Summary
このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。
Abstract
好中球は、感染および血液中のそれらの数に対する保護において重要な役割を果たして頻繁に診療所で測定される。低好中球数は感染症の高いリスクについて警告サインであるが、血液中の高い好中球数は、通常、進行中の感染症の指標である。その機能を達成するために、好中球はまた、感染症が発生する組織内に、彼らの人生の大半を費やし、血液から効果的に移動できるようにする必要がある。その結果、移行する好中球の能力の欠陥は、好中球は、血液中の適切な数で存在する場合にも、感染症のリスクを高めることができます。しかし、診療所での好中球の遊走能を測定することは、時間がかかり、困難な作業であり、多量の血液、及び専門的な知識が必要になります。これらの制限に対処するために、我々はまわり、未処理の血液の一滴を必要とする好中球遊走のためのロバストなマイクロ流体アッセイを設計した好中球の分離の必要性を通気し、簡単な顕微鏡で定量化することは容易である。このアッセイでは、好中球は、化学誘引物質源に向かって、小さなチャネルを通して、血液の液滴から直接移行します。同じチャネルを介して赤血球の粒状流れを防止するために、我々は、選択的に赤血球の進行をブロックすることになり直角と機械的にフィルタを実装した。我々は、指穿刺および静脈血から採取された血液の液滴からの好中球遊走を比較することによりアッセイを検証した。我々はまた、精製された好中球のサンプルから好中球の遊走これらの全血（WB）のソースを比較し、3ソース間の一貫性の速度と方向性を見つけた。このマイクロ流体プラットフォームは、健康と病気における好中球機能の理解を進めるために役立つクリニックや研究環境で、人間の好中球遊走の研究が可能になります。
Introduction
好中球の人身売買は、アテローム性動脈硬化症1、細菌感染症や敗血症2を含む多くの炎症状態の進行と解像度を決定する上で重要な役割を果たしており、傷害3を焼く。健康と病気の状態への主要な貢献のために、好中球数は、多くの場合、臨床および研究実験室で検討標準的な血液分析の一部である。しかし、ほとんどのユビキタス試験の一つであるにも関わらず、感染症や敗血症の診断における好中球数の値が頻繁に4を疑問視されている。例えば、熱傷患者における好中球の1の研究では、好中球数及び好中球遊走機能は相関しないことを明らかにした。好中球が単独で数えることを意味して免疫状態3の正確な指標ではありません。測定することはより困難であるが、好中球の機能的能力は、広範囲の条件でより価値として提案されている。
tは ">重要なのは、好中球の欠陥の多くは一過性であり、恒久的な遺伝的欠陥によってトリガされず、大部分は最近まで、診療所で見過ごされてきた区別は。火傷の文脈では、好中球遊走はもちろん中に監視することができた炎症状態または感染3の指標として、患者の治療が、彼 らは大量の血液を必要とするため、現在の研究室（Boydenチャンバー、ダン室、マイクロピペットアッセイ）で使用される従来の移動アッセイは、臨床現場に翻訳することができず、面倒で時間のかかる好中球の単離技術（ 表1）。好中球の単離のために必要な血液の量は、一つのサンプルのみを可能にし、多くの場合、偶数のプーリングを必要とするため、これらのアッセイはまた、マウスなどの実験小動物における好中球走化性の過渡的変化を監視するために使用することができない単一のアッセイのための複数の動物から血液が、例えば、関係する研究では、M複数の時点にわたるultiple条件や治療は、潜在的に、現在の走化性アッセイを用いて、マウスの数千を必要とする可能性があります。これは、損傷、感染症との関連で、免疫機能の複雑な力学を理解したり、多くの場合、マウスモデル5で研究を燃やすために行うことができる基本的な生物学的研究を制限します。最小限の血液量を必要としながら、迅速なロバストである好中球機能アッセイの必要性に対処するために、我々は、全血の小滴から直接好中球走化性を測定するマイクロ流体デバイスを開発した。これは、血清6および7を含む血小板を全血には多くの要因が、好中球機能に影響を与えることが知られている。なお、全血のマイクロ流体アッセイはin vitroアッセイで8走化性における変化を測定するとき、好中球のインビボでの微小環境を維持するために、試料の処理を最小限に抑えることが有益である。