Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Медикаментозная сенсибилизация АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ: Анализ Рационализация и Миниатюризация для малого молекул и миРНК отбора заявок

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51218
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Summary

Стойкая активация тормозных G-белком рецепторов приводит к сенсибилизации сигнализации циклазной аденилил. Чтобы определить основные молекулярные пути, nonbiased подходы необходимы, однако, эта стратегия требует разработки масштабируемого на основе клеток цАМФ сенсибилизации анализа. Здесь мы описываем сенсибилизации анализа для малых молекул и миРНК скрининга.

Abstract

Повышение чувствительности аденилатциклазы (AC) сигнализации был вовлечен в различных нервно-психических и неврологических расстройств, включая токсикомании и болезни Паркинсона. Острая активация Gαi / вывода связаны рецепторов ингибирует активность АЦ, в то время упорной активации этих рецепторов приводит к гетерологического сенсибилизации переменного тока и повышению уровня внутриклеточного цАМФ. Предыдущие исследования показали, что это усиление переменного отзывчивость наблюдается как в лабораторных, а в естественных условиях после хронической активации нескольких типов Gαi / О-связанных рецепторов в том числе D 2 допамина и μ опиоидных рецепторов. Хотя гетерологичная сенсибилизация AC впервые сообщалось четыре десятилетия назад, механизм (ы), которые лежат в основе этого явления остаются в значительной степени неизвестными. Отсутствие механических данных предположительно отражает сложность, связанную с этим адаптивного ответа, предполагая, что nonbiased подходы могут помочь в идентификацииING молекулярные пути, участвующие в гетерологического сенсибилизации AC. Предыдущие исследования выявили участие киназы и сигнализации Gbγ как перекрывающиеся компоненты, которые регулируют гетерологичную сенсибилизации AC. Чтобы определить уникальные и дополнительные перекрывающиеся цели, связанные с сенсибилизации AC, разработка и утверждение масштабируемого цАМФ сенсибилизации анализа требуется для большей пропускной способности. Предыдущие подходы к изучению раздражение, как правило, громоздки участием постоянного обслуживания культуре клеток а также сложную методику измерений накопления цАМФ, использующая несколько шага промывания. Таким образом, разработка надежной клеточном анализе, который может использоваться для высокопроизводительного скрининга (HTS) в луночном формате 384 будет способствовать будущих исследований. Использование двух сотовых модели D 2 дофаминовых рецепторов (то есть. СНО-D 2L и HEK-АС6 / D 2L), мы перешли нашу 48-а анализ сенсибилизации (> 20 шагов 4-5 дней) до пяти-хТЭП, один день анализ в формате 384-а. Этот новый формат поддается скрининга малой молекулы, и мы показываем, что эта конструкция анализ может также быть легко использован для обратной трансфекции миРНК в ожидании целевого скрининга библиотеки миРНК.

Introduction

Адаптивный аденилатциклаза (АС) сигнализации ответ известный как гетерологического-или супер-сенсибилизации был впервые обнаружен в лаборатории нобелевского лауреата, доктор Маршалл Ниренберг. Доктор Ниренберг предложил, что наблюдаемая активная реакция AC после хронического δ активации опиоидных рецепторов был механизм участвует в толерантности к опиатам и зависимости 1. В дополнение к хронической δ активации опиоидных рецепторов, это neuroadaptive реакция сигнализации переменного тока также происходит следующее упорной активации нескольких других Gαi / о-в сочетании рецепторов 2. Примечательно, что многие из этих рецепторов связаны с болью, психоневрологических и неврологических расстройств, и включают в себя μ / κ опиоидов, D 2/4 допамин, 5НТ 1А и М 2/4 мускариновых рецепторов 2. В дополнение к результатам доктора Ниренберга, большое количество доказательств, существует связь сенсибилизации сигнализации переменного тока к хронической опиоидной активации рецептора как в естественных 3-7. Сенсибилизация AC также было связано с различными заболеваниями с участием D 2-подобных рецепторов допамина в том числе шизофрении и болезни Паркинсона (для обзора см. ссылку 2). Несмотря на потенциальную важность сенсибилизации, точный механизм (ы), связанные с постоянной Gαi / активации рецептора о-в сочетании, что приводит к увеличению тока отзывчивость остается неизвестной.

Эти исследования дают обоснование для изучения механизмов сенсибилизации аденилатциклазы в качестве важного нейробиологической цели. Аналогичным образом, физиологическое значение переменного тока сигнализации 8 и важность, что отдельные изоформы AC удерживайте эту адаптивного ответа также следует признать 2,9,10. В контексте нашего исследования, общие особенности, связанные с гетерологического сенсибилизации рекомбинантных изоформ AC параллельно те характеристики деприписана для изучения эндогенных изоформ AC. В частности, предыдущие исследования обнаружили, что активация Gαi / O белков и последующий выброс / перегруппировки βγ субъединиц Важным требованием к рецептора индуцированной сенсибилизации всех изоформ переменного тока. Кроме того, несколько исследований показывают, что сигнализацию от протеинкиназ и Gβγ подразделений участвуют в сенсибилизации 2,11-13. Индивидуальные кондиционеры также представлены уникальные и разные паттерны сенсибилизации 12. Например, постоянные экспозиции D 2-рецепторов в агонистов связано с сенсибилизации AC1 и AC8 к Ca 2 + / кальмодулин стимуляции 14,15, в то время как тесно связаны AC3 не осведомлены 2. AC2, AC4, и AC7 тесно связаны, однако, только PKC-стимулированной активности AC2 надежно сенсибилизированные после длительного воздействия D 2 рецепторов агонистами 7,14,16,17. Кроме того, АС5 и АС6 показывают заметное степень гетерогенныхologous сенсибилизация к газо-и форсколином стимулировали накопления цАМФ следующее активации D 2-рецепторов 14,18-20, но, кажется, отличаются по своей потребности в Gβγ субъединицы-AC взаимодействиях 21. Хотя большинство исследований AC сенсибилизации использовали клеточные линии модели (например, клетки HEK293, выражающие отдельные изоформы AC), кажется, что эти данные перевести в родные нейронных моделей сотовых 4,22. Совсем недавно, эффекты AC изоформ селективных низкомолекулярные ингибиторы определенных в НЕК293, выражающих переменного тока изоформы также могут быть переведены на в естественных условиях поведенческих исследований 23.

