Summary
Denne protokol beskriver en analyse designet til at måle menneskelige neutrofilkemotaksi fra en dråbe fuldblod med robust reproducerbarhed. Denne fremgangsmåde omgår behovet for neutrofil separation og kræver kun et par minutter af assay forberedelsestid. Mikrofluid chip muliggør gentagen måling af neutrofilkemotaksi over tid hos spædbørn eller små pattedyr, hvor prøvevolumen er begrænset.
Abstract
Neutrofiler spiller en vigtig rolle i beskyttelse mod infektioner og deres numre i blodet ofte måles i klinikken. Højere neutrofiltal i blodet er normalt en indikator for igangværende infektioner, mens lavt neutrofiltal er et advarselsskilt for højere risiko for infektioner. At udføre deres funktioner, neutrofile skal også være i stand til at bevæge sig effektivt fra blodet, hvor de tilbringer det meste af deres liv, ind i væv, hvor infektioner opstår. Følgelig kan enhver fejl i evnen af neutrofiler til at migrere øge risikoen for infektioner, selv når neutrofiler er til stede i passende antal i blodet. Men måling neutrofilmigration evne i klinikken er en udfordrende opgave, som er tidskrævende, kræver stor mængde blod, og ekspertviden. For at imødegå disse begrænsninger, vi har designet en robust mikrofluid assays til neutrofilmigration, der kræver en enkelt dråbe af ubehandlet blod, omstændigvents behovet for neutrofil adskillelse og er let at kvantificere på en simpel mikroskop. I dette assay neutrofiler migrere direkte fra bloddråben, gennem små kanaler mod kilden til kemoattraktant. For at forhindre kornet strøm af røde blodlegemer gennem de samme kanaler, vi implementeret mekaniske filtre med ret vinkel vender, der selektivt blokerer fremrykningen af røde blodlegemer. Vi valideret assay ved at sammenligne neutrofil migration fra bloddråber indsamlet fra stik i fingeren og veneblod. Vi sammenlignede også disse fuldblod (WB) kilder med neutrofilmigration fra prøver af oprensede neutrofiler og fundet konsekvent hastighed og retningsbestemmelse mellem de tre kilder. Denne mikrofluid platform vil gøre det muligt studiet af menneskets neutrofilmigration i klinikken og indstillingen forskning for at medvirke til at fremme vores forståelse af neutrofile funktioner i sundhed og sygdom.
Introduction
Neutrofil handel spiller en afgørende rolle i fastsættelsen af fremskridt og løsning af mange inflammatoriske tilstande, herunder åreforkalkning 1, bakteriel infektion eller sepsis 2, og brænde skade 3. For deres store bidrag til sundheds-og sygdomstilstande, neutrofiltallet er del af standarden blodanalyse ofte betragtes i kliniske og forskningslaboratorier. Men på trods af at være en af de mest allestedsnærværende tests, værdien af neutrofiltallet i diagnosticering af infektion og sepsis er ofte blevet sat spørgsmålstegn 4. For eksempel er en undersøgelse af neutrofiler i brænde patienter viste, at neutrofiltallet og neutrofilmigration funktion ikke korrelerer; signalerer, at neutrofiltal alene er ikke en præcis indikator for immunstatus 3.. Selv om mere vanskelige at måle, har neutrofil funktionel kompetence blevet foreslået som mere værdifulde i en bred vifte af forhold.
