Summary
הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.
Abstract
רגישות של cyclase adenylyl איתות (AC) הייתה מעורבת במגוון רחב של הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, כולל שימוש בסמים ומחלת פרקינסון. הפעלה חריפה של / קולטנים צמודים o Gαi מעכבת את פעילות AC, ואילו הפעלה מתמשכת של תוצאות קולטנים אלה ברגישות Heterologous של AC ורמות מוגברות של cAMP התוך התאי. שמחקרים קודמים הוכיחו כי שיפור זה של היענות AC הוא ציין הן במבחנה in vivo לאחר ההפעלה הכרונית של מספר סוגים של קולטנים / צמוד o Gαi כולל D 2 דופאמין וμ קולטני אופיואידים. למרות רגישות Heterologous של AC דווחה לראשונה לפני כארבעה עשורים, המנגנון (ים) העומד בבסיס תופעה זו אינו ידוע ברוב. המחסור בנתונים מכניסטית ככל הנראה משקפים את המורכבות כרוכות בתגובה מסתגלת זה, טוען כי גישות nonbiased יכולים לסייע בזיהויing המסלולים המולקולריים מעורבים ברגישות Heterologous של AC. מחקרים קודמים מעורבים קינאז ואיתות Gbγ כחופפים מרכיבים המווסתים את רגישות Heterologous של AC. כדי לזהות מטרות חופפות וייחודיות נוספות הקשורות לרגישות של AC, הפיתוח והאימות של assay רגישות cAMP מדרגי נדרש לתפוקה גדולה יותר. גישות קודמות כדי ללמוד רגישות הן בדרך כלל מסורבלות מעורבת תחזוקה רציפה תא תרבות, כמו גם במתודולוגיה מורכבת למדידת צבירת cAMP שכוללת שלבי שטיפה מרובים. לכן, הפיתוח של assay מבוסס תאים חזק שיכול לשמש עבור הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) בפורמט גם 384 יקל מחקרים עתידיים. שימוש בשני דגמי D 2 קולטן דופמין סלולריים (כלומר. CHO-D 2L וHEK-AC6 / D 2L), יש לנו להמיר assay שלנו 48 היטב הרגישות (> 20 צעדים 4-5 ימים) ולחמש-sTEP, assay יום אחד בפורמט 384 גם. התבנית חדשה זו ניתנת להקרנת מולקולה קטנה, ואנו מראים כי עיצוב assay זה יכול גם לשמש בקלות עבור transfection ההפוך של siRNA בציפייה להקרנת ספריית siRNA ממוקד.
Introduction
Cyclase adenylyl אדפטיבית (AC) איתות תגובה המכונה Heterologous או סופר רגישות התגלה לראשונה במעבדתו של חתן פרס נובל, ד"ר מרשל נירנברג. ד"ר נירנברג הציעה שנצפתה היענות AC עלתה בעקבות הפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים הייתה מנגנון המעורב בסובלנות אופיום ותלות 1. בנוסף להפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים, תגובת neuroadaptive זה של איתות AC מתרחשת גם לאחר הפעלה מתמשכת של כמה קולטנים אחרים Gαi / מצמידים o 2. יש לציין, רבים של קולטנים אלה קשורים לכאב, הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, וכוללים אופיואידים μ / κ, D דופמין 2/4, 5HT 1A, ו-M 2/4 קולטנים מוסקריניים 2. בנוסף לממצאיו של ד"ר נירנברג, גוף גדול של ראיות המקשר רגישות של איתות AC להפעלת קולט אופיואידים כרונית שני
מחקרים אלה מספקים רציונל לבחינת המנגנונים לרגישות של cyclase adenylyl כיעד הנוירוביולוגי חשוב. כמו כן, את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של AC איתות 8 ואת החשיבות שisoforms AC הבודד להחזיק בתגובה מסתגלת זה צריכים גם להיות מוכר 2,9,10. בהקשר של המחקר שלנו, את התכונות הכלליות הקשורים לרגישות Heterologous של isoforms רקומביננטי של AC במקביל מאפיינים אלה described ללימוד isoforms אנדוגני של AC. באופן ספציפי, המחקרים קודמים מצאו כי ההפעלה של חלבוני Gαi / o ויחידות מהשנה שלאחר מכן שחרור / βγ התארגנות הן דרישות חשובות לרגישות הקולטן המושרית של כל isoforms AC. בנוסף, מספר מחקרים מצביעים על כך שהאיתות מקינאז החלבון ויחידות משנת Gβγ מעורבות ברגישות 2,11-13. מזגנים בודדים גם להציג דפוסי רגישות ייחודיים ומובחנים 12. לדוגמא, חשיפה מתמשכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים קשורה לרגישות של AC1 וAC8 Ca 2 גירוי + / calmodulin 14,15, ואילו AC3 הקשור קשר הדוק לא רגיש 2. AC2, AC4, וAC7 קשור באופן הדוק, עם זאת, רק פעילות AC2 PKC מגורה היא רגישה וחסונה לאחר חשיפה ממושכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים 7,14,16,17. בנוסף, AC5 וAC6 להראות מידה ניכרת של יתר מכירהרגישות ologous לגז וצבירת cAMP מגורה forskolin הבא הפעלה של D 2 קולטנים 14,18-20, אבל נראה שונים בדרישה שלהם לGβγ מקטע-AC קשרי גומלין ש21. למרות שרוב המחקרים של רגישות AC השתמשו קווי מודל תא (לדוגמא תאי HEK293 להביע isoforms AC הבודד), נראה כי ממצאים אלה לתרגם למודלי תא עצביים מקומיים 4,22. לאחרונה, את ההשפעות של מעכבי איזופורם AC סלקטיבית מולקולה קטנות שזוהו בתאי HEK293 להביע isoforms AC יכולות גם להיות מתורגמות למחקרים התנהגותיים in vivo 23.