Отсутствие идентифицированного молекулярного механизма для гетерологического сенсибилизации, вероятно, отражает сложность адаптивного ответа, а также уникальные нормативные свойства личности AC изоформ 12. Раскрытие такой сложности осложняется использованием громоздкой методологии тшляпа ограничил академических исследователей от использования беспристрастные подходы. Например, наши предыдущие механистические исследования включали использование постоянно культивируемых клеточных моделях с использованием 24 - и формат тканевой культуры 48-а 15. Культивируемые клетки были выращены, как правило, в течение 48 ч и затем подвергали агониста лекарственной терапии (2-18 ч), за которым следует ряд клеточных моет и инкубации (рис. 1). AC-изоформы конкретных цАМФ протоколы накопления были тогда заняты последующим измерением накопления цАМФ с использованием длительными и трудоемкими [3 H] цАМФ связывания методологии 15,24. Продолжительность от начала до конца для каждого анализа обычно требуется в общей сложности четыре-пять дней из клеток обшивки для анализа данных (рис. 1). Применение новых технологий и автоматизации привело к отмеченными усовершенствований для повышения чувствительности исследований в промышленной и HTS центральной обстановке. Например, группа сотрудничает с Национальным Центром Chemiкал геномики сообщил двухдневный HTS процедуры анализа для выявления низкомолекулярные ингибиторы μ-опиоидными рецепторами индуцированной сенсибилизации в формате 1536-а 25.

В данной статье описываются наши усилия по созданию ВТСП анализ для исследования гетерологического сенсибилизации с использованием технологий, которые доступны в большинстве академических научно-исследовательских институтов. Эта стратегия была достигнута путем включения использование криоконсервированных клеток из клеточных моделях гетерологично выражая допамина D 2 в сочетании с эндогенными или отдельных рекомбинантных изоформы аденилатциклазы (СНО-D 2L или НЕК-АС6 / D 2 L). Чтобы улучшить нашу пропускную мы переработан наш сенсибилизации анализа 48 а (ок.> 20 шагов за 4-5 дней), чтобы пятиступенчатой, один день пробирного в 384-а формате, который был по существу "смешивать и читать". Новый формат использует имеющийся в продаже однородной времени решен флуоресценции (HTRF) анализа для измерения цАМФ в соотвumulation в интактных клетках с считывающее режим пластины. Анализ является надежной и поддаются скрининга малой молекулы, и может эффективно применяться для скрининга ингибиторов гетерологичного сенсибилизации. Кроме того, мы предоставляем данные, что позволяет использование данного анализа с обратной трансфекции миРНК для целевого или Геном широкого скрининга библиотеки миРНК только с небольшим изменением к общему подходу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Расширение и Криоконсервация Анализ готовые клетки

  1. Культура СНО-К1-РРП 2L (СНО-D 2L) клетки по мобильному блюдо 15 см 2 культуры в F12 СМИ Хэма, дополненной 1,0 мкм L-глутамина, 800 мкг / мкл G418, 300 мкг / мкл гигромицин 100 ед / мкл пенициллина, 100 мкг / мкл стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  2. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2, пока клетки не являются 90-95% сливной. Промывают клетки с 10 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), и сбора клеток путем добавления 3 мкл буфера для диссоциации клеток в течение 5 мин при 37 ° С Ресуспендируют клеток с использованием 12 мкл в культуральной среде и подсчета клеток с использованием трипанового синего.
  3. Центрифуга клеточной суспензии при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирации супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мкл замораживания средств массовой информации (10% диметилсульфоксид, 90% FБС). Развести клеточной суспензии, чтобы достичь желаемой концентрации клеток (например, 1-20 × 10 6 клеток / мкл).
  4. Алиготе 1,0 мкл клеточной решения каждой криопробирку. Инкубируйте криопробирки в морозильной контейнера клеток при температуре -80 ° С в течение ночи. Перенесите криопробирки до жидкого N 2 бака для длительного хранения.