このアプローチわずか数分（ 表1）に、従来の技術を用いて時間で好中球遊走アッセイに採血からの時間を低減する。全血のマイクロ流体プラットフォームは、実験期間のための安定した直線的誘引物質勾配を生成し、可動部品がなく、外部の圧力源（ すなわちシリンジポンプ）を必要としない。全血のマイクロ流体デバイスの設計における重要な特徴は、機械装置の移動路に入るのRBCをフィルタリングする赤血球（RBC）を濾過コムの組み込みである。このろ過櫛の右ターンはおそらく赤血球で詰まることになるサイズ排除濾過の必要性を防ぐため、WBに積極的に移行し、好中球に到達する化学誘引物質勾配を遮断する。 12または24ウェルプレート中の全血のマイクロ流体装置の組み込みは、ヒトまたはマウスの好中球走化性siを複数のメディエーターのスクリーニングを容易にする同時進行。
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Protocol
1。マイクロ流体デバイスの作製
- 標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して、クラス千クリーンルーム内でマスターモールドウェハを作製。パターン製造業者の指示に従って、移行チャネルを定義するための第3μmの薄いエポキシベースのネガ型フォトレジスト層を形成する。パターンセルローディングおよびケモカイン室を定義する第50μmの厚さの層。
- ポリジメチルシロキサン（PDMS）デバイスをキャストするようにパターン化ウェハを使用しています。激しく大きなプラスチック秤量トレイのプラスチックフォークを用いて5分間、開始剤（2g）を用いてPDMS（20g）に混合する。
- 慎重に、金型上に、PDMSを注ぐ。
- 1時間真空乾燥器にあけ、PDMS金型を配置することによって、PDMSを脱気。
- 焼くと65℃に設定したオーブンで、少なくとも3時間、PDMSマイクロ流体デバイスを治す
- 1.5ミリメートルの先端径とパンチャーを使用して中央WBLCsを打ち抜く。
- 穿刺を用いて全ドーナツ型のデバイスをパンチアウト5.0ミリメートルの先端径と彼女。
- 粘着テープを使用したドーナツデバイスから粒子を除去する。
- 脱イオン水で12ウェルプレートを洗い流してから窒素で乾燥。 5分間60℃のオーブンにプレートを置きます。
- 酸素プラズマは、二回の12ウェルプレートを治療する;一回だけでは35秒してから、再度、別の35秒間のドーナツデバイスと。
- 慎重にピンセットを用いてプレートのウェル内のデバイスを配置します。
- 10分間80℃に設定したホットプレート上に結合したデバイスとのベークプレート。
2。マイクロ流体アッセイの準備
- 直ちに酸素プラズマ処理後の素数マイクロ流体デバイスは、デバイスは、親水性及び毛細管効果がある場合、デバイスの小さなチャネルのプライミングを促進することができる。
- 5μLフィブロネクチン[原液を1 mg / mlの]と490μlのHBSSで5μLのfMLP [原液を10μm]を混合して化学誘引ソリューションを作成します。
- ゆっくりとピペット＆＃160; WBLCに化学誘引物質溶液、ゲルローディングチップ（ 図1A）を使用して。ピペット装置の外部の周りの化学誘引物質の追加の20μL。
- 15分間デシケーター中でプレートを置きます。装置に真空を適用することにより、溶液を装置及びPDMSを通って拡散される空気のサイドチャネルに注入される。
- デシケーターからプレートを取り外し、顕微鏡下でデバイスチャネルの濡れ性を確認。化学誘引物質溶液がチャンバに入ると、気泡が小さくなるように見る。気泡は、真空処理後のデバイス内に存在してはならない。
- 徹底的に余分な化学誘引物質溶液を除去するための装置のWBLCと外側を洗ってください。このステップは、デバイスセンターに焦点走化性チャンバー（FCCの）のそれぞれから誘引物質の勾配を発生させる。
- シリンジに30Gの鈍針の先端を追加し、PBSで1 mLの注射器を埋める。優しく、シリンジの針の先端を挿入ドーナツ穴の中心。そっと穴に100μlのPBSをプッシュするようにデバイス上部のPBS形の滴。