חוסר מנגנון מולקולרי שזוהה ולרגישות Heterologous כנראה משקף את המורכבות של התגובה המסתגלת, כמו גם מאפייני רגולציה הייחודיים של הפרט AC isoforms 12. להתיר מורכבות כזה מסתבך עוד יותר על ידי השימוש במתודולוגיה לא מסורבליםכובע הגביל חוקרים אקדמיים מהעסקת גישות משוחדת. לדוגמא, המחקרים מכניסטית הקודמים שלנו כללו שימוש במודלים סלולריים ברציפות תרבותי באמצעות 24 - ופורמט תרבית רקמת 48 היטב 15. תאים בתרבית גדלו בדרך כלל עבור 48 שעות ולאחר מכן נתון לטיפול אגוניסט תרופה (2-18 hr) ואחריו סדרה של שוטף התא וincubations (איור 1). פרוטוקולי הצטברות cAMP הספציפי AC-איזופורם היו אז מועסקים ואחרי מדידה של הצטברות cAMP באמצעות [3 H] מפרך וזמן רב cAMP מחייב מתודולוגיה 15,24. המשך מהתחלה ועד סוף לכל assay נדרש בדרך כלל כולל של ארבעה עד חמישה ימים מציפוי תא לניתוח נתונים (איור 1). היישום של טכנולוגיות ואוטומציה חדשות הוביל לשיפורים ניכר ללימודי רגישות בסביבה התעשייתית ומרכז HTS. לדוגמא, קבוצה עובדת עם המרכז הלאומי לחמיםקאל ג'נומיקס דיווח יומיים HTS הליך assay לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של μ רגישות מושרה אופיואידים הקולטן בפורמט 1,536 היטב 25.
המאמר הנוכחי מתאר את המאמצים שלנו כדי לפתח assay HTS ללימודים של רגישות Heterologous תוך שימוש בטכנולוגיות שזמינות ברוב מוסדות מחקר האקדמיים. אסטרטגיה זו הושגה על ידי שילוב של השימוש בתאי cryopreserved ממודלי תא heterologously מבטא את קולטן דופמין D 2 בשילוב עם isoforms cyclase adenylyl רקומביננטי אנדוגני או אדם (CHO-D 2L או HEK-AC6 / D 2 ליטר). כדי לשפר את התפוקה שלנו, אנחנו מחדש assay שלנו 48 גם הרגישות (בערך> 20 צעדים על 4-5 ימים) לחמישה שלבים assay יום אחד, בפורמט 384 גם שהיה למעשה "לערבב ולקרוא". הפורמט החדש משתמש בקרינת זמן הומוגני זמינה מסחרי נפתרה assay (HTRF) כדי למדוד ACC cAMPumulation בתאים שלמים עם קורא צלחת מצב מרובה. Assay הוא איתן וניתן להקרנת מולקולה קטנה, ויכול להיות מיושם בצורה יעילה למסך למעכבים של רגישות Heterologous. בנוסף, אנו מספקים מידע שמאפשר השימוש של assay זה עם transfection ההפוך של siRNA להקרנת ספריית siRNA רחבה ממוקדת או הגנום עם שינוי קל בלבד לגישה הכללית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התרחבות וCryopreservation של תאי Assay מוכנים
- תרבות CHO-K1-DRD 2L תאים (CHO-D 2L) על צלחת 15 סנטימטר 2 תא תרבות בתקשורת F12 של שינקין בתוספת 1.0 מיקרומטר L-גלוטמין, 800 G418 מיקרוגרם / μl, 300 מיקרוגרם / hygromycin μl, 100 u / μl פניצילין, 100 מיקרוגרם / μl סטרפטומיצין, ו10% בסרום שור העובר (FBS).
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 עד לתאים ומחוברות 90-95%. לשטוף את התאים עם 10 μl בופר פוספט (PBS), ולאסוף את התאים על ידי הוספת 3 μl של חיץ התא דיסוציאציה במשך 5 דקות ב37 ° C. Resuspend התאים באמצעות 12 μl של התקשורת והתרבות ולספור תאים באמצעות הרחקת trypan כחולה.
- צנטריפוגה ההשעיה תא XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 5 של תקשורת הקפאה (10% sulfoxide דימתיל, 90% FBS). לדלל את ההשעיה התא כדי להשיג את הריכוז הרצוי של התאים (לדוגמא: 1-20 x 10 6 תאים / μl).
- μl 1.0 aliquot של פתרון תא לכל cryovial. דגירה cryovials במכל הקפאת תא ב -80 ° C במשך הלילה. העבר את cryovials לN 2 מיכל נוזל לאחסון ארוך טווח.
2. תאי ציפוי Assay מוכנים (ואופציה ההפוך Transfection)
- במהירות להפשיר cryovial קפוא של תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ברגע שתאים מופשרים, להעביר את תאי צינור חרוטי 15 μl מכיל 9 μl של Opti-ממ, ומערבבים על ידי צינור היפוך 3-5x.
- צנטריפוגה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend התאים ב1 μl Opti-ממ.
- ספירת התאים באמצעות הרחקת trypan הכחולה כדי לקבוע כדאיות תא ולדלל את תאי קיימא במידת צורך (למשל. 3 x 10 5 תאים / ריכוז μl) בOpti-ממ. צלחת 10 μl / טוב של תאים בתרבית רקמה שטופלה צלחת 384 גם בעזרת פיפטה רבה.
- הפוך דילולים סדרתי של המחנה בOpti-ממ כדי ליצור עקומה סטנדרטית להערכת ייצור cAMP על ידי התאים (לפי מייצר המלצות - ראה סעיף 7). הוסף 10 μl / טוב של הסטנדרטים cAMP לצלחת הערה:. עקומת סטנדרט אחד יכולה להיות מוכנה על צלחת נפרדת או בארות ריקות באחת מצלחות assay.
- צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 למשך שעה 1.
3. הפוך אפשרות transfection siRNA *
סעיף זה הוא אופציונלי ורלוונטי לאיור 3.
- הכן פתרון של siRNA ב DDH RNase ללא 2 O (0.4 pmol / μl לדוגמא). הוסף 5 μl לבארות בודדות של צלחת 384 גם, ו צנטריפוגות הצלחת ב100 XG 15 seג בטמפרטורת חדר.
- לדלל Lipofectamine 2000 בOpti-ממ בפקטור של 0.006 (למשל להוסיף 6 μl של Lipofectamine 2000 ל1,000 μl של Opti-ממ), ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- דגירה פתרון Lipofectamine 2000/Opti-MEM במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף 5 μl של פתרון Lipofectamine 2000/Opti-MEM המדולל לבארות בודדות של צלחת 384 גם שכבר מכיל siRNA. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר.
- דגירה את הצלחת ל30 דקות בטמפרטורת חדר.
- תאים מוכנים assay הצלחת כפי שתואר לעיל (סעיף 2). צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר.
- חזור צלחת assay לחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) ל48-96 שעה כפי שנקבע לגן ממוקד להפיל (ראו דיון).
4. הקרנת מולקולה קטנה
- לדלל את התרופה של עניין (מעכבים למשל. מולקולה קטנה) בOpti-ממ ל6x הריכוזים הסופיים הרצויים. דילולים סידוריים ניתן להשלים באמצעות טפטפות כף יד או תחנת טיפול נוזלית.
- הוסף 2.5 μl / טוב של מתחם הבדיקה או מאגר המכיל רכב (למשל DMSO) לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה.
- צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר (דגירה היא אופציונלית).
5. מתמשך אגוניסט טיפול
- הכן 600 ננומטר (כלומר. 6 פעמים הריכוז הסופי הרצוי של 100 ננומטר) פתרון של quinpirole בOpti-ממ.
- הוסף 2.5 μl / טוב של פתרון quinpirole ננומטר 600 לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה.
- צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 למשך 2 שעות.
6. גירוי של cAMP צבירה
- במהלך הדגירה 2 שעות, להכין stimulatiעל פתרון בOpti-ממ. פתרון הגירוי מורכב מ40 forskolin מיקרומטר, 2 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), ו -4 spiperone מיקרומטר (כל הריכוזים בשלב 6 הם 4x הריכוז הסופי הרצוי).
- הוספת μl 5 / היטב פתרון הגירוי לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה.
- צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
7. מרווה והערכת cAMP הצבירה
- ייצור של cAMP בתאים נמדד באמצעות 2 הערכה הדינמית cAMP על פי הוראות יצרן. בקצרה, מחדש אנטי cAMP-cryptate וcAMP-D2 במים מזוקקים. להקפיא aliquots ב -20 ° C עבור אחסון לטווח קצר.
- מדולל aliquot אחד נגד cAMP-cryptate וaliquot אחד בנפרד cAMP-D2 במאגר תמוגה על פי הוראות היצרן כדי להפוך את הפתרונות עובדים.
- dd 10 μl / טוב של הפתרון עובד נגד cAMP-cryptate ו10 μl / טוב של הפתרון עובד cAMP-D2 לצלחת 384 גם בעזרת פיפטה רבה.
- צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
- קראו את הצלחת בקורא צלחת פלואורסצנטי (הגדרת קנה מידה אוטומטית לרגישות) באמצעות עירור של 337 ננומטר, ולמדוד את הפליטות ב620 ננומטר ו665 ננומטר למייצר הוראות.
- החל ניתוח ratiometric להעריך עקומת סטנדרט cAMP למייצרת הוראות. שימוש בערכים שהתקבלו, להסיק את הצטברות cAMP המוערכת בבארות הבדיקה באמצעות תוכנה לניתוח נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חלק א פיתוח assay רגישות גם Heterologous 384 לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים תוך שימוש במודל סלולרי זמין באופן מסחרי.
ללמוד רגישות Heterologous במודל תא, עשינו מספר השיפורים שאפשרו לנו לייעל את assay לפורמט "לערבב ולקרוא". כמה מהשינויים המרכזיים מודגשים בהמשך, והם מתוארים בפירוט רב יותר בדיון. צעד המפתח הראשון היה שינוי תרבית התאים שלנו מהתאים ברציפות בתרבית תאי cryopreserved 26. אנחנו עכשיו באופן שגרתי קבוצות תרבות של תאים שניתן cryopreserved בריכוזים בין 1-20 x 10 6 תאים / μl. לכל assay בהתאמה, מניות תא מופשרים, בדילול מלא, נספרו, ולאחר מכן מצופה באופן ישיר ב384 גם צלחות. ביטול הצורך של תקופת תרבות והגדלת הנוחות של assay. הפורמט של assay הרגישות הקודם שלנו מנוצל Tiss 48 היטבצלחות תרבות UE, ומעורבים מספר לשטוף, למזוג, צעדי העברה, ומחנה המבוסס על סינון [3 H] מחייב assay (איור 1). לפיכך, בפורמט זה ולרגישות שלא היה נוח ליישומי תפוקה גבוהה. לכן, אנו הפעילו מאמצים משמעותיים על מנת לייעל את assay ראשון 96 היטב ולאחר מכן פורמט 384 גם amendable להקרנת תפוקה גבוהה. חיסול אופטימיזציה המעורב של צעדים לשטוף והערכה של סוגים שונים של צלחות התרבות / assay, צפיפות תאים שונה, ותקופות דגירה שונות. אנחנו גם בחנו כמה שיטות לגילוי מחנה ומצאנו כי טכנולוגית cAMP HTRF המאופיינת היטב בשימוש בפרוטוקול הנוכחי הייתה לשעתקו מאוד, אמינה, ויציבה מאוד. פלטפורמת assay זה מבוססת על immunocompetition בין המחנה המיוצר על ידי התאים ושכותרתו cAMP (כלומר. cAMP-D2) המסופק על ידי הערכה. עכשיו יש לנו פיתחנו בהצלחה וליישם פרוטוקולים לsensit Heterologousנפלתי על קרקע פורה ב384 גם בפורמט שהם בעצם "לערבב ולקרוא" (איור פנל ימני 1).
המטרה הראשונית שלנו הייתה ליצור assay רגישות הקולטן תפוקה גבוהה D 2L שימוש בתאי CHO-D 2L זמינים מסחרי (DRD 2L אדם, מספר הצטרפות: NM_000795) שאופן אנדוגני להביע AC6 ו27 AC7. תאי CHO-D 2L cryopreserved היו מצופים ב3,000 תאים / גם בצלחת תרבית רקמה 384 גם, והיו equilibrated עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified. הצלחות הוצאו מהחממה והריכוז גדל והולך של אגוניסט D 2 quinpirole נוספו בטמפרטורת חדר. התאים ולאחר מכן הודגרו במשך שעה 2 ב37 מעלות צלזיוס בחממה humidified. הצטברות AMP המחזורית הייתה לאחר מכן יזם על ידי התוספת של forskolin 10 מיקרומטר (activator ישיר של AC). חיץ הצטברות cAMP מכיל מעכבי phosphodiesterase, isobutylmethylxanthine (IBMX), כמו גם את יריב D 2, spiperone (1 מיקרומטר, K i עבור D, 2L = 0.07 ננומטר), על מנת למנוע הפעלת קולט שיורי D 2 במהלך תקופת צבירת cAMP. התאים הודגרו בטמפרטורת חדר במשך שעה 1. Assay הופסק על ידי התוספת של מאגר תמוגה המכיל חומרים כימיים cAMP HTRF. המחקרים גילו כי טיפול מקדים 2 שעות עם quinpirole משופר הצטברות cAMP הבאה מגורה forskolin באופן תלוי מינון עולה בקנה אחד עם רגישות Heterologous (איור 2 א). התוצאות של ניסוי זה מראים כי ניתן לבצע מבחני רגישות בפורמט 384 גם. פורמט assay החדש הפחית את מספר הצעדים של יותר מ 20-4 צעדים ללא הצורך בצעדים לשטוף או למזוג מה שהופך את "לערבב ולקרוא" assay (איור 1).
הסדרה השנייה של ניסויים בחנה אם assay החדש ומשופר שזה יכול להיות מנוצל כדימעכבי ssess של רגישות במודל CHO-D 2L. תאי L cryopreserved CHO-D 2 היו מצופים בצלחת תרבות 384 גם רקמה בצפיפות של 3,000 תאים / גם בOpti-ממ. D 2 יריבים ידועים נוספו לחסום D 2 רגישות-Induced הקולטן. Opti-ממ מכיל 100 quinpirole ננומטר (ריכוז סופי) נוספו לאחר מכן להיקף כולל של 15 μl, והתאים הודגרו במשך שעה 2 ב37 מעלות צלזיוס בחממה humidified. לאחר הדגירה, הצטברות מחנה הייתה ביוזמת בנוסף הישיר של forskolin (10 מיקרומטר ריכוז סופי), וassay הופסק וcAMP נמדד באמצעות HTRF. התוצאות הראשוניות עולות כי טיפול מקדים עם spiperone או haloperidol (ד 'הטיפוסי 2 יריבים) רגישות מושרה quinpirole מנעה לחלוטין של forskolin מגורה הצטברות cAMP (איור 2). תוצאות אלה מספקות אימות כי גישה זו יכולה להיות מנוצל כדי לזהות קטןמעכבי מולקולה של D 2 רגישות-Induced הקולטן. בניסוי שני, השתמשנו בשיטה זו כדי להעריך את העוצמה של שורה של D 2 יריבים כדי לבדוק אם חומרים אלו מעכבים את הרגישות. בדומה לתוצאות הקודמות, מחקרים אלו הוכיחו כי D 2 יריבים עכבות רגישות מושרה אגוניסט באופן תלוי מינון (איור 2 ג). כדי דרגת העוצמה לעיכוב של רגישות בקנה אחד עם מעשיהם כD 2 יריבים הקולטן ופרמקולוגיה שתוארה קודם לכן בD 2 קולטנים 28.
חלק ב '. יישום של assay רגישות 384 גם עבור transfection ההפוך של siRNA במאמצי הקרנה.
המטרה הבאה שלנו הייתה לפתח assay רגישות 384 גם כי ניתן להשתמש כדי לנהל הקרנת ספריית siRNA transfection ההפוך ניתן להרחבה. מחקרים ראשוניים היובוצע באמצעות מודל תא HEK שheterologously מבטא שני קולטני דופאמין D 2L (עכברוש DRD 2L, מספר הצטרפות: NM_012547) וAC6 (ADCY6 חולדה, מספר הצטרפות: NC_005120) (HEK-AC6 / D 2L כלומר). הניסויים הראשונים העריכו את היכולת להפגין רגישות אגוניסט המושרית של AC בשורת התאים. בקצרה, תאי AC6 / D 2L cryopreserved היו מצופים (1,000 תאים / טוב) בצלחת תרבית רקמת 384 גם. Opti-ממ המכיל quinpirole 1 מיקרומטר (ריכוז סופי) נוספו להיקף כולל של 15 μl, והתאים הודגרו במשך שעה 2 ב37 מעלות צלזיוס בחממה humidified. לאחר הדגירה, הצטברות המחנה הייתה יזם על ידי התוספת של ריכוז גדל והולך של forskolin. Assay הופסק על ידי התוספת של מאגר תמוגה המכיל חומרים כימיים HTRF. התוצאות הראה כי חשיפה של תאים לquinpirole אגוניסט עבור שעה 2 הובילה לשיפור ניכר של Cam-מגורה forskolinהצטברות P (איור 3 א). הצבירה המוגברת של cAMP בשני 100 ננומטר ו300 ננומטר של forskolin הייתה גדול יותר מ15 מתקפלת בהשוואה לתאים שטופלו רכב (איור 3 א).
הבא, השתמשתי פורסם siRNA מתודולוגיות 29,30 כדי להדריך את מאמצי הייעול שלנו שכללו הערכה של תנאים שונים הפוך transfection (למשל ריאגנטים transfection, יעילות transfection, צפיפות תאים, זמן דגירה, וכו '.). מחקרים ראשוניים בשימוש siGloRed, מחוון של transfection, בשילוב עם Lipofectamine 2000 לקבוע תנאי transfection ההפוך אופטימליים. הניסויים הראו כי μl siRNA / 5 2-4 pmol H 2 O בשילוב עם Lipofectamine μl 0.03 2000/5 μl Opti-ממ סיפק כמעט 95% יעילות transfection ב72 שעות ללא כל רעילות נצפות בתאי HEK (מידע לא מוצג). לאחר מכן, אנו בחנו את ההשפעה של Gαs siRNA ברגישות Heterologousשל forskolin מגורה הצטברות cAMP בתאי AC6 / D 2L. הגז siRNA הוצע כביקורת חיובית פוטנציאלית בגלל Gαs זוהה כמרכיב מרכזי של רגישות Heterologous לכמה isoforms AC (כלומר AC1, AC2, AC5, וAC6) 19-21. יתר על כן, את אות רגישות 15 לקפל בAC6 / (איור 3 א) מודל תא D 2L מספקת איתות חזקה לחלון רעש כדי להעריך את היעילות של transfection ההפוך. שימוש בתנאים המתוארים לעיל, אנו סיימנו את הלימודים ראשוניים הערכת Gαs siRNA כביקורת חיובית, והתוצאות שלנו הראו מצור חזק (> 90%) של רגישות (מידע לא מוצג).
ההפחתה-Induced siRNA הדרמטי באות הרגישות מספקת בקרה חיובית מתאימה לתהליך מיון siRNA. כדי לקבל הערכה כמותית יותר להקרנת siRNA של רגישות Heterologous AC, אנחנו שנוצרנו נתונים ביהגורם 'Z חושב לשורה של תנאי בדיקה באמצעות תאי AC6 / D 2L יום 31. לצורך ניסוי זה, אנחנו בשילוב 2 pmol Gαs siRNA, או השליטה הלא מיקוד siRNA, ב5 μl עם 0.03 Lipofectamine μl 2000/5 μl Opti-ממ לכל גם בצלחת 384 גם (נפח כולל 10 μl). תאי cryopreserved היו מופשרים, resuspended בOpti-ממ ולאחר מכן הוסיפו לבארות בודדות המכילות תערובת siRNA / Lipofectamine באמצעות מספר צפיפויות תא (כלומר. 500-5,000 cells/10 μl / טוב). משך טיפול quinpirole (2 לעומת שעות 18 hr), כמו גם את הריכוז הסופי של forskolin (100-300 ננומטר) גם נחקרו בAC6 / assay רגישות D 2L. תוצאות ניסויים אלה גילו כי הגורם "Z חזק הושג בתנאים הבאים: 750 תאים / היטב, משך 72 שעה transfection, טיפול quinpirole שעה 2, ו300 forskolin ננומטר כדי לעורר הצטברות cAMP (איור 3 ב). תחת שיתוף אלהnditions, השגנו תגובת 15 רגישות פי שהופחתה על ידי 94% בנוכחות Gαs siRNA (Z "של 0.6 לGαs siRNA vs. לשלוט siRNA).
איור 1. בפורמט המסורתי, תאים מצופה בפורמט 48 היטב ומבוגר כדי מפגש מעל 48 שעות. תקשורת הצמיחה יצקה, מעכבי מולקולה קטנים הוסיפו, ואחריו תוספת של אגוניסט D 2. לאחר הדגירה 2 שעות, מדיה assay הוא יצק והתאים נחשפים לסדרה של צעדים לשטוף / למזוג. בשלב הבא, AC מגורה ותאי lysed. הצטברות AMP מחזורית אז הוערכה באמצעות assay [3 H] cAMP מחייב שהוא assay 2 יום הדורשים צעד סינון וספירה נצנץ. בעוד elimin הפורמט 96 גםated רבים של הצעדים לשטוף ולמזוג, מצאנו כי פורמט זה לא היה בקלות מקובל HTS או אוטומציה. פורמט HTS משתמש בתאי cryopreserved שהם מצופים ישירות לתוך 384 גם צלחות. תאי cryopreserved אלה הם "assay מוכן" בעקבות איזון 1 שעות. לאחר תקופת דגירה ראשונית זה, ניתן להוסיף מעכבי מולקולה קטנים ואחריו התוספת של D 2 אגוניסט לדגירת שעה 2. AC הוא מגורה, ותאי lysed באמצעות ריאגנטים זיהוי HTRF בצלחת assay.
איור 2. תאי cryopreserved CHO-D 2L היו מצופים ישירות לתוך 384 צלחות גם assay ב3000 תאים / היטב וequilibrated במשך שעה 1. א) ריכוזים הולך וגדל של D 2 אגוניסט, quinpirאולה, נוספו ותאים הודגרו במשך שעה 2 ב37 מעלות צלזיוס בחממה humidified. הצטברות AMP המחזורית הייתה מגורה עם forskolin 10 מיקרומטר (ריכוז סופי) בנוכחות spiperone וIBMX במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. התגובה הייתה רווה באמצעות ריאגנטים assay cAMP HTRF (n = 1, נציג של לפחות 3 ניסויים). הנתונים באים לידי ביטוי כתגובה אחוזים מתאים שטופלו רכב. תאי B.) CHO-D 2L טופלו קודם לכן בהעדר (שליטה) או קיומם של היריבים הצביעו D 2 קולטן (כלומר spiperone או haloperidol). Quinpirole (100 ננומטר) נוספה, והתאים הודגרו במשך שעה 2 כדי לגרום לרגישות. AC היה מגורה עם forskolin 10 מיקרומטר (ריכוז סופי) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. AMP המחזורי נקבע באמצעות HTRF. הנתונים באים לידי ביטוי כתגובה אחוזים מתאים שטופלו רכב.) תאי CHO-D 2L ג טופלו קודם לכן בהעדר (שליטה =100%) או הנוכחות של ריכוז גדל והולך של D 2 יריבים קולט מצויינים. Quinpirole (100 ננומטר) נוספה, והתאים הודגרו במשך שעה 2 כדי לגרום לרגישות. AC היה מגורה עם forskolin 10 מיקרומטר (ריכוז סופי) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. AMP המחזורי נקבע באמצעות HTRF. הנתונים באים לידי ביטוי כאחוז מתגובת הרגישות מושרה quinpirole. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. תאי cryopreserved HEK-AC6 / D 2L היו מצופים ב 1000 תאים / היטב וequilibrated במשך שעה 1. א) תאים הודגרו עם רכב או 100 quinpirole ננומטר במשך שעה 2 בחממה humidified. wa-ACs מגורה עם הגדלת ריכוזים של forskolin במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. AMP המחזורי נקבע באמצעות transfection ההפוך HTRF. ב ') של רגישות בלוקים Gαs siRNA בתאי AC6 / D 2L. Gαs siRNA או שליטת nontargeting siRNA (2 pmol) היה בשילוב עם 0.03 μl Lipofectamine2000 (שאיבה) בהיקף כולל של 10 μl, והפתרון נוסף לבארות בודדות בצלחת 384 גם. AC6 cryopreserved / תאי D 2L נוספו לאחר מכן לtransfection ההפוך וטופחו במשך 70 שעות ב 37 ° C בחממה humidified. אגוניסט קולטן D 2, quinpirole (1 מיקרומטר הסופי), או כלי רכב נוספו ואחריו דגירה שעה 2. הצטברות AMP המחזורית הייתה מגורה עם 300 forskolin ננומטר (ריכוז סופי) עבור שעה 1 ונמדדה באמצעות HTRF. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמץ להקל על מחקרים של רגישות Heterologous, יש לנו בהרחבה שונו השיטה הקודמת שלנו להשגת יעילה "תערובת ולקרוא" פורמט זה הוא amendable להקרנת תפוקה גבוהה ומנגנון של בדיקת פעולה. השינויים העיקריים לפרוטוקול שלנו ניתן לסכם באופן הבא: 1) השימוש בתאי cryopreserved כמו חומרים כימיים "assay-Ready"; 2) המזעור של assay לפורמט 384 גם: 3) הניצול של מדידת HTRF של cAMP.
האימוץ של שימור בהקפאה למבחני תא מבוסס שלנו השתפר מאוד את יעילות ואת שחזור ליום שלנו לניסויי יום ומאמצי הקרנה. גישה זו היא סטנדרט בתעשייה, והוא יכול להיות מתורגם בקלות למחקר האקדמי הגדרת 26. כדי לשפר את יעילות תא תרבות, בקבוקונים של תאים המשמשים כ" את ריאגנטים המדף "שבמניות התא מופשרים, בדילול מלא, ולאחר מכן מצופה באופן ישיר בצלחות 384 גם עבורr כל assay. אנחנו שולבו בעבר תאי cryopreserved במחקרים שמטרתם זיהוי יריבים של קולטנים בשילוב חלבון G חסר חוליות 32,33. מתודולוגיה זו הייתה יתרון שבעבודה הראשונית לא בוצעה במעבדה שלנו וחייבה העברת תאים בתרבית ברחבי קמפוס שבו הוצגו אתגרים וסביר להניח שהציגו את ההשתנות. ניצול הגישה החדשה שלנו, תאים קפואים כעת ניתן להפשיר באופן מיידי ובדילול מלא באתר לפני תחילתו של assay. בנוסף לשיפור שחזור, שימור בהקפאה גם ביטלה את התקופה 48 שעות זמן מציפוי תא לביצוע assay (איור 1). יש לנו ליישם בהצלחה גישת השימור בהקפאה במחקרי transfection יציבים וחולפים תוך שימוש במגוון של קולטנים ותת סוגים של המזגנים רקומביננטי עם קריאות פונקציונליות כוללים הצטברות cAMP וגיוס β-arrestin (Brust, TF, Ejendal, KFK, ווטס, תצפיות לא פורסמו VJ) . DesPite החוויות החיוביות שלנו עד כה, חוקרים צריכים לוודא שמערכת תא מודל קולטן או יעד, והוא תואם את הקפאה לפני ביצוע כל מחקרים בקנה מידה גדולים.
שינוי שני שהיה חשוב למאמצים שלנו כדי לייעל את החיסול המעורב assay הרגישות של למזוג ולשטוף מדרגות (איור 1). שינויים אלה היו במקביל למזעורנו של assay לפורמט 96 היטב (קונלי ווטס, תצפיות לא פורסמו). באופן ספציפי, פרוטוקול רגישות שונה תוכנן בו הצטברות מחנה הייתה ביוזמת בנוסף הישיר של forskolin במאגר assay הבא D 2 דגירה אגוניסט בהיעדר כל צעדים לשטוף או למזוג (ראה איור 1 הפנל באמצע). בנוסף, חיץ הצטברות cAMP הכיל ריכוז גבוה יחסי של spiperone (1 מיקרומטר), אנטגוניסט D 2 שיש לו ערך קי של 0.07 ננומטר עבור D 2קולטני 15. 100 זה לקפל ריכוז עודף של תוצאות spiperone בכיבוש קולט מלא D 2 בשלב הצטברות cAMP, ובכך המונעים הפעלת שיורי D 2 קולטן על ידי אגוניסטים (למשל quinpirole) במהלך forskolin מגורה צעד AC 15. שינוי זה בוטל למזוג שלוש ושלושה צעדים לשטוף הבא הדגירה אגוניסט הראשונית. כחלק מפיתוח הפורמט 96 היטב, היינו גם מסוגל לחסל את הצעד למזוג הסופי לפני מרווה וlysing התאים. שינוי זה הושג על ידי הגדלת הריכוז של מגיב lysing (חומצת trichloroacetic כלומר;. TCA) 3-9% והוספה מגיב ישירות למאגר הצטברות cAMP. התוצאות המבטיחות של assay הרגישות גם 96 שונה סיפקו תמיכה עבור ההמרה של assay הרגישות לפורמט 384 גם. למרבה הצער, המתודולוגיה הקודמת שלנו לכימות מחנה הייתה filtratio מייגעמבוסס n [3 H] assay החלבון המחייב cAMP (> 5 שלבים). לדוגמא, assay בדרך כלל הושלם במהלך יומיים, כדי לאפשר ייבוש מסנן ונצנץ לספור 15,24. חסרונות אלה גרמו חלבון cAMP [3 H] מחייבים מעשי לנצל לפורמט 384 גם תפוקה גבוהה.
פיתוח המפתח השלישי הגיע דרך שילוב של מתודולוגיות למדידה ולכימות cAMP באופן נוח לפורמט 384 גם. לדוגמא, יש לנו ניסיון משמעותי באמצעות אלמנט cAMP Response (CRE) מבוסס-לוציפראז מערכת כתב למדידות cAMP יחסי בפורמט 384 גם 32,33. למרות שהגישה זו נוצלה בעבר בהצלחה על ידי המעבדה שלנו למחקרים רבים של קולטנים בשילוב-Gαs, כתבי CRE לוק כפופים למספר חיובי וגם שליליים כוזבים במהלך מבחני מיון 34. בנוסף, המחקרים שלנו ראשוניים D 2 רגישות עם יישום זההמקק לא היה מעודד בכך שאנו נצפו עיכוב משוב לכאורה של אות לוציפראז (מידע לא מוצג). לכן, אנו מתמקדים המאמצים שלנו על היישום של טכנולוגית GloSensor cAMP על ידי בניית ואפיון קווים יציבים תא באמצעות שני "הראשון" שלהם ווקטורי דור GloSensor "שני". GloSensor הוא כתב בלוציפראז מהונדס המכיל אתר קשירת cAMP בתוך החלבון לוציפראז 35. למרות שהמערכת היא מאוד שימושית עבור כימות cAMP הקינטית, השיטה לא הייתה יעילה למדידת רגישות מושרה אגוניסט (קונלי ווטס, תצפיות לא פורסמו). אנחנו גם בחנו biosensor cAMP ברט מבוסס 36 ללימודים שלנו כאמצעי חסכוני להעריך הצטברות cAMP. למרבה הצער, את רעשי רקע הקשורים biosensor transfected transiently הגבילו את יכולתנו להסתגל בשיטה זו כדי assay הרגישות שלנו. לבסוף, הערכנו כמה ערכות העסקת פלואוריד הזמן נפתר הומוגניתescence (HTRF) כגישה למדידת cAMP בפורמט 384 גם. מצאנו כי המתודולוגיה שנקבעה זה הייתה תואמת ביותר עם מעבדות אקדמיות ומתקני סינון בכך שהם היו חזקים, רגישים, יציבים וקלים לשימוש. החסרון העיקרי לחוקרים אקדמיים הוא העלות של חומרים כימיים, לעומת זאת רכישה בתפזורת של חומרים כימיים ומזעור 384 פורמט גם הופך את המחיר לתחרותי יותר מאשר עם ערכות אחרות, כוללים מבחני מבוססים ELISA והחלבון הקודם שלנו "תוצרת בית" [3 H] cAMP מחייב assay 15.
עבודת הנציג מדגימה את הישימות של assay הרגישות 384 גם למחקרים של רגישות מושרה D 2 קולטן דופמין איתות AC בשורות תאי רקומביננטי. במספר מחקרים ראשוניים, יש לנו בשימוש assay זה עם שינויים קלים להעריך D 2 קולטן דופמין וμ רגישות מושרה אופיואידים הקולטן של כמה isoforms AC (טבלה 1). מחקרים אלה מדגישים את תחולתה הכללית של assay 384 גם לקווים מרובים תאים, תת קולט, וisoforms AC. המעוניינים בפיתוח פורמטי assay דומים יהיה עודד לחקור משתנה כגון צפיפות תאים, פעמים מקדים אגוניסט, פרוטוקולי הפעלה / תנאי AC, ומתודולוגיה זיהוי HTRF מחנה לדגמים הסלולריים שלהם. נתוני אנטגוניסט המוצגים כאן להדגים את היכולת של assay לזהות מעכבי מולקולה קטנים של רגישות. ערכי העוצמה עולים בקנה אחד עם אלה שנקבעו במבחנים אחרים תפקודיים 28 כמו גם זיקת ערכים (קי) שהושגו באמצעות radioreceptor מחייב מבחני (ראו: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). עיצוב assay הנוכחי יכול בקלות להכיל HTS מאמצים שבו תרכובות מועברות באמצעות pintool או preplated בצלחות מוכנות assay. בנוסף למבחני הרגישות תיארו, המתודולוגיות כאן צריכה להיות רלוונטיות למודעות אחרותמבחני aptive בי תרופות מרובות / ריאגנטים שיושמו עד למידת נקודת סיום בפורמט 384 גם.
יש לנו ניסיתי להדגיש את שלבים התפתחות חשובות עבור assay 384 גם כולו, אלא גם רוצים לציין שהפיתוח של מבחני siRNA transfection ההפוך היה מאתגר במיוחד. המטרה ארוכת הטווח שלנו למבחנים אלה היא לבצע מאמץ רחב הגנום כדי לזהות את הגנים החופפים וייחודיים מעורבים ברגישות Heterologous של isoforms AC. שימוש assay siRNA הראשוני שלנו כקו מנחה, אנו מציעים ההצעות מקוצרות הבאות לפיתוח מבחני transfection siRNA הפוך: (1) לבחון את יעילות transfection באמצעות יחסים של מחוון כגון Siglo ומגיב transfection (. למשל Lipofectamine 2000), (2) לקבוע את צפיפות הזריעה האופטימלית (למשל 500-5,000 תאים / טוב), (3) לחקור משך transfection (למשל 48-96 hr), ו (4) להעריך את תנאי assay מתאימים (TR סמים למשלeatments, אמצעי נקודת סיום, ובקרות חזקות) להשגת אות אופטימלית (ניתוח הגורמים לדוגמא "Z). ניתן למצוא גם פרטים נוספים ומידע כללי יותר לשימוש של siRNA במאמצי הקרנה במאמרי שיטות הפניה בעבר 29,30. חוקרים אלו המעוניינים במאמצי HTS צריכים גם לחקור את יכולת ההתאמה של מבחני שלהם לאוטומציה (למשל. pintool ורובוטיקה). בנוסף, גורמים או פקדים אחרים למאמצי הקרנה כוללים אימות פורמאלית assay, מבחני כדאיות תא, ומסכי דלפק מתאימים. להנחיות נוספות, הקורא המעוניין יהיה מוזמן לבחון ידני NCGC Assay ההדרכה זמינה דרך NCATS ב: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.
שתארנו את הגישה שלנו לייעול assay multiday מייגע ליעילה "תערובת ולקרוא" assay שניתן לבצע ביום אחד. מתודולוגיות שתוארו כאן והמחקר שנערך לאחרונה של 1,280 תרכובות ברגישות הקולטן μopioid מושרה בפורמט 1,536 היטב 25 מצביע על כך שרגישות יכולה כעת תיחקר בקלות באמצעות HTS. Assay המתואר כאן ניתן לבדיקת מולקולה קטנה ויכול להיות מיושם על גישות גנטיות כגון siRNA. פורמט assay שלנו מתמקד בתגובה המסתגלת המכונה רגישות Heterologous של AC, עם זאת, את הגישה ושיטות הכלליות יכולים להיות מיושמים באופן נרחב למבחני תא מבוססים אחרים הדורשים תוספות סמים ומגיבים מרובות (לדוגמא: הפחתת רגישות וneuroprotection.). העבודה שמדווחת כאן מושגת בקלות בתוך הגדרה אקדמית באמצעות טפטפות רבי ערוצים וקורא צלחת מצב מרובה מסוגל לקרוא את נקודת הסיום הרצויה בפורמט 384 גם.
טבלת 1. דגמים נייד נבדקו לרגישות הנגרמת אגוניסט.
| קולט | AC איזופורם | שורת תאים | רגישות אות |
| דופמין D 2L | אנדוגני (AC6 ו27 AC7) | CHO-D 2L | 2-3 פי |
| דופמין D 2L | AC2 רקומביננטי, AC5, וAC6 | HEK 293 transfected ביציבות | AC2 = 2-3 פי AC5 = פי 50 AC6 = פי 15 |
| אופיואידים μ | AC1 רקומביננטי, AC2, וAC5 | HEK 293 transfected ביציבות | AC1 = 6-7 פי AC2 = 2-3 פי AC5 = 10-15 פי |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למר ריצ'רד אבץ וטוד Wiernicki להכשרה מתודולוגית והדרכה assay. אנו מודים גם יוחנן פאולוס ספנס לקריאה זהירה ועריכת הצעות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות 060,397 MH, מוח והתנהגות קרן מחקר, ואלי לילי וחברה באמצעות התכנית לילי פרס המחקר (LRAP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J.
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