2. Покрытие Assay готовые клетки (и обратного трансфекции вариант)

  1. Быстро разморозить замороженный криопробирку клеток в водяной бане при 37 °. Как только клетки размораживают, перенести клетки в 15 мкл коническую трубку с 9 мкл Opti-MEM, и взболтайте ее трубки 3-5x.
  2. Центрифуга клетки при 500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мкл Opti-MEM.
  3. Граф клеток с использованием трипанового синего, чтобы определить жизнеспособность клеток и разбавить жизнеспособных клеток по мере необходимости (например,. 3 х 10 5 клеток / мкл концентрация) вOpti-MEM. Пластина 10 мкл / лунку клеток в культуре ткани обрабатывают 384-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки.
  4. Сделать серийные разведения цАМФ в Opti-MEM для получения стандартной кривой для оценки производства цАМФ клетками (согласно производит рекомендации - см. раздел 7). Добавить 10 мкл / лунку стандартов цАМФ к пластине. Примечание: единый стандарт кривая может быть подготовлен на отдельной тарелке или пустых скважин на одном из аналитических планшетов.
  5. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре и инкубировали при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 1 часа.

3. Реверс миРНК трансфекции вариант *

Этот раздел является необязательным и отношение к Рисунок 3.

  1. Приготовьте раствор миРНК в РНКазы DDH 2 O (например, 0,4 пмоль / мкл). Добавьте 5 мкл в отдельные лунки 384-луночный планшет, центрифуге и пластину при 100 х г в течение 15 SEC при комнатной температуре.
  2. Развести Lipofectamine 2000 в Opti-MEM с коэффициентом 0,006 (например добавить 6 мкл Lipofectamine 2000 до 1000 мкл Opti-MEM), и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  3. Инкубируйте решение Липофектамин 2000/Opti-MEM течение 5 мин при комнатной температуре. Добавьте 5 мкл разбавленного раствора Липофектамин 2000/Opti-MEM индивидуальных скважин 384-луночный планшет, который уже содержит миРНК. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре.
  4. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
  5. Планшете готовые клетки, как описано выше (раздел 2). Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре.
  6. Вернуться анализа пластину увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C (5% CO 2) в течение 48-96 часов, как это определено для целевого гена сбить (см. обсуждение).

4. Маленькая молекула Скрининг

  1. Развести препарат интереса (ингибиторы например. Небольшие молекулы) в Opti-MEM до 6x желаемых конечных концентраций. Серийные разведения может быть завершена с помощью ручного пипетки или жидкий обработки станцию.
  2. Добавить 2,5 мкл / лунку тестируемого соединения или буфера, содержащего транспортное средство (например, в ДМСО) в сторону скважин с использованием многоканальной пипетки.
  3. Центрифуга пластину при 100 мкг в течение 15 сек при комнатной температуре (инкубационный является обязательным).

5. Стойкая Agonist Лечение

  1. Приготовьте 600 нм (т.е.. 6 раз желаемой конечной концентрации 100 нМ) раствору quinpirole в Opti-MEM.
  2. Добавить 2,5 мкл / лунку в 600 нм quinpirole решение в сторону лунки с помощью многоканальной пипетки.
  3. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре и инкубировали при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 2 часов.

6. Стимуляция цАМФ накопления

  1. Во время 2 ч инкубации подготовить stimulatiна решения в Opti-MEM. Решение стимуляция состоит из 40 мкМ форсколина, 2 мкМ 3-изобутил-1-methyxanthine (IBMX) и 4 мкМ спиперон (все концентрации на этапе 6, 4x желаемой конечной концентрации).
  2. Добавьте 5 мкл / лунку стимуляции решение в сторону лунки с помощью многоканальной пипетки.
  3. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

7. Закалка и оценка цАМФ накопления

  1. Производство цАМФ клетками измеряется с помощью динамического 2 комплекта цАМФ в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, восстановить против цАМФ-криптат и цАМФ-D2 в дистиллированной воде. Замораживание аликвоты при -20 ° С на короткий срок хранения.
  2. Развести одну аликвоту анти-цАМФ-криптата и одну аликвоту цАМФ-D2 отдельно в буфере для лизиса в соответствии с инструкциями производителя, чтобы сделать работу решений.
  3. дд 10 мкл / лунку рабочего раствора анти-цАМФ-криптат и 10 мкл / лунку из цАМФ-d2 рабочего раствора на 384-луночный планшет, используя многоканальную пипетку.
  4. Центрифуга пластины при 100 х г в течение 15 сек при комнатной температуре и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
  5. Читайте пластины в флуоресценции ридере (настройка автоматического масштабирования на чувствительность), используя возбуждение 337 нм, и измерять выбросы при 620 нм и 665 нм в инструкции производителя.
  6. Применить логометрические анализ для оценки цАМФ стандартная кривая за инструкции производителя. Используя полученные значения, экстраполировать стоимости накопление цАМФ в тестовых скважин с использованием программного обеспечения для анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Часть I. Разработка 384 хорошо гетерологичную сенсибилизации анализа для выявления низкомолекулярные ингибиторы с использованием коммерчески доступного модель клетки.