t "> vigtigt, mange af de neutrofile defekter er forbigående og ikke udløst af permanente genetiske defekter, en skelnen, der er i høj grad overset i klinikken indtil for nylig. I forbindelse med forbrændinger, kan neutrofilmigration overvåges i løbet af en patients behandling som en indikator for inflammatorisk tilstand eller infektion 3.. Traditionelle migration assays i øjeblikket anvendes i laboratoriet (Boydenkammer, Dunn kammer, mikropipette assay) ikke kan oversættes til en klinisk indstilling, fordi de kræver store mængder af blod og besværlig tidskrævende neutrofil isoleringsteknikker (tabel 1). Disse assays kan heller ikke anvendes til at overvåge kortvarige ændringer i neutrofil kemotaksi i små laboratoriedyr, såsom mus, da den mængde af blod, der er nødvendige for neutrofil isolation giver kun mulighed for en prøve og ofte endog kræver en samling af blod fra flere dyr for en enkelt assay. For eksempel kan en undersøgelse, hvori multiple vilkår og behandlinger over flere tidspunkter potentielt kunne kræve tusindvis af mus med de nuværende chemotaxis assays. Dette begrænser den biologisk grundforskning, der kan gøres for at forstå den komplekse dynamik i immun funktion i forbindelse med skade, infektion eller brænde ofte undersøgt i murine modeller 5.For at imødekomme behovet for en neutrofil funktionel analyse, der er hurtig, robust, mens der kræver minimal blodvolumen, har vi udviklet en mikrofluid enhed, der måler neutrofilkemotaksi direkte fra en lille dråbe fuldblod. Det er kendt, at mange faktorer i fuldblod, herunder serum 6 og blodplader 7, påvirker neutrofil funktion. Det er derfor hensigtsmæssigt, at helblodet microfluidic assay minimerer prøve behandling for at opretholde in vivo mikromiljø neutrofil ved måling af variationer i kemotaksi med et in vitro assay 8. Denne fremgangsmådereducerer den tid fra blodprøvetagning til neutrofilmigration analyser fra timer ved hjælp af traditionelle teknikker til få minutter (tabel 1). Helblodet microfluidic platform producerer en stabil lineær kemoattraktant gradient for længden af eksperimentet har ingen bevægelige dele og ikke kræver en ekstern trykkilde (dvs. sprøjtepumpe). Det centrale element i udformningen af helblodet mikrofluid enhed er inkorporeringen af røde blodlegemer (RBC) filtrering kam, der mekanisk filtrerer RBC'er fra ind migration kanal af anordningen. De rigtige drejninger af denne filtrering kam forebygge behovet for størrelse udelukkelse filtrering, hvilket sandsynligvis ville blive tilstoppet af RBC og dermed blokere chemoattractant gradient fra at nå de aktivt migrerende neutrofiler i WB. Indlemmelsen af fuldblod mikrofluid enhed i en 12 eller 24-brønds plade letter screening af flere mediatorer af human eller murin neutrofilkemotaksi siog traf samtidig beslutning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Mikrofluid Device Fabrication
- Brug standard fotolitografisk teknikker fabrikere master mug wafer i en klasse 1000 rent rum. Mønster den første 3-um-tynde epoxy-baserede negativ fotoresistlag at definere indvandringsveje i henhold til anvisningerne fra producenten. Mønster den anden 50-um tykt lag at definere celle-loading og chemokin kamre.
- Brug det mønstrede wafer at kaste polydimethylsiloxan (PDMS) enheder. Energisk blande PDMS (20 g) med initiator (2 g) i 5 min at bruge plast gaffel i store plastik vejer bakke.
- Hæld forsigtigt PDMS på mug.
- Afgasse PDMS ved at placere formen med hældes PDMS i vakuum i 1 time.
- Bage og helbrede PDMS mikrofluide anordninger til mindst 3 timer i en ovn indstillet til 65 ° C.
- Punch de centrale WBLCs ved hjælp af en puncher med en spids diameter på 1,5 mm.
- Punch out hele doughnut-formede enheder ved hjælp af en punkteringhende med en spids diameter på 5,0 mm.
- Fjern partikler fra doughnut enheder ved hjælp af tape.
- Skyl en 12-brønds plade med deioniseret vand og derefter tørre med nitrogen. Anbring pladen i 60 ° C varm ovn i 5 min.
- Oxygenplasma behandle 12-brønds plade to gange; gang alene i 35 sek og derefter igen med doughnut udstyr til en anden 35 sek.
- Anbring forsigtigt enheder i brøndene af pladen med en pincet.
- Bage plade med bundne enheder på en varmeplade indstillet til 80 ° C i 10 min.
2.. Mikrofluid Assay Fremstilling
- Prime mikrofluidenheder umiddelbart efter ilt plasma behandling, når enheden er hydrofil og kapillære effekter kan fremme priming af de små kanaler i enheden.
- Opret chemoattractant løsning ved at blande 5 ul fMLP [stamopløsning 10 uM] med 5 pi fibronektin [stamopløsning 1 mg / ml] og 490 pi HBSS.
- Langsomt pipette & #160; kemoattraktant opløsning ind WBLC ved hjælp af en gel loading spids (fig. 1A). Pipette yderligere 20 ul af kemoattraktant omkring ydersiden af enheden.
- Placer pladen i en ekssikkator i 15 min. Ved at anvende et vakuum til enheden, er den løsning, indpodet i side-kanalerne på enheden og den fortrængte luft diffunderer ud gennem PDMS.