- 傾斜プレートピペット装置の周りのPBS 1mlの液体がウェルの底に集まるようにする。吸引除去新鮮な緩衝液を用いて3倍の合計のために液体を繰り返しプロセス（代わりにバッファの使用メディア分離好中球がメディアにロードされる場合）9。
- デバイスの上部に液体の下に沈むまで、メディアと各ウェルを埋める。デバイスは、勾配が安定するまで15分間放置します。実験結果と有限要素シミュレーションから理論的なデータは、これらのデバイス内の勾配は小分子（ 例えば 、fMLPで）のために、より大きな分子量（ 例えば 、IL-8）のためのいくつかの日まで24時間まで安定であることを示している。
- ゲルローディングチップを使用して、徐々に各々の全血LOAに2血液の液（または単離された好中球）をピペット丁室（WBLC）（ 図1A）。
3。サンプルの調製
毛細血管血液からヒト好中球
- 無免疫抑制剤である健康なボランティアの指を刺すから毛細管血を収集します。すべての患者のサンプルは、書面によるインフォームドコンセントを得て、MGHとシュライナー治験審査会によって承認された手順を経て行った。
- 指穿刺採血のために、水と石鹸で手を洗い、皮膚を乾燥させます。採血管（1.65 USP/50μlの血液）をヘパリンに1ミリリットルのHBSS +0.2％HSAおよび10μlのヘキスト染色（32.4μM）を添加することによりanti-coagulant/stainストック溶液を準備します。優しく、SurgiLance安全ランセット（2.2 mmの深さ、22）を用いた指を刺し血液の最初の一滴を払拭し、株式抗凝固剤およびヘキスト蛍光染色溶液（10μl）を含むエッペンドルフチューブ内の血液の50μLを収集し、混ぜる。
静脈血から、ヒト好中球
- 33 USPヘパリンを含む試験管に末梢静脈血の10ミリリットルを描画します。
- 前述したように、メディアとヘキスト染色に静脈血50μlを加える。核蛍光染色を可能にするために10分間の血とヘキスト染色をインキュベートする。採血の1時間以内にサンプルを実行します。
全血からの好中球の分離 - ポジティブコントロール
- 好中球を分離ヘタスターチを用いて10ミリリットル静脈全血サンプルから好中球を単離するために、無菌技術を使用する（6％w / v）の製造業者のプロトコールに従ってネガティブ選択磁気ビーズ単離キット、続いて密度勾配。
- concentrで好中球の最終的な分量を再懸濁1X HBSS +0.2％ヒト血清アルブミン/μL4000細胞のATION。実験を実行する準備が整うまで、37℃で細胞を維持する。
好中球走化性測定用4。顕微鏡と画像解析
- 5％、37℃、80％の湿度、およびCO 2へのバイオチャンバーの温度を設定します。
- 顕微鏡（10倍以上の倍率）でタイムラプスイメージングを使用して、すぐに撮像立。
5。統計解析
- 手動で各試料中の少なくとも50の好中球を追跡します。
- 時間をかけて、FCCに入る細胞（ 図2）を数える。
- ImageJの（NIH）（ 図2）を使用してWBLCおよびFCC間のチャネルにおける好中球の速度を計算します。
- 分岐部を通過する細胞の数を計数し、終了番目FCC細胞に向かって回す細胞の数との比を計算することによって好中球の指向性を定量化する電子装置。方向性のないセルは、走化性勾配に従うため、FCCおよび出口チャネル（ 図2）に向けて同数に移行されません。
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Representative Results
全血（WB）好中球走化性アッセイは、fMLPの勾配（ 映画S1）に向かう好中球の蓄積を測定することにより確認した。結果は、好中球（ブルー）が積極的に全血（ 図3Aと動画S1）から移動することができますが赤血球を濾過コームにトラップされていることを確認。全血のマイクロ流体装置によって形成された安定な化学誘引物質線形勾配（緑色）は、FITC-標識デキストラン（ 図3Aの挿入図）を用いて確認し、経時的な蛍光のレベルを測定した。これらのデバイスで生成さ勾配が小さい分子のための24時間までの、より大きな分子量のために週まで安定していた。洗浄プロトコルの効率はWBLCで無信号がFCCにローカライズされた蛍光信号を画像化する、またはデバイスを囲むことにより確認した。デバイスは、次の異なるBLから好中球遊走の差を評価するために使用されたOOD源。
小説のWB走化性プラットフォームを使用して得られた結果は、静脈、WBからのWBの指穿刺液滴からの好中球、または静脈血から単離された一貫性のある速度（20±2mm /分、青線）とし、類似の総遊走細胞（に移行することを明らかにし38±10すべての血液源（ 図3B）からの細胞/時、影付きの棒）。また、方向性や正しく走化性勾配に追従する好中球の能力を定量化することができました。分岐は、私たちは化学運動性の下でランダムに移行し、デバイスを終了し、好中球と比較して、FCCに向かって誘引物質勾配に沿って一方向に移行した好中球を定量化するために許可された全血装置の設計に組み込まれた。すべての3つの血液源から移行する好中球は0.9（デバイスを終了したすべてのセルのためのFCCに向けて9セル）の方向性インデックスに移動した。
図1ドーナッツ型装置の概略図。 A）化学誘引物質は、装置内にプライミングされ、勾配が、焦点走化性チャンバー（カードシャーシ）に向かって移行路に沿って形成されている。十六のFCCの各WBLCを囲んでいます。洗浄後、化学誘引物質は、FCCのままであり、線形勾配は、移行チャネルに沿って形成されている。赤血球（RBC）を濾過コームは、チャンネルを詰まらおよび好中球のアクティブ移行をブロックするからRBCを防ぐことができます。好中球は積極的に全血から移動およびFCCに蓄積し、その速度、方向性と数字を正確に定量することができる）映画S1。Bを参照してください。 拡大表示するには、ここをクリックしてくださいこの図のバージョン。
図2。回路図およびWBのデバイスのための細胞計数スキームの概要。 好中球を積極的に2μlの全血（WB）から移動は、赤血球濾過コームを通過して装置の入口に全血装填室（WBLC）にロードされる。セルの方向性は、分岐部での細胞の決定に基づいて測定される。方向性の好中球は、勾配に従わず、ランダムに平等な分配と出口チャネルに向けてか、FCCのどちらかに移行します焦点走化性チャンバーと無指向性の細胞に対する主要な走化性勾配に従います。最終的な細胞数をFCCで細胞を計数することにより各時点で算出される。files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。全血（WB）の液滴から好中球走化性を測定する。 A）、WB（1μl）を、全血装填室（WBLC）にロードされます。静脈WBからのWBの指穿刺液滴からの好中球（ブルー）、FCCに向けた移行チャネルに形成のfMLP走化性勾配に沿って移動する。B）、好中球、または静脈血から単離された（一貫性のある数字（バー）と速度で移動する青行）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
表1。サイドチャネルマイクロ流体デバイスと従来のBoydenチャンバー対全血のマイクロ流体プラットフォームを使用して好中球の走化性のためのプロトコルの比較。各プロトコルのステップが完了するまでの時間および試薬の量は、好中球走化性を測定するための異なる方法間で比較する。全血のマイクロ流体プラットフォームは、95％によって、アッセイを実行するのに必要な合計時間および血液> 99％の必要な体積を減少させる。
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Discussion
本研究では、血液の小滴（2μL）から好中球の走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォームを開発しました。積極的に好中球の移行からのRBCのオンチップ·機械的ろ過は、好中球を活性化することにより、成果物を導入する傾向があるような密度が10の勾配などの煩雑な細胞分離方法は、ポジティブ選択11、または負の選択12の必要性を回避する。 RBCの機械的ろ過は、好中球の遊走をプロービングするための他のマイクロ流体チップから私たちの技術を区別します。例えば、我々の研究室13からの先行研究ビーブらの前に走化性アッセイに全血サンプルからの好中球を分離するためのチップ上に8利用セレクチン、。セレクチン表面上の分離した後、好中球遊走は、緩衝液中に発生した。これらの条件下では、好中球走化性に対する血清の影響を除去した。また、セレクチンが知られている特定の受容体を係合することにより細胞を活性化するので、 インビトロ走化性測定値に変更することができる。私たちのデバイス内の赤血球ろ過コームによる機械的な分離は、我々の装置によって測定された好中球の状態を変更しません。我々の装置は、速度および細胞蓄積数ならびに細胞指向性の強い測定を容易にする。
本研究では、毛細血管全血、静脈血の一滴、および静脈血から分離から移行する人の健康なボランティアからの好中球は、同様の速度と方向14に移動することが示されている。好中球指向性の測定は、このような方向性が損なわれることが知られている火傷3、15及び16の外傷、炎症状態において重要である。損なわれ、刺激された好中球上では離れて損傷部位から移動し、潜在的に健康な組織への損傷を引き起こす可能性があります。デバイスの存在の制限本論文では、EDは、デバイス上の細胞濃縮は不可能であるため、細胞数、それらがネイティブ全血で発見された割合に依存しているということです。これは、好中球数が低い好中球減少症、などの状態における細胞の有意な数の走化性測定値を取得する際に問題を提示することができる。私たちのデバイス内の別の潜在的な問題を同時に移行する赤血球または他の細胞によって細胞の移行の立体障害である。我々の実験において、好中球は、それらの移動速度を変更することなく、RBC濾過コムの交互に捕捉された過去のRBCを絞ることができる。さらに、化学誘引物質濃度および効力は、細胞遊走を誘導するのに非常に重要である。他の条件でアッセイをトラブルシューティングするには、化学誘引物質の様々な大きさに用量反応曲線を実行することが重要である。このような脂質メディエーターなどのより不安定な化学誘引物質を処理し、処理することも重要であるため、首相のデバイスにとって重要であるWBローディングの直前に。最後に、全血WBデバイスをプライミングする前に凝固しないことも重要である。それは採血血液直後にアッセイを実行することはできません場合は、ヘパリンにロッカーに格納する必要があります。サンプルのロードは、WBデバイスに過度の圧力を導入しないように注意して、ゆっくりと行ってください。
将来的には、我々の装置は、おそらく、好中球機能不全17において重要な役割を果たし、患者の天然の血清から好中球を除去することなく、火傷または外傷患者における好中球機能における摂動を測定するために使用することができる。このデバイスは、これらの患者において正常な好中球機能を回復するために潜在的なプロ解像度の治療薬をスクリーニングするために、将来的に利用することができる。最後に、この装置は、さらに、単球、マクロファージ、およびt-細胞などの他の遊走細胞の走化性を測定するように設計することができる。
結論として、我々は新市街を開発した全血の滴から直接好中球走化性を測定するためのL方法。 12または24ウェルプレート中の全血のマイクロ流体装置の組み込みは、同時に複数の条件のスクリーニングを容易にする。この装置は、火傷および他の炎症状態を治療するための炎症メディエーターの解像度の開発を容易にする。今後、この装置は、患者サンプルとサンプル量が限られているマウスモデルにおいて好中球走化性経時的機能の摂動を測定するために利用される。
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Disclosures
開示する特別の利害関係はありません。
Acknowledgments
国立衛生研究所からのサポートはしてシュライナーズホスピタル·バーンズ（GM092804、DE019938を付与）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Fabrication | |||
| SU-8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30 G ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters | Chroma - Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels | Qimaging - Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C | |
References
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