Для изучения гетерологичную сенсибилизации в модели клеток, мы сделали ряд улучшений, которые позволили нам оптимизировать анализа в формат "Mix и читать". Некоторые из ключевых модификаций, изложены ниже и описаны более подробно в обсуждении. Первый ключевой шаг был изменив нашу культуру клеток от постоянно культивируемых клеток к криоконсервации клеток 26. Мы в настоящее время регулярно культура партии клеток, которые могут быть крионированным при концентрациях между 1-20 х 10 6 клеток / мкл. Для каждого соответствующего анализа, запасы клеток размораживают, разбавленный, подсчитывали и затем высевали непосредственно в 384-луночных планшетах. Устранение необходимости в период культуры и повышения удобства анализа. Формат нашего предыдущего сенсибилизации анализа используются Tiss 48-аие культуральные планшеты, и участвует ряд стирки, декантации, стадиях процесса, и фильтрации на основе [3 H] цАМФ анализа связывания (рис. 1). Таким образом, этот формат для сенсибилизации не поддаются высокой пропускной способности. Поэтому мы оказали значительные усилия по рационализации анализа первый 96-Ну а потом формате 384-а исправимо для высокопроизводительного скрининга. Оптимизация участие устранение стадий промывки и оценки нескольких типов культуры / аналитические планшеты, различные плотности клеток, а также различные периоды инкубации. Мы также исследовали несколько методик для обнаружения цАМФ и обнаружили, что хорошо характеризуется технология HTRF цАМФ используется в настоящем протоколе было очень воспроизводимые, надежные и чрезвычайно стабильной. Этот анализ платформа основана на immunocompetition между цАМФ, продуцируемых клетками и меченого цАМФ (т.е.. ЦАМФ-D2), представленной комплекта. Мы в настоящее время успешно разработаны и применяются протоколы для гетерологического СЕНСИТзации в формате 384-а, которые по существу "смешивать и читать" (правая панель Рисунок 1).

Наша первоначальная цель заключалась в генерации высокой пропускной D 2L рецепторов сенсибилизации анализа с использованием коммерчески доступных СНО-D 2L клетки (человеческий РРП 2L, номер доступа: NM_000795), что эндогенно выразить AC6 и AC7 27. Замороженные клетки CHO-D 2L высевали при 3000 клеток / лунку в планшет для тканевых культур 384-луночный, и уравновешивали в течение 1 часа при 37 ° С в увлажненном инкубаторе. Планшеты вынимали из инкубатора и возрастающих концентраций агониста D 2 quinpirole добавляли при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С в увлажненном инкубаторе. Циклический АМФ накопление Затем инициировали добавлением 10 мкМ форсколина (прямое активатора переменного тока). Буфер накопления цАМФ содержится ингибитор фосфодиэстеразы, изобутилметилксантина (IBMX), А также D 2 антагониста, спиперон (1 мкМ, K I для D, 2L = 0,07 нМ), с тем чтобы исключить активацию рецептора остаточного D 2 за период накопления цАМФ. Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Испытание заканчивают добавлением буфера для лизиса, содержащего HTRF цАМФ реагентов. Исследования показали, что 2 часа предварительная обработка quinpirole усиливается последующее форсколином стимулировали накопление цАМФ в зависимости от дозы в соответствии с гетерологического сенсибилизации (рис. 2А). Результаты этого эксперимента показывают, что сенсибилизации анализы могут быть выполнены в формате 384-луночный. Новый формат анализа сократили количество шагов от более 20 до 4 шагов без необходимости мыть или переливать шагов делает его "смешивать и читать" анализ (рис. 1).

Вторая серия экспериментов исследовали, может ли эта новая обтекаемая анализ быть использованы дляssess ингибиторы сенсибилизации в модели СНО-D 2L. Замороженные CHO-D 2 L клетки высевали в 384 планшета для культуры ткани также при плотности 3000 клеток / лунку в Opti-MEM. Известные D 2 антагонисты были добавлены в блок D 2 рецепторов, вызванной сенсибилизации. Opti-MEM, содержащей 100 нМ quinpirole (конечная концентрация) затем добавляли к общим объемом 15 мкл, и клетки инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С в увлажненном инкубаторе. После инкубации накопление цАМФ был инициирован прямого добавлением форсколина (10 мкМ конечная концентрация), и Испытание заканчивают и цАМФ измеряли с помощью HTRF. Первые результаты показали, что предварительная обработка спиперона или галоперидола (прототип D 2 антагонисты) полностью предотвратить quinpirole индуцированной сенсибилизация форсколином стимулируется цАМФ накопления (рис. 2б). Эти результаты обеспечивают проверку, что этот подход может быть использован для идентификации небольшоймолекулы ингибиторы D 2-рецепторов, вызванной сенсибилизации. Во втором эксперименте, мы использовали этот метод для оценки потенцию серии D 2-антагонистов, чтобы проверить эти соединения подавляют ли раздражение. Как и на предыдущих результатах, эти исследования показали, что D 2 антагонисты ингибируют индуцированную агонистом сенсибилизацию в зависимости от дозы (рис. 2в). Порядок ранжирования потенции для ингибирования сенсибилизации согласуется с их действиями в качестве антагонистов D 2-рецепторов и их ранее описанного фармакологии в D 2-рецепторов 28.

Часть II. Применение сенсибилизации анализе 384-а для обратного трансфекции миРНК в скрининговых начинаниях.