- Fjern pladen fra ekssikkator og bekræfte befugtning af enheden kanal under mikroskop. Watch som boble bliver mindre som chemoattractant løsning kommer ind i kammeret. Ingen boble bør være til stede i enheden efter vakuum behandling.
- Vask WBLC og enhedens yderside grundigt for at fjerne overskydende kemoattraktant løsning. Dette trin skaber en gradient af kemoattraktant fra hver af de centrale kemotaktiske kamre (FCC) til enheden centrum.
- Fyld en 1 ml sprøjte med PBS, tilsættes en 30 G stump nål til sprøjten. Forsigtigt stikkes nålen spidsen af sprøjten itil midten af doughnut hul. Skub forsigtigt 100 pi PBS i hullet, således at en dråbe af PBS formularer på toppen af enheden.
- Tilt plade og 1 ml af PBS ved anordning, således at væsken samler på bunden af brønden. Aspirer væsken og gentag processen til alt 3x bruge frisk bufferopløsning (brug medier i stedet for buffer, hvis de adskilte neutrofiler vil blive indlæst i medier) 9..
- Fyld hver brønd med medier, indtil toppen af enhederne er neddykket under væske. Lad enhederne sidde i 15 minutter for at tillade hældning stabiliseres. Eksperimentelle resultater og teoretiske data fra finite element simuleringer viser, at stigninger i disse enheder er stabile op til 24 timer for små molekyler (fx fMLP) og op til en flere dage for større molekylvægt (fx IL8).
- Brug gel Tip til ilægning, langsomt afpipetteres 2 ul blod (eller isolerede neutrofiler) i hver fuldblod loading kammer (WBLC) (figur 1A).
3.. Prøveforberedelse
Humane neutrofiler fra Kapillær Blood
- Saml kapillærblod fra finger pik af sunde frivillige, der er på ingen immunosuppressive. Alle patientprøver blev opnået med skriftligt informeret samtykke, og gennem procedurer, der godkendes af MGH og Shriners Institutional Review Boards.
- For finger pik blodtapning, vaske hænder med vand og sæbe og tør hud. Forbered anti-coagulant/stain stamopløsning ved at tilsætte 1 ml HBSS + 0,2% HSA og 10 pi Hoechst farvning (32,4 uM) til heparin blodopsamlingsrør (1,65 USP/50 ul blod). Prik fingeren ved hjælp af en SurgiLance Sikkerhedslancetten (2,2 mm dybde, 22 G), tørre første bloddråbe og indsamle 50 ul blod i Eppendorf rør indeholdende bestanden antikoagulerende og Hoechst fluorescerende pletten opløsning (10 ul) og forsigtigt blandes.
Humane neutrofiler fra veneblod
- Tegn 10 ml perifert, venøst blod i rør indeholdende 33 USP heparin.
- Der tilsættes 50 ul af veneblod medier og Hoechst plet som tidligere beskrevet. Inkuber blodet og Hoechst pletten til 10 min for at tillade kernen fluorescerende farvning. Kør prøven inden for 1 time af blodprøvetagning.
Neutrofil Adskillelse fra fuldblod - Positiv kontrol
- For at adskille neutrofiler, brug af sterile teknikker til at isolere neutrofiler fra 10 ml venøst fuldblod prøve under anvendelse Hetastarch (6% w / v) densitetsgradient efterfulgt af en negativ selektion magnetisk perle isolationskit efter producentens protokol.
- Resuspenderet den endelige portion af neutrofiler ved en concentrning på 4.000 celler / gl i 1X HBSS + 0,2% humant serumalbumin. Hold celler ved 37 ° C, indtil klar til at køre eksperimentet.
4.. Mikroskopi og Image Analyse for neutrofilkemotaksi Målinger
- Opsætning biochamber temperatur til 37 ° C, luftfugtighed på 80% og CO 2 til 5%.
- Begynd billeddannelse straks med time-lapse imaging på et mikroskop (10X eller højere forstørrelse).
5.. Statistisk analyse
- Manuelt spore mindst 50 neutrofile i hver prøve.
- Tæl cellerne ind i FCC over tid (figur 2).
- Beregn neutrofile hastigheder i kanalen mellem WBLC og FCC hjælp ImageJ (NIH) (figur 2).
- Kvantificere retningen af neutrofiler ved at tælle antallet af celler, der passerer forgreningen og beregne forholdet mellem antallet af celler, der vender mod FCC og celler, der exit the enhed. Celler, der ikke retningsbestemt ikke følger kemotaktiske gradient og derfor vandrer i lige antal mod FCC og exit kanal (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Helblodet (WB) neutrofil kemotaksi assay blev valideret ved at måle ophobningen af neutrofiler i retning af en fMLP gradient (Film S1). Resultaterne bekræfter, at RBC er fanget ved filtrering kam mens neutrofiler (blå) er i stand til aktivt at migrere ud af fuldblod (figur 3A og Movie S1). Den stabile lineære kemoattraktant gradient (grøn) er dannet af fuldblod mikrofluid enhed blev bekræftet under anvendelse af FITC-mærket dextran (figur 3A indsat) og målte niveauer af fluorescens over tid. De produceres i disse enheder gradienter var stabile op til 24 timer for små molekyler og op til en uge for større molekylvægt. Effektiviteten af vask protokol blev verificeret ved billeddannelse lokaliseret fluorescerende signal i FCC uden signal i WBLC eller omkring enheden. De enheder blev siden ansat til at vurdere forskellene i neutrofilmigration fra forskellige blOOD kilder.
Resultater opnået ved hjælp af den nye WB chemotaxis platform afslører, at neutrofiler fra en finger pik dråbe WB, fra venøs WB, eller isoleres fra veneblod migrere med ensartet hastighed (20 ± 2 mm / min, blå linje) og med lignende totale vandrende celler ( 38 ± 10 celler / HR, skraverede søjler) fra alle blod kilder (figur 3B). Vi var også i stand til at kvantificere retningen eller evnen af neutrofil korrekt følge den kemotaktiske gradient. Forgreningen inkorporeret i udformningen af fuldblod enheden tilladt os at kvantificere neutrofiler, der migrerede retningsbestemt langs kemoattraktant gradient mod FCC sammenlignet med neutrofiler, der migrerede tilfældigt under kemokinese og forladt enheden. Neutrofiler migrerer fra alle tre blod kilder migreret med en retningsbestemthed indeks på 0,9 (9 celler mod FCC for hver celle, der forladt enheden).
Fig. 1. Skematisk doughnut-formet enhed. A) chemoattractant er spædet ind i apparatet og en gradient dannes langs migration kanal mod de centrale chemotaxis kamre (FCC). Seksten FCC omgiver hver WBLC. Efter vask kun kemoattraktant forbliver i FCC, og en lineær gradient dannet langs overgangen kanal. De røde blodlegemer (RBC) filtrering kam forhindrer RBC'er tilstoppe kanalen og blokerer neutrofil aktiv migration. Se Movie S1. B) Neutrophils migrere aktivt ud af fuldblod og ophobes i FCC, og deres hastighed, retningsbestemmelse og tal kan præcist tal på. Klik her for at se et større version af denne figur.
Figur 2.. Skematisk og overblik over celletælling ordning for WB-enhed. Neutrofiler aktivt migrere ud af 2 pi helblod (WB) indlæses i fuldblod ladekammeret (WBLC) forbi røde blodlegemer filtrering kam og ind i indgangen til apparatet. Direktionalitet af cellen måles på grundlag af cellens beslutning på forgreningen. Retningsbestemte neutrofiler vil følge kemotaktiske gradient fører mod de centrale chemotaxis kammer og ikke-retningsbestemte celler vil ikke følge gradient og vil tilfældigt migrere enten mod exit kanal eller FCC med en ligelig fordeling. Endelig celletal beregnes på hvert tidspunkt ved tælling af celler i FCC.files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 3. Måling neutrofilkemotaksi fra en dråbe fuldblod (WB). A) WB (1 ul) er indlæst i fuldblod ladekammeret (WBLC). Neutrofiler (blå) trækker langs fMLP kemotaktiske gradient dannet i migration kanal mod FCC. B) Neutrophils fra en finger pik dråbe WB, fra venøs WB, eller isoleres fra veneblod migrere med konsekvent numre (barer) og hastighed (blå linje). Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Sammenligning af protokoller for neutrofil kemotaksi ved hjælp af fuldblod microfluidic platform kontra en sidekanal mikrofluid enhed og den traditionelle Boydenkammer. Mængden af tid og reagenser til at gennemføre hver protokol trin sammenlignes mellem forskellige metoder til at måle neutrofil kemotaksi. Den fuldblod microfluidic platform reducerer den samlede tid, der kræves for at køre analysen med 95%, og den nødvendige mængde blod> 99%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde har vi udviklet en mikrofluid platform til at måle neutrofil kemotaksi fra en dråbe blod (2 ul). The on-chip mekanisk filtrering af RBC'er fra aktivt migrerende neutrofiler omgår behovet for besværlige celle separationsmetoder såsom massefylde gradienter 10 positiv udvælgelse 11 eller negativ selektion 12, som er tilbøjelige til at indføre artefakter ved at aktivere neutrofiler. Den mekaniske filtrering af RBC adskiller vores teknologi fra andre mikrofluid chips til sondering neutrofilmigration. For eksempel tidligere værker fra vores laboratorium 13 og Beebe et al. 8 udnyttede selectiner på chippen, for at adskille neutrofiler fra prøven af helblod forud for kemotaxi-assay. Efter separation på selectin overflader neutrofilmigration forekom i bufferopløsning. Under disse betingelser blev nogen virkning af serum på neutrofilkemotaksi fjernet. Desuden er selectiner kendtat aktivere de celler, ved at engagere specifikke receptorer, og derfor kan ændre in vitro chemotaxis målinger. Den mekaniske adskillelse fra RBC filtrering kam i vores enhed ikke ændre tilstand af neutrofiler målt ved vores enhed. Vores enhed letter robuste målinger af hastighed og celleakkumulering nummer samt celle retningsbestemmelse.
I denne undersøgelse har vi vist, at neutrofiler fra raske frivillige migrerer fra kapillært fuldblod, en dråbe af venøse blod, og adskilt fra veneblod migrere med lignende hastighed og retningsbestemmelse 14. Målingen af neutrofile retningsvirkning er vigtig i inflammatoriske tilstande, såsom brandsår 3, 15 og traumer 16, hvor retningsvirkning er kendt for at være svækket. Nedsat og over stimuleret neutrofiler migrere væk fra skadestedet og potentielt forårsage skade sundt væv. En begrænsning af anordningen foreliggendeed i dette papir er, at celle berigelse på enheden er ikke muligt, og derfor celletal er afhængige af den andel, som de findes i det native fuldblod. Dette kan give problemer i at overtage chemotaxis målinger fra et betydeligt antal celler i forhold såsom neutropeni, hvor neutrofiltallet er lav. Et andet potentielt problem i vores enhed er den steriske hindring af migrerende celler ved RBC eller andre celler migrerer samtidigt. I vores eksperimenter, kan neutrofile presse forbi RBC fanget i svingene i RBC filtrering kam uden at ændre deres migration hastighed. Desuden er yderst vigtigt at inducere cellemigrering kemoattraktanten koncentration og styrke. Du kan foretage fejlfinding analysen med andre betingelser, kan det være vigtigt at køre dosis-respons kurver med varierende størrelser af chemoattractant. Håndtering og forarbejdning mere ustabile kemoattraktanter såsom lipidmediatorer er også afgørende, så det er vigtigt at prime enhederumiddelbart før WB belastning. Endelig er det også vigtigt, at hele blodet ikke koagulere før priming WB enheden. Hvis det ikke er muligt at køre analysen umiddelbart efter blodtapning blod skal opbevares på en rocker i heparin. Læsning af prøven skal ske langsomt, med forsigtighed, da ikke at indføre for stort tryk i WB-enheden.
I fremtiden kan vores enhed bruges til at måle forstyrrelser i neutrofil funktion eller brænder traumepatienter uden at fjerne neutrofile fra patientens native serum, som sandsynligvis spiller en central rolle i neutrofil dysfunktion 17. Denne enhed kan også bruges i fremtiden til at screene potentielle pro-opløsning terapi for at genoprette normal neutrofil funktion hos disse patienter. Endelig kan denne enhed yderligere manipuleret til at måle kemotaksi fra andre vandrende celler, såsom monocytter, makrofager og T-celler.
Afslutningsvis har vi udviklet en novel Fremgangsmåde til at måle neutrofil kemotaxi direkte fra en dråbe fuldblod. Indlemmelsen af fuldblod mikrofluid enhed i en 12 eller 24-brønds plade letter screening af flere betingelser samtidig. Denne enhed vil lette udviklingen af mediatorer af inflammation opløsning til behandling af forbrændinger og andre betændelsestilstande. I fremtiden vil denne enhed anvendes til at måle forstyrrelser i neutrofilkemotaktisk funktion over tid i patientprøver og musemodeller, hvor prøvevolumen er begrænset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen interessekonflikter til at videregive.
Acknowledgments
Støtte fra National Institutes of Health (tilskud GM092804, DE019938) og Shriners Burns Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device Fabrication | |||
| SU-8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30 G ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon - Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters | Chroma - Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels | Qimaging - Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C | |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C.
- Phillipson, M., Kubes, P.
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
