenteres på en ret neutral måde.
Brugen af fluorophore kodning gener til at overvåge og kvantificere intraspecies konkurrence har flere fordele i forhold til andre metoder. Hvis begge stammer har integreret fluorophore kodning gener ved dobbelt homolog rekombination i kromosomet, er der ingen grund til at bruge antibiotika i nogen af de dyrkning trin. Derfor kan prøver, der tages fra kulturen under dyrkning, analyseres på samme vækstmedium, og begge stammer er i stand til at vokse. Denne tilgang gør det muligt at visualisering af intraspecies konkurrence på en meget illustrativ måde. Desuden kan flere vækstbetingelser testes på samme tid ved hjælp af denne semikvantitative tilgang, og mange forskellige stammer kan sammenlignes parallelt. Endelig er der ikke behov for fiksering af prøverne på mikroskopdias, fordi de prøver, der blev taget fra bakteriekulturen under cocultivation, kan opbevares i en fryser18. Således kan alle prøver og replikater analyseres på samme tid.
To kritiske skridt i vores protokol skal nævnes. Det er vigtigt at bemærke, at kryostocks bør indeholde lige store mængder celler i samme vækstfase af hver konkurrent stamme. En indledende misforhold mellem stammerne i kryostocks og dermed i rystekolbene, før eksperimentet påbegyndes, vil have en stærk indvirkning på resultatet af konkurrenceeksperimentet. Derfor er det klogt at kontrollere sammensætningen af kryostocks forud for eksperimentet. Desuden bør en passende mængde celler jævnt formeres over pladen. Ellers er de opståede kolonier for tæt på hinanden, og en præcis bestemmelse af de overlevende celler vil blive vanskelig.
Der er også nogle begrænsninger og ulemper ved den fluorophorebaserede tilgang. Cocultivation i en multi-well pladelæser og samtidig påvisning af den fælles fiskeripolitik og YFP-signaler er ikke mulig, da fluorophorernes excitations- og emissionsspektre er for tæt på hinanden. Dette tekniske problem kan dog omgås ved hjælp af forskellige fluorescerende proteiner, såsom dem, der udsender grønt og rødt lys, optimalt baseret på det samme proteinstillads. En anden ulempe ved den fluorophore-baserede tilgang kunne være, at nogle mutationer kun forårsager en svag vækstfejl i bakterierne. Så hvis den vækstfejl, der kan være forårsaget af en af de fluorophore-kodning gener er stærkere end den vækst defekt forårsaget af en bestemt mutation, fluorophore-baserede tilgang er ikke hensigtsmæssigt at analysere intraspecies konkurrence. Derfor anbefales det, før du opretter et helt sæt stammer, først at mærke forældrestammen med både cfp og yfp og at cocultivate stammerne. Væksteksperimenterne vil afsløre, hvor stærke fluorophorerne påvirker bakteriernes egnethed (se figur 5A og 5B).
I fremtiden bliver det interessant at teste, om den fluorophorebaserede tilgang til overvågning af intraspecieskonkurrence vil være mere præcis og mindre besværlig, hvis de overlevende celler tælles ved hjælp af flowcytometry. For nylig har flowcytometry vist sig at være et kraftfuldt værktøj til at analysere sammensætningen af B. subtilis biofilm19. Desuden kan det være mere hensigtsmæssigt at analysere svage fitness effekter, der påvirker konkurrencedygtige egnethed bakterier ved kontinuerlig cocultivation af fluorophore-mærkede bakterier i en fermenter. I modsætning til shakekolber gør denne tilgang det muligt at holde vækstbetingelserne konstante og dermed overvåge intraspecieskonkurrence over en lang periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbejdet i forfatternes laboratorium blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), Fonds der Tjetjener Industrie (http://www.vci.de/fonds) og Göttingen Center for MolekylærBiologi (GZMB). Forfatterne vil gerne anerkende Jörg Stülke for nyttige kommentarer og kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
- Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
- Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection. PLoS One. 8, (2013).
- Al Mamum, A. A. M., et al. Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks. Science. 338, 1344-1348 (2012).
- Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species. ISME J. 7, 1080-1091 (2013).
- Maughan, H., Nicholson, W. L. Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).
- Burkholder, P. R., Giles, N. H. Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis. Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).
- McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium. J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).
- Zeigler, D. R., et al. The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains. J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).
- Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase. 194, 1036-1044 (2012).
- Commichau, F. M., et al. Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).
- Beckwith, J. Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory. J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).
- Gunka, K., Commichau, F. M. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation. Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).
- Yan, D. Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes. J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).
- Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC. Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).
- Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A.
- Rabatinová, A., et al. The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell. J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).
- Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families. Cell. 150, 222-232 (2012).
- García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (15), (2012).