Следующим цель заключалась в разработке сенсибилизации анализа 384-луночный который может быть использован для проведения масштабируемую обратной трансфекции миРНК скрининга библиотеки. Предварительные исследования быливыполняется с использованием модели НЕК клеток, что гетерологично выражает оба D 2L дофаминовые рецепторы (крыса РРП 2L, номер доступа: NM_012547) и AC6 (крыса ADCY6, номер доступа: NC_005120) (т.е. НЕК-АС6 / D 2L клетки). Первые эксперименты оценивали способность продемонстрировать агониста индуцированной сенсибилизации AC в клеточной линии. Вкратце, криоконсервированных клеток AC6 / D 2L высевали (1000 клеток / лунку) в культуре ткани пластины 384-луночный. Opti-MEM, содержащей 1 мкМ quinpirole (конечная концентрация) добавляли к общим объемом 15 мкл, и клетки инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С в увлажненном инкубаторе. После инкубации накопление цАМФ была инициирована добавлением возрастающих концентраций форсколина. Испытание заканчивают добавлением буфера для лизиса, содержащего HTRF реагентов. Результаты показали, что облучение клеток агониста quinpirole в течение 2 часов привело к заметному повышению форсколин-стимулированных CAMНакопление P (фиг.3А). Повышенное накопление цАМФ в обоих 100 нМ и 300 нМ форсколина было больше, чем в 15 раз по сравнению с обработанными наполнителем клеток (фиг.3А).

Далее, мы использовали опубликованные миРНК методологии 29,30 направлять наши усилия по оптимизации, которые включали в себя оценку различных неблагоприятных условиях трансфекции (например, реагентов трансфекции, эффективности трансфекции, плотности клеток, времени инкубации и др.). Предварительные исследования используются siGloRed, индикатор трансфекции, в сочетании с Lipofectamine 2000, чтобы определить оптимальные условия обратного трансфекции. Эксперименты показали, что 2-4 пмоль миРНК / 5 мкл H 2 O в сочетании с 0,03 мкл Липофектамина 2000/5 мкл OPTI-MEM предоставил почти 95% эффективность трансфекции в 72 ч без наблюдаемой токсичности в клетках НЕК (данные не показаны). Затем мы исследовали влияние Gαs миРНК на гетерологического сенсибилизациифорсколина стимулировали накопление цАМФ в АС6 / D 2L клеток. Газ миРНК была предложена в качестве потенциального положительного контроля, потому что Gαs была определена в качестве одного из ключевых компонентов гетерологического сенсибилизации в течение нескольких изоформ AC (т.е. AC1, AC2, ac5 и AC6) 19-21. Кроме того, в 15 раз сенсибилизация сигнал в нашем AC6 / D 2L модель сотового (рис. 3А) обеспечивает надежную сигнал к окну шума для оценки эффективности обратной трансфекции. Использованием условий, описанных выше, завершены предварительные исследований по оценке Gαs миРНК в качестве положительного контроля, и наши результаты показали надежную блокаду (> 90%) сенсибилизации (данные не показаны).

Резкое сокращение миРНК-индуцированной в сигнале сенсибилизации обеспечивает соответствующий положительный контроль для процесса отбора миРНК. Для получения более количественную оценку для миРНК скрининга AC гетерологического сенсибилизации, мы получили данные, в которыхфактор Z 'была рассчитана для ряда тестовых условиях с использованием клеток АС6 / D 2L 31. Для этого эксперимента, мы объединили 2 пмоль Gαs миРНК, или без таргетинга контроль миРНК, в 5 мкл с 0,03 мкл Lipofectamine 2000/5 мкл Opti-MEM на лунку в 384-луночный планшет (общий объем 10 мкл). Замороженные клетки оттаивали, ресуспендировали в Opti-MEM и затем добавляют к отдельным лункам, содержащим миРНК / Lipofectamine смеси с использованием нескольких плотности клеток (т.е.. 500-5000 cells/10 мкл / лунку). Продолжительность лечения quinpirole (2 ч против 18 ч), а также конечной концентрации форсколина (100-300 нм) также исследовали в нашей AC6 / D 2L сенсибилизации анализа. Результаты этих экспериментов показали, что фактор надежной Z 'был получен в следующих условиях: 750 клеток / лунку, продолжительность 72 часа трансфекции, 2 ч. лечение quinpirole и 300 нМ форсколином стимулировать накопление цАМФ (рис. 3б). В этих сотрудничестваnditions, мы получили ответ в 15 раз сенсибилизации, которая была снижена на 94% в присутствии Gαs миРНК (Z '0,6 для Gαs миРНК против. контролировать миРНК).

Рисунок 1
Рисунок 1. В традиционном формате, клетки высевают в формате 48-луночного и выращивали до слияния в течение 48 часов. Среды для выращивания декантируют, низкомолекулярные ингибиторы последующим добавлением добавлением агониста D 2. После 2 ч инкубации анализ медиа декантируют и клетки подвергают серии этапов стирки / декантируют. Далее, AC стимулируется и клетки лизируют. Циклическая накопление АМФ затем оценивали с помощью [3 H] связывания цАМФ, который является 2 дневный анализ требует стадию фильтрования и сцинтилляционного счета. В то время как их ликвидация формат 96 хорошоованные многие из стирки и переливать шагов, мы обнаружили, что этот формат не был легко поддаются HTS или автоматизации. Формат HTS использует криоконсервированных клеток, высевают непосредственно в 384-луночных планшетах. Эти криоконсервированные клетки "анализа готов" после 1 часа уравновешивания. После этого начального периода инкубации низкомолекулярные ингибиторы могут быть добавлены с последующим добавлением D 2 агониста для 2 ч инкубации. AC стимулируется, и клетки лизируют с использованием реагентов обнаружения HTRF в аналитический планшет.

Рисунок 2
Рисунок 2. Клетки CHO-Криоконсервированные D 2L высевали непосредственно в 384 также аналитические планшеты при 3000 клеток / лунку и уравновешивали в течение 1 часа. А.) увеличение концентрации D 2 агониста, quinpirоле, были добавлены и клетки инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С в увлажненном инкубаторе. Циклический АМФ накопление стимулировали 10 мкМ форсколина (конечная концентрация) в присутствии спиперона и IBMX в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакцию гасили с помощью HTRF цАМФ реагенты (п = 1, представительства не менее 3 экспериментов). Данные выражены как процент ответа обработанных носителем клеток. Б) CHO-D 2L клетки предварительно в отсутствие (контроль) или в присутствии указанных антагонистов D 2 рецепторов (т.е. спиперон или галоперидол). Quinpirole (100 нМ) был добавлен, и клетки инкубировали в течение 2 ч, чтобы вызвать раздражение. AC стимулировали 10 мкМ форсколина (конечная концентрация) в течение 1 часа при комнатной температуре. Циклический АМФ определяли с помощью HTRF. Данные выражены как процент ответа обработанных носителем клеток. С) СНО-D 2L клетки предварительно в отсутствии (контроль =100%) или наличие увеличением концентрации указанных антагонистов рецепторов D 2. Quinpirole (100 нМ) был добавлен, и клетки инкубировали в течение 2 ч, чтобы вызвать раздражение. AC стимулировали 10 мкМ форсколина (конечная концентрация) в течение 1 часа при комнатной температуре. Циклический АМФ определяли с помощью HTRF. Данные представлены в виде процента от quinpirole вызванной ответ сенсибилизации. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Криоконсервированные НЕК-AC6 / D 2L клетки высевали на 1000 клеток / лунку и уравновешивали в течение 1 часа. A.) Клетки инкубировали с носителем или 100 нМ quinpirole в течение 2 часов в увлажненном инкубаторе. AC ваы стимулировали с возрастающими концентрациями форсколина в течение 1 часа при комнатной температуре. Циклический АМФ определяли с помощью HTRF. Б.) Обратный трансфекции Gαs миРНК блоков сенсибилизации в АС6 / D 2L клеток. Gαs миРНК или nontargeting контроль миРНК (2 пмоль) смешивают с 0,03 мкл Lipofectamine2000 (Lipo) в общем объеме 10 мкл, раствор был добавлен в отдельные лунки в 384-луночный планшет. Криоконсервированные AC6 / D 2L клетки были затем добавлены в обратном трансфекции и инкубировали в течение 70 ч при 37 ° С в увлажненном инкубаторе. Агонист рецептора D 2, quinpirole (1 мкМ окончательный) или транспортного средства с последующим добавлением 2-часовой инкубации. Циклическая накопление АМФ стимулировали 300 нМ форсколином (конечная концентрация) в течение 1 часа и измеряется с помощью HTRF. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В целях облегчения исследований гетерологического сенсибилизации, мы значительно изменена наш предыдущий метод достижение обтекаемый "микс и читать" формат, который исправимо для высокопроизводительного скрининга и механизма экспертизы действий. Основными модификации нашего протокола можно резюмировать следующим образом: 1) использование криоконсервированных клеток как «анализа-готов» реагентов, 2) миниатюризации анализа в формате 384-а и 3) использования измерения HTRF из цАМФ.

Принятие криоконсервации для анализов клеток на основе наших значительно улучшилась эффективность и воспроизводимость для нашей повседневной экспериментов и скрининга начинаниях. Этот подход является отраслевым стандартом, и могут быть легко переведены в академических исследований заходящего 26. Для повышения эффективности клеточной культуре, флаконы клеток используются в качестве "с полки реагентов" в том, что запасов клеток размораживают, разбавляют, а затем гальваническим непосредственно в 384-луночных планшетах FOг каждый анализ. Мы ранее включены криоконсервированных клеток в исследованиях, направленных на выявление антагонисты беспозвоночных G белком рецепторов 32,33. Эта методология была выгодна тем, что первоначальная работа не была выполнена в нашей лаборатории и необходимость транспортировки культивируемых клеток по кампусу, который создает проблемы и, вероятно, введенные изменчивость. Используя наш новый подход, замороженные клетки теперь можно сразу оттаивают и разбавляют на месте до начала анализа. В дополнение к улучшению воспроизводимости, криоконсервация также ликвидировали 48 часами период от клеток обшивки к исполнению анализа (рис. 1). Мы успешно применяется подход криоконсервации в стабильных и переходных исследований трансфекции с использованием различных рекомбинантных рецепторов и подтипов кондиционеров с функциональными показаний в том числе накопления цАМФ и найма β-аррестина (Brust, TF, Ejendal, КФК, и Watts, VJ неопубликованные данные) . Де-Pite наши положительные впечатления на сегодняшний день, исследователи должны проверить, что их рецепторов или цель, и система модель сотового совместим с криоконсервации до начала любой масштабные исследования.

Вторая модификация, что было важно для наших усилий по рационализации сенсибилизация анализа участвующие ликвидацию декантации и мыть шаги (рис. 1). Эти изменения совпали с нашим миниатюризации анализа в формате 96-луночного (Конли и Watts, неопубликованные наблюдения). В частности, модифицированный протокол сенсибилизации был разработан где накопление цАМФ был инициирован прямого добавлением форсколина в буфере для анализа следующих D 2 агониста инкубации в отсутствие каких-либо стирки или декантируют шагов (см. средней панели рисунок 1). Кроме того, буфер накопление цАМФ содержит относительно высокую концентрацию спиперона (1 мкМ), антагонист D 2, который имеет значение Ki 0,07 нМ для D 2рецепторов 15. Это в 100 раз избыточную концентрацию результатов спиперон в полном D 2-рецепторов оккупации во время фазы накопления цАМФ, тем самым препятствуя активации остаточного D 2 рецептора агонистов (например quinpirole) во время форсколином стимулировали AC шаг 15. Это изменение устранило три сцеживать и три шага промывания после первоначального агониста инкубации. В рамках развития формате 96-луночного, мы также смогли устранить последний шаг декантируйте перед закалкой и лизиса клеток. Эта модификация было достигнуто путем увеличения концентрации нашем лизирующего реагента (т.е. трихлоруксусной кислоты;. ТСА) от 3-9% и добавление реагента непосредственно в буфер накопления цАМФ. В многообещающие результаты модифицированного 96 хорошо сенсибилизации анализа обеспечивал поддержку конверсии сенсибилизации анализа в формат 384-а. К сожалению, наш предыдущий методология количественного лагерь был трудоемкий filtratioн основе [3Н] цАМФ белок Анализ связывания (> 5 шагов). Например, анализ, как правило, завершена в течение двух дней, чтобы позволить фильтра сушки и сцинтилляционного счетчика 15,24. Эти недостатки сделал [3 H] цАМФ белок связывания непрактично использовать для формата 384-а высокой пропускной способности.

Развитие Третий ключевой пришел путем включения методологий для измерения и количественной цАМФ таким образом поддается формате 384-а. Например, у нас есть значительный опыт помощью элемента цАМФ Response (CRE)-люциферазы журналистом системы для измерения относительных цАМФ в формате 384-а 32,33. Хотя этот подход был успешно использован нашей лабораторией для многих исследований Gαs-рецепторов, сопряженных, CRE-Люк репортеры подлежат количество ложных срабатываний и негативы во время скрининга 34. Кроме того, наши предварительные D 2-просветительские исследования с помощью этого приложенияплотва не были обнадеживающими в том, что мы наблюдали очевидное подавление обратной связи люциферазы сигнала (данные не показаны). Поэтому мы сосредоточили свои усилия на реализации технологии GloSensor цАМФ путем построения и характеризующие стабильных клеточных линий, используя как их "первый" и "второй" GloSensor векторы поколения. GloSensor является инженерии люциферазы репортер, содержащий сайт связывания цАМФ в люциферазы белка 35. Хотя система очень полезна для кинетической цАМФ количественного, метод не является эффективным для измерения агонист-индуцированную сенсибилизации (Конли и Watts, неопубликованные данные). Мы также исследовали Брет основе цАМФ биосенсора 36 для наших исследований в качестве экономически эффективных средств для оценки накопления цАМФ. К сожалению, фоновый шум, связанный с трансфицированы биосенсора ограничивается нашу способность адаптироваться этот метод для нашего сенсибилизации анализа. Наконец, мы оценили несколько комплектов использованием однородной времени решен Fluorценции (HTRF) в качестве подхода для измерения цАМФ в формате 384-а. Мы обнаружили, что это установлено методология была наиболее совместимы с академическими лабораториями и сортировочного оборудования в том, что они были надежными, чувствительны, стабильный и простой в использовании. Основным недостатком для академических исследователей является стоимость реагентов, однако массовая закупка реагентов и миниатюризации до 384 а формат делает цену более конкурентоспособным по сравнению с другими наборами, в том числе на основе ИФА анализов и нашей предыдущей «домашнего» [3 H] цАМФ белка анализа связывания 15.

Представитель работа демонстрирует применимость сенсибилизации анализе 384-а в исследованиях D 2 дофаминовых рецепторов индуцированной сенсибилизации сигнализации переменного тока в рекомбинантных клеточных линий. В нескольких предварительных исследований, мы использовали эту пробу с незначительными изменениями для оценки D 2 допамина и μ рецепторов опиоидов индуцированных сенсибилизации нескольких изоформ AC (Табл. 1). Эти исследования подчеркивают общую применимость 384-луночный анализа на нескольких клеточных линий, подтипов рецепторов и изоформ AC. Лица, заинтересованные в разработке аналогичных видах анализов будут поощрять к изучению переменных, таких как плотность клеток, агонистов раз предварительной обработки, переменного тока протоколов активации / условия, и HTRF цАМФ методологии обнаружения для их клеточных моделях. Антагонист данные, представленные здесь демонстрируют способность анализа для выявления низкомолекулярные ингибиторы сенсибилизации. Значения потенции соответствует той, определяется с другими функциональными пробами 28, а также сродства (KI) значениями, полученными с помощью радиорецепторных анализов связывания (см.: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). Настоящий дизайн анализ может легко вместить HTS усилия там, где соединения доставляются через pintool или preplated в аналитических готовых плит. В дополнение к сенсибилизации анализов, описанных, методологии, применяемые здесь должны быть применимы к другим объявлениемaptive анализы, где несколько препаратов / реагенты, применяемые до проведения точке измерения конечной в формате 384-а.

Мы попытались выделить важные шаги в области развития для всего анализа 384-а, но и хочу отметить, что развитие обратных трансфекции миРНК анализов был особенно сложным. Наша долгосрочная цель для этих анализов является проведение генома широкий усилия для выявления перекрывающиеся и уникальные гены, участвующие в гетерологического сенсибилизации переменного тока изоформ. Используя наш первоначальный миРНК анализа в качестве ориентира, мы предлагаем следующие сокращенные предложения для разработки миРНК обратные трансфекции анализов: (1) изучить эффективность трансфекции с помощью соотношения такой показатель, как Siglo и реагента для трансфекции (. Например липофектамином 2000); (2) определить оптимальную плотность посева (например 500-5000 клеток / лунку), (3) изучить продолжительность трансфекции (например 48-96 ч) и (4) оценить соответствующие условия анализа (например, TR наркотиковeatments, конечная точка меры и надежные средства управления) для достижения оптимального сигнала (факторного анализа, например, Z '). Дополнительные подробности и более общая информация по использованию миРНК в скрининговых начинаниях также могут быть найдены в ранее ссылки методов статей 29,30. Эти исследователи, которые заинтересованы в усилиях HTS также следует изучить приспособляемость их анализах для автоматизации (например,. Pintool и робототехники). Кроме того, другие факторы или элементы управления для скрининга начинаниях включают формальную проверку анализа жизнеспособность клеток анализы, а также соответствующие экраны встречные. Для дополнительных указаний, заинтересованный читатель будет предложено изучить Руководство NCGC Анализ указаний, доступных через NCATS на: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.

Мы описали наш подход для рационализации трудоемкий многодневных анализа в эффективную »смеси и читать" анализа, которые могут быть выполнены в течение одного дня. Методологии, описанные здесь, иНедавнее исследование 1280 соединений в μopioid рецепторов индуцированной сенсибилизации в формате 1536-а 25 предполагает, что сенсибилизация теперь могут быть легко считаны, используя HTS. Анализ, описанный здесь поддается испытаний малой молекулы и может быть применен к генетическим подходов, таких как миРНК. Наш формат анализа ориентирована на адаптивный ответ, известного как гетерологического сенсибилизации AC, однако общий подход и методы могут быть широко применены в других анализах на основе клеток, требующих нескольких наркотиков реагента и дополнений (например, десенсибилизации и нейропротекции.). Работа, о которой здесь легко осуществляется в академической обстановке, используя многоканальные пипетки и мульти режиме планшет-ридер, способный читать нужную конечную точку в формате 384-а.

Таблица 1. Клеточные модели проверены на агонист-индуцированную сенсибилизации.

Рецептор AC Изоформа Клеточная линия Сенсибилизация
сигнал
D 2L дофамина Эндогенный
(АС6 и AC7 27) 		СНО-D 2L 2-3 раза
D 2L дофамина Рекомбинантный AC2, АС5 и АС6 НЕК 293, стабильно трансфицированные AC2 = 2-3 раза
АС5 = 50 раз
АС6 = 15 раза
μ опиоидных Рекомбинантный AC1, AC2, а AC5 НЕК 293, стабильно трансфицированные AC1 = 6-7 раза
AC2 = 2-3 раза
АС5 = 10-15 раз

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность г-на Ричарда Zink и Тодд Wiernicki для методологической подготовки и анализа руководством. Мы также благодарим Иоанна Павла Спенс за внимательное чтение и редакционных предложений. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения МЗ 060397, мозг и поведение Research Foundation, и Эли Лилли энд компани рамках Программы Lilly Research Award (LRAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHO-K1-DRD2L cells DiscoveRx 930579C2
Ham’s F12 media VWR SH30026fs
Fetal Bovine Serum VWR SH3007003
G418 Sigma A1720
Hygromycin Fisher 50-230-5556
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15070063
15 cm dishes BD Falcon 353025
DMSO Sigma D2650
Cell dissociation buffer Life Technologies 13150016
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
Cryovials Fisher 976171
Opti-MEM Life Technologies 31985070
TC treated 384-well plates Perkin-Elmer 6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kit Cisbio Bioassays 62AM4PEB http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4 Biotek H4MLFPTAD
Prism 6 GraphPad Software NA
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
(±)Quinpirole Sigma Q111
Spiperone Sigma S7395
Clozapine Sigma C6305
Haloperidol Sigma H1512
S-(-)Sulpiride Sigma S112
Lipofectamine 2000 transfection reagent Invitrogen 11668019
Trypan blue Life Technologies T10282
Water, DNase- and RNase-free MP Biomedicals 821739
Gas siRNA Dharmacon custom siRNA
Nontargeting siRNA control Dharmacon D-001206-14-20
siGlo Red Dharmacon D-001630-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

Tags

Биоинженерия выпуск 83 аденилатциклаза цАМФ гетерологичная сенсибилизация суперактивации D2 дофамина μ опиоидных миРНК
Медикаментозная сенсибилизация АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ: Анализ Рационализация и Миниатюризация для малого молекул и миРНК отбора заявок
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conley, J. M., Brust, T. F., Xu, R., … More

Conley, J. M., Brust, T. F., Xu, R., Burris, K. D., Watts, V. J. Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications. J. Vis. Exp. (83), e51218, doi:10.3791/51218 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter