Summary
Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.
Abstract
Sensibilisierung von Adenylylcyclase (AC) Signal wurde in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen, einschließlich Drogen-und Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Akute Aktivierung von Gai / o-gebundenen Rezeptoren hemmt AC-Aktivität, während die anhaltende Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu heterologe Sensibilisierung von AC-und erhöhten intrazellulären cAMP. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Verbesserung der AC Ansprechempfindlichkeit sowohl in vitro als auch in vivo nach der chronischen Aktivierung von mehreren Arten von Gai / O-verknüpften Rezeptoren, Dopamin-D 2 und μ-Opioid-Rezeptoren beobachtet. Obwohl heterologe Sensibilisierung AC wurde vor vier Jahrzehnten berichtet, wobei der Mechanismus (en), die dieses Phänomen zugrunde liegen, bleiben weitgehend unbekannt. Der Mangel an mechanistische Daten vermutlich spiegelt die Komplexität, die mit dieser Anpassungsreaktion beteiligt, was darauf hindeutet, dass nonbiased Konzepte könnten helfen, zu identifizierenten die molekularen Signalwege in heterologen Sensibilisierung von AC beteiligt. Frühere Studien haben Kinase und Gbγ Signalisierung als überlappende Komponenten, die die heterologe Sensibilisierung von AC regeln verwickelt. Um einzigartige und zusätzliche Ziele mit überlappenden Sensibilisierung der AC zu identifizieren, ist die Entwicklung und Validierung eines skalierbaren Sensibilisierung cAMP-Assay für mehr Durchsatz benötigt. Bisherige Ansätze zur Sensibilisierung Studium sind in der Regel schwerfällig mit kontinuierlichen Zellkultur-Wartung sowie eine komplexe Methode zur Messung der cAMP-Akkumulation, die mehrere Waschschritte beinhaltet. Somit wäre die Entwicklung eines robusten Test auf Zellbasis, die für Hochdurchsatz-Screening (HTS) in einem 384-Well-Format verwendet werden können zukünftige Studien erleichtern. Mit zwei D 2-Dopaminrezeptor-Zellmodellen (dh. CHO-D 2L und HEK-AC6 / D 2L), haben wir unsere 48-Well-Assay-Sensibilisierung (> 20 Schritte 4-5 Tage) zu einem Fünf-s umgewandelttep, Tag-Assay in 384-Well-Format. Dieses neue Format ist offen für kleine Molekül-Screening, und wir zeigen, dass dieser Assay-Design kann auch leicht für Reverse Transfektion von siRNA in Erwartung von gezielten siRNA-Bibliothek-Screening verwendet werden.
Introduction
Eine adaptive Adenylatzyklase (AC) Signal Antwort als hetero-oder Super-Sensibilisierung bekannt wurde zuerst im Labor von Nobelpreisträger Dr. Marshall Nirenberg entdeckt. Dr. Nirenberg vorgeschlagen, dass die beobachtete erhöhte AC Reaktionsfähigkeit nach chronischer δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung war ein Mechanismus, bei Opiat-Toleranz und Abhängigkeit 1 beteiligt. Neben chronischen δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung tritt diese neuroadaptive Antwort von AC-Signalisierung auch nach anhaltenden Aktivierung von mehreren anderen Gai / o-gekoppelten Rezeptoren 2. Bemerkenswerterweise sind viele dieser Rezeptoren mit Schmerzen, neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen verbunden und umfassen μ / κ-Opioid-, D 2/4 Dopamin, 5-HT 1A und M 2/4 2-Muskarinrezeptoren. Neben Dr. Nirenberg die Erkenntnisse, eine große Zahl von Hinweisen existiert Verknüpfung Sensibilisierung der AC-Signalisierung, um chronische Opioid-Rezeptor-Aktivierung sowohl
Diese Studien liefern die Begründung für die Untersuchung der Mechanismen zur Sensibilisierung der Adenylatzyklase als wichtige neurobiologische Ziel. Ebenso sollte die physiologische Relevanz der AC Signal 8 und die Bedeutung, die den einzelnen AC-Isoformen in dieser adaptive Reaktion halten auch erkannt, 2,9,10 werden. Im Rahmen der Forschung, die allgemeinen Merkmale mit heterologen Sensibilisierung der rekombinante Isoformen von AC zugeordnet parallel jene Eigenschaften described zur Untersuchung der endogenen Isoformen von AC. Insbesondere frühere Forschung hat festgestellt, dass die Aktivierung von Gai / o Proteine und anschließende Freisetzung / Umlagerung βγ-Untereinheiten sind wichtige Voraussetzungen für die Rezeptor-induzierte Sensibilisierung aller AC-Isoformen. Darüber hinaus lassen sich mehrere Studien, dass die Signalisierung von Proteinkinasen und Gβγ-Untereinheiten sind in 2,11-13 Sensibilisierung beteiligt. Individuelle ACs zeigen auch einzigartigen und unterschiedlichen Mustern 12 Sensibilisierung. Zum Beispiel wird persistent Exposition von D 2-Rezeptoren Agonisten Sensibilisierung AC1 und AC8 Ca 2 + / Calmodulin-Stimulation 14,15 zugeordnet, wohingegen die eng verwandte AC3 nicht sensibilisiert 2. AC2, AC4, und AC7 sind eng miteinander verbunden, jedoch nur PKC-Aktivität stimuliert AC2 kräftig nach längerer Einwirkung von D 2-Rezeptoren sensibilisiert Agonisten 7,14,16,17. Zusätzlich AC5 und AC6 zeigen eine deutliche Grad der Heterologen Sensibilisierung für Gas-und Forskolin-stimulierte cAMP-Akkumulation nach der Aktivierung von D 2-Rezeptoren 14,18-20, scheinen aber in ihrer Forderung nach Gβγ-Untereinheit-AC Wechselwirkungen unterscheiden 21. Obwohl die meisten Studien der AC Sensibilisierung Modellzelllinien (zum Beispiel HEK293-Zellen, die einzelne AC-Isoformen) verwendet wird, scheint es, daß diese Ergebnisse zu übersetzen nativen neuronalen Zellmodellen 4,22. In jüngerer Zeit können die Auswirkungen der AC-Isoform-selektive niedermolekulare Inhibitoren in HEK293-Zellen, die AC-Isoformen identifiziert auch in vivo Verhaltensstudien 23 übersetzt werden.
Das Fehlen eines identifizierten molekularen Mechanismus für die heterologe Sensibilisierung spiegelt wahrscheinlich die Komplexität des adaptiven Reaktion sowie die einzigartigen regulatorischen Eigenschaften der einzelnen AC-Isoformen 12. Die Aufklärung solcher Komplexität wird durch die Verwendung von umständlich Methodik t kompliziertHut hat akademischen Forschern aus der Verwendung unvoreingenommene Ansätze beschränkt. Zum Beispiel beteiligt unseren früheren mechanistischen Studien den Einsatz von kontinuierlich kultiviert zellulären Modellen mit 24 - und 48-Loch-Gewebekultur Format 15. Kultivierte Zellen wurden typischerweise für 48 Stunden gezüchtet und dann auf Agonisten Drogenbehandlung (2-18 h), gefolgt von einer Reihe von Zellen wäscht und Inkubationen (Fig. 1) unterzogen. AC-Isoform-spezifische Akkumulation von cAMP Protokolle wurden dann verwendet, gefolgt von einer Messung der cAMP-Anhäufung unter Verwendung einer arbeits-und zeitaufwendig [3 H] cAMP-Bindemethode 15,24. Die Dauer vom Beginn bis zum Abschluss für jeden Assay benötigt im allgemeinen insgesamt vier bis fünf Tagen von Zelle Plattierung Datenanalyse (Abb. 1). Die Anwendung der neuen Technologien und Automatisierung hat zu deutlichen Verbesserungen für die Sensibilisierung Studien in der Industrie-und HTS-Mittelstellung geführt. Zum Beispiel kann eine Gruppe arbeitet mit dem Nationalen Zentrum für Chemical Genomics berichtet eine zweitägige HTS-Assay-Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des μ-Opioidrezeptor-induzierte Sensibilisierung in 1536 25-well Format.
Der vorliegende Artikel beschreibt unsere Bemühungen um eine HTS-Assay für die Untersuchung der heterologen Sensibilisierung unter Verwendung von Technologien, die in den meisten akademischen Forschungseinrichtungen verfügbar sind, zu entwickeln. Diese Strategie wurde durch Einbringen der Verwendung von kryokonservierten Zellen aus Zellmodellen heterolog exprimieren, die D-2-Dopamin-Rezeptor in Kombination mit endogenen oder einzelne rekombinante Adenylatcyclase-Isoformen (CHO-oder HEK-D 2L-AC6 / D 2 l) gelöst. Um unsere Durchsatz zu verbessern, haben wir unsere neu gestaltete 48-Loch-Sensibilisierung Assay (ca.> 20 Stufen über 4-5 Tage) zu einem Fünf-Schritt-, Einzel-Tagestest in 384-Well-Format, das im Wesentlichen "zu mischen und zu lesen" war. Das neue Format verwendet einen handelsüblichen homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF)-Assay, die cAMP-acc messenumulation in intakten Zellen mit einem Multi-Mode-Plattenlesegerät. Der Assay ist robust und zugänglich für Kleinmolekül-Screening, und kann wirksam angewendet, um nach Inhibitoren von heterologen Sensibilisierung screenen. Zusätzlich stellen wir Daten, die den Einsatz dieses Tests mit reverser Transfektion von siRNA zur gezielten oder genomweite siRNA-Bibliothek-Screening mit nur geringfügiger Modifikation des allgemeinen Ansatzes ermöglicht.
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Protocol
1. Ausbau und Kryokonservierung von Zellen bereit Assay
- Kultur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) Zellen auf einer 15 cm 2-Zellkulturschale in Ham-F12-Medium mit 1,0 &mgr; M L-Glutamin, 800 &mgr; g / &mgr; l G418, 300 &mgr; g / &mgr; l Hygromycin, 100 u / ul ergänzt Penicillin, 100 &mgr; g / &mgr; l Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (FBS).
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2, bis die Zellen 90-95% konfluent. Waschen der Zellen mit 10 &mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) geerntet und die Zellen durch Zugabe von 3 ul Zelldissoziationspuffer für 5 min bei 37 ° C. Resuspendieren der Zellen mit 12 ul der Kulturmedien und zählen Zellen mit Trypanblau-Ausschluss.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 5 ul Gefriermedien (10% Dimethylsulfoxid, 90% FBS). Verdünnte Zellsuspension, um die gewünschte Zellkonzentration (z. B. 1-20 × 10 6 Zellen / &mgr; l) zu erreichen.
- Aliquot 1,0 ul Zelllösung zu jeder Kryoröhrchen. Die Kryoröhrchen in einen Zellgefrierbehaelter Inkubation bei -80 ° C über Nacht. Übertragen Sie die Kryoröhrchen in einen flüssigen N 2-Tank für langfristige Lagerung.
2. Plating Assay Bereit Cells (und umge Transfektion Option)
- Schnell auftauen eine gefrorene Kryoröhrchen von Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Sobald Zellen werden aufgetaut, übertragen Sie die Zellen auf eine 15 ul konische Röhrchen mit 9 ul Opti-MEM, und mischen durch Umdrehen der Röhre 3-5x.
- Zentrifugieren der Zellen bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 1 ul Opti-MEM.
- Zählen der Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss, um die Zellviabilität zu bestimmen, und löst die lebensfähigen Zellen nach Bedarf (z. B.. 3 x 10 5 Zellen / &mgr; l Konzentration) inOpti-MEM. Platte 10 ul / Vertiefung von Zellen in einer Gewebekultur-behandelten 384-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
- Machen serielle Verdünnungen von cAMP in Opti-MEM um eine Standardkurve für die Schätzung cAMP-Produktion der Zellen zu generieren (gemäß der Empfehlungen des Herstellers - siehe Abschnitt 7). In 10 ul / Vertiefung der cAMP-Standards auf die Platte. Hinweis: eine einzelne Standardkurve kann auf einem separaten Teller oder leere Brunnen auf einer der Testplatten hergestellt werden.
- Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 1 Stunde.
3. Reverse-siRNA-Transfektion Option *
Dieser Abschnitt ist optional und relevante auf 3.
- Bereiten Sie eine Lösung von siRNA in RNase-freiem ddH2O (zB 0,4 pmol / ul). In 5 ul einzelnen Vertiefungen von 384-Well-Platte, und die Platte Zentrifuge bei 100 g für 15 sec bei Raumtemperatur.
- Verdünnen Lipofectamine 2000 in Opti-MEM mit einem Faktor von 0,006 (z. B. hinzufügen 6 ul Lipofectamine 2000 bis 1000 ul Opti-MEM) und mischen durch Pipettieren von oben und unten.
- Inkubieren Lipofectamin 2000/Opti-MEM Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Mit 5 ul der verdünnten Lösung Lipofectamin 2000/Opti-MEM einzelnen Vertiefungen 384-Well-Platte, das bereits siRNA. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 s bei Raumtemperatur.
- Inkubiere die Platte für 30 min bei Raumtemperatur.
- Plattentest bereit Zellen, wie oben (Abschnitt 2) beschrieben. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 s bei Raumtemperatur.
- Zurück zu Testplatte befeuchteten Inkubator bei 37 ° C (5% CO 2) für 48-96 h, wie für gezielte Gen-knock down (siehe Diskussion) bestimmt.
4. Small Molecule Screening
- Verdünnen Sie das Medikament von Interesse (zB. Kleinmolekül-Inhibitoren) in Opti-MEM, um die gewünschten Endkonzentrationen 6X. Serielle Verdünnungen können mit Handpipetten oder ein Liquid-Handling-Station abgeschlossen sein.
- Add 2,5 ul / Vertiefung der Testverbindung oder Puffer Fahrzeugs (z. B. DMSO) enthält, an der Seite der Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette.
- Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur (Inkubation ist optional).
5. Persistent Agonist-Behandlung
- Vorbereitung einer 600 nM (dh. 6-fache der gewünschten Endkonzentration von 100 nM) Lösung von Quinpirol in Opti-MEM.
- In 2,5 ul / Vertiefung der 600 nM Quinpirol Lösung an der Seite der Brunnen mit einer Mehrkanalpipette.
- Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 2 Stunden.
6. Die Stimulation der cAMP-Akkumulation
- Während der 2-stündigen Inkubation bereiten die stimulatiauf Lösung in Opti-MEM. Die Stimulation Lösung von 40 &mgr; M Forskolin enthielt 2 &mgr; M 3-Isobutyl-1-methyxanthine (IBMX) und 4 &mgr; M Spiperon (alle Konzentrationen in Schritt 6 werden 4-fache der gewünschten Endkonzentration).
- Mit 5 &mgr; l / Well der Stimulationslösung auf die Seite der Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette.
- Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur, und bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
7. Abschrecken und Abschätzung der cAMP-Akkumulation
- Produktion von cAMP durch die Zellen unter Verwendung des cAMP dynamischen 2-Kit nach den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, rekonstruieren anti-cAMP-Cryptat und cAMP-d2 in destilliertem Wasser. Einfrieren aliquotiert bei -20 ° C für die kurzfristige Lagerung.
- Verdünnen Sie ein Aliquot von anti-cAMP-Cryptat und ein Aliquot der cAMP-D2 separat in der Lyse-Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers, um Arbeitslösungen zu machen.
- Add 10 ul / Vertiefung der Anti-cAMP-Cryptat Arbeitslösung und 10 ul / Vertiefung des cAMP-d2 Arbeits Lösung für das 384-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
- Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur, und bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- Lesen Sie die Platte in einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät (Einstellung für Empfindlichkeit Auto-Skalierung) unter Verwendung einer Anregung von 337 nm und Messung der Emissionen bei 620 nm und 665 nm pro fertigt Anweisungen.
- Nehmen ratiometrische Analyse zu beurteilen cAMP-Standardkurve pro fertigt Anweisungen. Mit den sich daraus ergebenden Werte, extrapolieren die geschätzte cAMP-Akkumulation in den Testvertiefungen mit Datenanalyse-Software.
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Representative Results
Teil I. Die Entwicklung einer 384er heterologe Sensibilisierung Test zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren mit einem kommerziell erhältlichen Zellmodell.
Um heterologe Sensibilisierung in einem Zellmodell zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Verbesserungen, die es uns ermöglicht, den Test in einem "Mix und lesen"-Format zu optimieren. Einige der wichtigsten Änderungen sind unten markiert ist, und werden ausführlicher in der Erörterung beschrieben. Der erste entscheidende Schritt wurde Veränderung unserer Zellkultur von kontinuierlich kultivierten Zellen kryokonservierten Zellen 26. Wir nun routine Kultur Zellchargen, die in Konzentrationen zwischen 1-20 × 10 6 Zellen / &mgr; l kryokonserviert werden können. Für den jeweiligen Assay werden Zellen aufgetaut Aktien, verwässert, gezählt und dann direkt in 384-Well-Platten. Wodurch die Notwendigkeit einer Kulturzeit und die Erhöhung der Bequemlichkeit des Assays. Das Format unserer bisherigen Sensibilisierung Assay verwendet 48-Well-tissue Kulturplatten, und umfasste eine Reihe von Wasch, dekantieren, Transferschritten und einer Filtrationsbasis [3 H] cAMP-Bindungsassay (Abb. 1). Damit dieses Format für die Sensibilisierung war nicht zugänglich Anwendungen mit hohem Durchsatz. Daher ausgeübt haben wir erhebliche Anstrengungen unternommen, um den Test zunächst auf eine 96-Loch-und dann einer 384-Well-Format änderbare Screening mit hohem Durchsatz zu optimieren. Die Optimierung einbezogen Beseitigung der Waschschritte und Auswertung mehrerer Arten von Kultur / Assayplatten, unterschiedlichen Zelldichten und unterschiedlichen Inkubationszeiten. Wir untersuchten auch mehrere Methoden für die cAMP-Erkennung und festgestellt, dass die gut gekennzeichnet HTRF cAMP-Technologie in der vorliegenden Protokoll verwendet wurde, war sehr gut reproduzierbar, zuverlässig und äußerst stabil. Dieser Assay-Plattform basiert auf immunocompetition zwischen der von den Zellen produziert und markiertes cAMP (dh. CAMP-d2) von der cAMP-Kit bereitgestellt werden. Wir haben nun erfolgreich entwickelt und angewendet Protokolle zur heterologen Sensitsierung in 384-Well-Format, die im Wesentlichen "zu mischen und zu lesen" (rechts Abbildung 1).
Unser ursprüngliches Ziel war es, ein Hochdurchsatz-D 2L-Rezeptor Sensibilisierung Test unter Verwendung von handelsüblichen CHO-D 2L-Zellen (menschliche DRD 2L, Zugangsnummer: NM_000795) zu erzeugen, die endogen exprimieren AC6 und AC7 27. Kryokonservierten CHO-D 2L-Zellen wurden mit 3000 Zellen / Napf in 384-well-Zellkulturplatte plattiert und für 1 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator äquilibriert. Die Platten wurden aus dem Inkubator und steigenden Konzentrationen von D-2-Agonisten Quinpirol bei Raumtemperatur zugegeben wurden entfernt. Die Zellen wurden dann für 2 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Cyclische AMP Akkumulation wurde dann durch Zugabe von 10 &mgr; M Forskolin (Direkt Aktivator AC) eingeleitet. Die cAMP-Akkumulation Puffer enthielt ein Phosphodiesterase-Hemmer, Isobutylmethylxanthin (IBMX), Als auch die D 2-Antagonisten, Spiperon (1 &mgr; M, K i für D, 2L = 0,07 nM), um restliches D 2-Rezeptor-Aktivierung während des cAMP Akkumulationsperiode zu verhindern. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Der Test wurde durch Zugabe eines Lyse-Puffer, der die cAMP-HTRF Reagenzien beendet. Die Studien zeigten, dass eine Vorbehandlung mit 2 h Quinpirol verbessert nachfolgenden Forskolin-stimulierte cAMP-Akkumulation in einer dosisabhängigen Weise, die mit heterologen Sensibilisierung (Fig. 2A). Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass die Sensibilisierung Tests können in einer 384-Well-Format durchgeführt werden. Der neue Assay-Format von mehr als 20 bis 4 Stufen verringert die Anzahl von Schritten ohne Wasch-oder Dekantierschritte so dass es ein "Mix and read"-Test (Fig. 1).
Die zweite Reihe von Experimenten untersucht, ob dieses neue, optimierte Assay könnte verwendet werden, um einessess Inhibitoren der Sensibilisierung in CHO-D 2L-Modell. Kryokonservierten CHO-D-2-L-Zellen wurden in einer 384-Well-Gewebekulturplatte in einer Dichte von 3000 Zellen / Vertiefung in Opti-MEM plattiert. Bekannte D 2-Antagonisten wurden hinzugefügt, um D 2-Rezeptor-induzierte Sensibilisierung blockieren. Opti-MEM, enthaltend 100 nM Quinpirol (Endkonzentration) wurde dann in einem Gesamtvolumen von 15 ul zugegeben, und die Zellen wurden für 2 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurde die cAMP-Akkumulation durch die direkte Zugabe von Forskolin (10 &mgr; M Endkonzentration) gestartet und der Test wurde beendet, und cAMP gemessen mit HTRF. Die ersten Ergebnisse zeigten, dass eine Vorbehandlung mit Spiperon oder Haloperidol (prototypische D 2-Antagonisten) vollständig verhindert Quinpirol induzierte Sensibilisierung von Forskolin stimulierten cAMP-Akkumulation (2B). Diese Ergebnisse stellen die Validierung, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, zu identifizieren, werden kleineMolekülinhibitoren von D 2-Rezeptor-induzierten Sensibilisierung. In einem zweiten Experiment verwendeten wir diese Methode, um die Wirksamkeit einer Reihe von D-2-Antagonisten zu bewerten, um zu testen, ob diese Verbindungen hemmen Sensibilisierung. Ähnlich zu den vorherigen Ergebnissen zeigten diese Untersuchungen, dass die D 2-Antagonisten gehemmt Agonisten induzierten Sensibilisierung in einer dosisabhängigen Weise (Fig. 2C). Die Reihenfolge der Wirksamkeit für die Hemmung der Sensibilisierung wurde im Einklang mit ihren Aktionen als D 2-Rezeptor-Antagonisten und ihre zuvor beschriebenen Pharmakologie an D 2-Rezeptoren 28.
Teil II. Die Anwendung der 384-Well-Assay Sensibilisierung für Reverse Transfektion von siRNA in Screening-Bemühungen.
Unser nächstes Ziel war es, eine 384-Well-Assay-Sensibilisierung, die verwendet werden können, um skalierbare Reverse Transfektion siRNA-Bibliothek-Screening durchführen zu entwickeln. Vorläufige Studien warenunter Verwendung einer HEK Zellmodell, das sowohl heterolog D 2L Dopamin-Rezeptoren (Ratte DRD 2L, Zugangsnummer: NM_012547) ausdrückt und AC6 (Ratte ADCY6, Zugangsnummer: NC_005120) (dh HEK-AC6 / D 2L Zellen). Die ersten Experimente bewertet die Fähigkeit von Agonisten induzierten Sensibilisierung AC in der Zelllinie zeigen. Kurz gesagt, wurden kryokonserviert AC6 / D 2L-Zellen in einer 384-Well-Gewebekulturplatte beschichtet (1.000 Zellen / Vertiefung). Opti-MEM, das 1 &mgr; M Quinpirol (Endkonzentration) wurde zu einem Gesamtvolumen von 15 ul zugegeben, und die Zellen wurden für 2 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurde die cAMP-Anreicherung durch die Zugabe von steigenden Konzentrationen von Forskolin ausgelöst. Der Assay wurde durch die Zugabe von Lysepuffer, der HTRF Reagenzien beendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Exposition von Zellen gegenüber dem Agonisten Quinpirol 2 h führte zu einer deutlichen Verbesserung der Forskolin-stimulierten cAMP Akkumulation (Abbildung 3A). Die erhöhte Akkumulation von cAMP an beiden 100 nM und 300 nM von Forskolin war größer als das 15-fache im Vergleich zu Vehikel-behandelten Zellen (Fig. 3A).
Weiter nutzten wir veröffentlicht siRNA Methodologien 29,30, unsere Optimierungsbemühungen, die eine Bewertung der verschiedenen Reverse Transfektionsbedingungen inbegriffen führen (zB Transfektionsreagenzien, Transfektion Effizienz, Zelldichte, Inkubationszeit, etc.). Vorläufige Studien verwendet siGloRed, einen Indikator für die Transfektion in Verbindung mit Lipofectamine 2000 optimale Reverse Transfektion Bedingungen zu bestimmen. Die Experimente zeigten, dass 2-4 pmol siRNA / 5 &mgr; l H 2 O in Verbindung mit 0,03 &mgr; l Lipofectamin 2000/5 &mgr; l Opti-MEM, ein fast 95% Transfektionseffizienz zu 72 Stunden ohne beobachtbare Toxizität in HEK-Zellen (Daten nicht gezeigt). Wir haben dann die Wirkung von Gas siRNA auf heterologe Sensibilisierung untersuchtvon Forskolin stimulierten cAMP-Akkumulation in AC6 / D 2L-Zellen. Die Gas-siRNA wurde als eine mögliche positive Kontrolle vorgeschlagen, weil Gαs wurde als eine Schlüsselkomponente der heterologen Sensibilisierung für mehrere AC-Isoformen (dh AC1, AC2, AC5 und AC6) 19-21 identifiziert worden. Darüber hinaus ist die 15-fach-Signal Sensibilisierung in unserer AC6 / D 2L Zellmodell (Abbildung 3A) bietet eine robuste Signal-Rausch-Fenster, um die Effizienz der reversen Transfektion beurteilen. Unter Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen schlossen wir Vorstudien Beurteilung Gαs siRNA als positive Kontrolle, und unsere Ergebnisse zeigten eine robuste Blockade (> 90%) einer Sensibilisierung (Daten nicht gezeigt).
Die dramatische siRNA-induzierte Reduktion der Sensibilisierung Signal eine entsprechende positive Kontrolle für das Screening-Verfahren siRNA. Um eine quantitative Bewertung für siRNA Screening von AC heterologe Sensibilisierung zu erhalten, erzeugten wir Daten, in deneneinen Z-Faktor wurde für eine Reihe von Testbedingungen über die AC6 / D 2L Zellen 31 berechnet. Für dieses Experiment kombiniert wir 2 pmol Gαs siRNA, oder die Nichtziel siRNA Kontrolle, in 5 ul mit 0,03 ul Lipofectamine 2000/5 ul Opti-MEM pro well in einer 384-Well-Platte (Gesamtvolumen 10 ul). Kryokonservierten Zellen wurden aufgetaut, in Opti-MEM resuspendiert und dann einzelnen Vertiefungen, die siRNA / Lipofectamin-Gemisch mit mehreren Zelldichten aufgenommen (dh. 500-5000 Zellen/10 ul / Vertiefung). Die Dauer der Behandlung Quinpirol (2 Stunden gegenüber 18 Stunden) sowie die endgültige Konzentration von Forskolin (100-300 nM) wurden auch im AC6 / D 2L Sensibilisierung Assay untersucht. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass eine robuste Z-Faktor "wurde in den folgenden Bedingungen erhalten: 750 Zellen / well, 72 h Transfektion Dauer 2 Std. Quinpirol Behandlung und 300 nM Forskolin die cAMP-Akkumulation (3B) zu stimulieren. Unter diesen Cobedingu n gen, erhalten wir einen 15-fach-Sensibilisierung, die Reaktion um 94% in Gegenwart von Gas siRNA reduziert wurde (Z 'von 0,6 für Gαs siRNA vs. Kontrolle siRNA).
1. Im traditionellen Format werden die Zellen in einer 48-Well-Format plattiert und gezüchtet, um über 48 Stunden konfluent. Das Wachstumsmedium wird dekantiert, kleine Moleküle als Inhibitoren zugegeben, gefolgt von der Zugabe von D 2-Agonist ist. Nach 2 Stunden Inkubation wird Testmedium dekantiert und die Zellen in einer Reihe von Wasch / Dekantierschritten unterworfen. Als nächstes AC stimuliert und die Zellen werden lysiert. Cyclische AMP Akkumulation wird dann beurteilt unter Verwendung von [3 H] cAMP-Bindungsassay, der ein 2-Tagestest Filtrationsschritt und Szintillationszählung erforderlich ist. Während die 96-Well-Format EliminierbarkeitATED viele der Waschschritte und dekantieren, fanden wir, dass dieses Format nicht leicht zugänglich HTS oder Automatisierung. Die HTS-Format verwendet kryokonservierten Zellen, die direkt in 384-Well-Platten plattiert. Diese kryokonservierten Zellen sind "testen ready" nach einer 1 Stunde Ausgleich. Nach dieser anfänglichen Inkubation können kleine Molekülinhibitoren zugegeben, gefolgt von der Zugabe von D 2-Agonist für einen 2-stündigen Inkubation werden. Wechselstrom angeregt wird, und die Zellen werden unter Verwendung der HTRF Nachweisreagenzien in der Assayplatte lysiert.
2. Kryokonservierten CHO-D 2L-Zellen wurden direkt in 384-Well-Testplatten mit 3000 Zellen / Vertiefung Steigende Konzentrationen der D 2-Agonist, quinpir ausplattiert und für 1 Stunde. A äquilibriert)ole wurden zugegeben und die Zellen wurden für 2 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Cyclische AMP Akkumulation wurde mit 10 &mgr; M Forskolin (Endkonzentration) in Gegenwart von IBMX Spiperon und für 1 h bei Raumtemperatur stimuliert. Die Reaktion wurde unter Verwendung von cAMP-HTRF-Assay-Reagenzien (n = 1, die für mindestens 3 Versuchen) gequencht. Die Daten sind als prozentuale Reaktion auf den Vehikel-behandelten Zellen exprimiert. Wurden B.) CHO-D 2L-Zellen in Abwesenheit (Kontrolle) oder Gegenwart der angegebenen D 2-Rezeptor-Antagonisten (dh Spiperon oder Haloperidol) vorbehandelt. Chinpirol (100 nM) wurde zugegeben, und die Zellen wurden 2 Stunden inkubiert, um die Sensibilisierung zu induzieren. AC wurde mit 10 &mgr; M Forskolin (Endkonzentration) für 1 Stunde bei Raumtemperatur stimuliert. Cyclic AMP wurde mit HTRF bestimmt. Die Daten sind als prozentuale Reaktion auf den Vehikel-behandelten Zellen. C.) CHO-D 2L-Zellen wurden in Abwesenheit (Kontrolle vorbehandelt ausgedrückt =100%) oder Gegenwart von steigenden Konzentration angegeben D 2-Rezeptor-Antagonisten. Chinpirol (100 nM) wurde zugegeben, und die Zellen wurden 2 Stunden inkubiert, um die Sensibilisierung zu induzieren. AC wurde mit 10 &mgr; M Forskolin (Endkonzentration) für 1 Stunde bei Raumtemperatur stimuliert. Cyclic AMP wurde mit HTRF bestimmt. Die Daten werden als ein Prozent der Quinpirol-induzierte Sensibilisierung Reaktion ausgedrückt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Kryokonservierte HEK-AC6 / D 2L-Zellen wurden mit 1000 Zellen / Vertiefung plattiert und für 1 Stunde äquilibriert. A) Die Zellen wurden mit Vehikel oder 100 nM Quinpirol 2 Stunden in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. AC waS mit steigenden Konzentrationen von Forskolin für 1 h bei Raumtemperatur stimuliert. Cyclic AMP wurde mit HTRF. B.) Reverse-Transfektion von Gas siRNA Blöcke Sensibilisierung in AC6 / D 2L-Zellen bestimmt. Gαs siRNA oder nontargeting siRNA Steuerung (2 pmol) wurde mit 0,03 ul Lipofectamine2000 (Lipo) in einem Gesamtvolumen von 10 ul vereinigt, und die Lösung wurde in einer 384-Well-Platte in die einzelnen Vertiefungen gegeben. Kryokonservierten AC6 / D 2L-Zellen wurden dann für die Rückwärts Transfektion zugegeben und für 70 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Die D 2-Rezeptor-Agonisten Quinpirol (1 &mgr; M final) oder Vehikel zugegeben, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation. Cyclic AMP Akkumulation wurde mit 300 nM Forskolin (Endkonzentration) für 1 h stimuliert und gemessen mit HTRF. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
In einer Bemühung, Studien heterologer Sensibilisierung zu erleichtern, haben wir ausgiebig unseren früheren Methode, die zu einer stromlinienförmigen modifizierten "Mix und lesen"-Format, das änderbare Hochdurchsatz-Screening-und Wirkungsprüfung ist. Die wesentlichen Änderungen in unserem Protokoll kann wie folgt zusammengefasst werden: 1) die Verwendung von kryokonservierten Zellen als "Assay-ready"-Reagenzien, 2) die Miniaturisierung des Assays in 384-Well-Format, und 3) die Verwendung des HTRF-Messung cAMP.
Die Annahme der Kryokonservierung für unsere zellbasierten Assays hat sich stark verbessert Effizienz und Reproduzierbarkeit bei unserem täglichen Experimente und Screening-Bemühungen. Dieser Ansatz ist ein Industriestandard und kann leicht auf die akademische Forschung Einstellung 26 übersetzt werden. Um Zellkultur Effizienz zu verbessern, werden Ampullen von Zellen als "aus dem Regal Reagenzien" in dieser Zelle Lagerbestände sind aufgetaut, verdünnt und dann direkt in 384-Well-Platten überzogen for jeden Test. Wir haben vorher kryokonservierten Zellen in Studien zu identifizieren Antagonisten von wirbellosen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 32,33 gerichtet eingebaut. Diese Methode war, dass die ersten Arbeiten konnte nicht in unserem Labor durchgeführt und erforderte den Transport von kultivierten Zellen über den Campus, die Herausforderungen präsentiert und wahrscheinlich eingeführt Variabilität vorteilhaft. Mit Hilfe unserer neuen Ansatz können nun sofort eingefrorenen Zellen aufgetaut und vor Ort verdünnt werden vor Beginn des Assays. Neben der Verbesserung der Reproduzierbarkeit, Kryokonservierung beseitigt auch die 48 Stunden Zeitraum von Zelle Plattierung Assay Ausführung (Abbildung 1). Wir haben erfolgreich angewendet die Kryokonservierung Ansatz in stabile und transiente Transfektion Studien mit einer Vielzahl von rekombinanten Rezeptoren und Subtypen von ACs mit Funktionsanzeigen einschließlich cAMP-Akkumulation und β-Arrestin Rekrutierung (Brust, TF, Ejendal, KFK, und Watts, VJ unveröffentlichte Beobachtungen) . DesPite unsere positiven Erfahrungen sollten die Forscher überprüfen, ob ihre Rezeptor-oder Ziel und Modellzellsystem ist mit Kryokonservierung vor Beginn keine groß angelegte Studien kompatibel.
Eine zweite Änderung, die wichtig für unsere Bemühungen, die Sensibilisierung Test beteiligten Beseitigung der dekantieren straffen und Waschschritte (Abbildung 1) war. Diese Veränderungen waren mit unserer gleichzeitig eine Miniaturisierung des Tests auf eine 96-Well-Format (Conley und Watts, unveröffentlichte Beobachtungen). Insbesondere wurde eine modifizierte Sensibilisierung Protokoll entwickelt, wo cAMP-Akkumulation durch die direkte Zugabe von Forskolin in Assay-Puffer folgende D-2-Agonisten Inkubation in Abwesenheit von Wasch oder dekantieren Schritte eingeleitet (siehe Mitteltafel Abbildung 1). Zusätzlich enthielt die cAMP-Akkumulation Puffer eine relativ hohe Konzentration von Spiperon (1 uM), eine D 2-Antagonist, einen Ki-Wert von 0,07 nM für D 2 hat15 Rezeptoren. Diese 100-fach Über Konzentration von Spiperon Ergebnisse in komplett D 2-Rezeptor-Besatzung während des cAMP-Akkumulationsphase, wodurch Rest D 2-Rezeptor-Aktivierung durch Agonisten (zB Quinpirol) während der Forskolin stimuliert AC Schritt entgegensteht 15. Diese Änderung beseitigt die drei dekantieren und drei Waschschritte nach der ersten Inkubation Agonisten. Im Rahmen der 96-Well-Format-Entwicklung, waren wir auch in der Lage, um die endgültige dekantieren Schritt vor dem Abschrecken und Lyse der Zellen zu beseitigen. (. Dh TCA Trichloressigsäure) 3-9% und Zugabe des Reagenz direkt mit dem cAMP Akkumulationspuffer Diese Modifikation wurde durch Erhöhen der Konzentration der lysierenden Reagens erreicht. Die vielversprechenden Ergebnisse des modifizierten 96-Well-Assay Sensibilisierung unterstützte die Umwandlung des Sensibilisierungstest an einer 384-Well-Format. Leider unsere bisherigen Methodik zur Quantifizierung von cAMP war eine mühsame filtration-Basis [3 H] cAMP-Proteinbindeversuch (> 5 Stufen). Zum Beispiel wird der Test in der Regel im Verlauf von zwei Tagen für Trocknungsfilter und Szintillationszählung 15,24 ermöglichen. Diese Nachteile hat die [3 H] cAMP Proteinbindung unpraktisch für ein Hochdurchsatz-384-Well-Format zu nutzen.
Die dritte wichtige Entwicklung kam durch den Einbau von Methoden zur Messung und Quantifizierung von cAMP in einer Weise zugänglich zu 384-Well-Format. Zum Beispiel haben wir umfangreiche Erfahrung mit einer cAMP-Response-Element (CRE)-Luciferase-Reportersystem auf Basis der relativen cAMP-Messungen in einem 384-Well-Format 32,33. Obwohl dieser Ansatz wurde erfolgreich von unserem Labor für viele Studien von Gas-gekoppelten Rezeptoren verwendet werden, sind Gegenstand einer Reihe von falschen Positiven und Negativen in Screening-Assays 34 CRE-luc Reportern. Zusätzlich unsere vorläufigen D 2 Sensibilisierung Studien mit dieser AppPlötze wurden nicht ermutigend, dass wir beobachteten scheinbaren Feedback-Hemmung der Luciferase-Signal (Daten nicht gezeigt). Daher konzentrieren wir unsere Bemühungen zur Umsetzung der GloSensor cAMP-Technologie durch die Konstruktion und Charakterisierung von stabilen Zelllinien mit ihren beiden "ersten" und "zweiten" Generation GloSensor Vektoren. Die GloSensor ist eine gentechnisch Luciferase-Reporter, die ein cAMP-Bindungsstelle innerhalb des Luciferase-Protein 35. Obwohl das System sehr nützlich für kinetische cAMP Quantifizierung wurde das Verfahren nicht wirksam zur Messung Agonisten induzierten Sensibilisierung (Conley und Watts, unveröffentlichte Beobachtungen). Wir haben auch untersucht eine cAMP BRET basierte Biosensor-36 für unsere Studien als kostengünstiges Mittel, um cAMP-Akkumulation zu beurteilen. Leider ist die Hintergrundgeräusche mit der transient Biosensor Dritter unsere Fähigkeit, diese Methode, um unsere Sensibilisierung Assay anzupassen. Schließlich untersuchten wir mehrere Kits Einsatz homogene zeitaufgelöste Fluorescence (HTRF) als Ansatz zur cAMP in 384-Well-Format zu messen. Wir haben festgestellt, dass diese Methode etabliert war mit akademischen Laboratorien und Screening-Einrichtungen, dass sie robust, sensibel, stabil und einfach zu bedienen waren die meisten kompatibel. Der Hauptnachteil für akademische Forscher die Kosten der Reagenzien, aber Ankauf von Reagenzien und Miniaturisierung zu 384 Well-Format macht der Preis mehr als mit anderen Kits, einschließlich ELISA-Assays und unsere bisherigen "hausgemachten" [3 H] cAMP-Protein Wettbewerbs Bindungsassay 15.
Der Vertreter Arbeit zeigt die Anwendbarkeit der 384er Assay Sensibilisierung Studien von D 2-Dopaminrezeptor-induzierte Sensibilisierung AC Signalisierung in rekombinanten Zelllinien. In mehreren Vorstudien haben wir diesen Test mit geringfügigen Änderungen zu D 2-Dopaminrezeptor beurteilen verwendet und μ-Opioidrezeptor-induzierte Sensibilisierung der verschiedenen AC-Isoformen (Tabelle 1). Diese Studien belegen die allgemeine Anwendbarkeit des 384-Well-Assay auf mehrere Zelllinien, Rezeptor-Subtypen und AC-Isoformen. Wer Interesse an der Entwicklung ähnlicher Testformate würden ermutigt, Variablen wie Zelldichte, Agonist Vorbehandlungszeiten, AC-Aktivierung Protokolle / Bedingungen und HTRF cAMP Nachweisverfahren für ihre zellulären Modellen erkunden. Die Antagonisten hierin präsentierten Daten zeigen die Fähigkeit des Assays, um kleine Moleküle als Inhibitoren der Sensibilisierung zu ermitteln. Die Wirksamkeitswerte stimmen mit denen mit anderen funktionellen Assays 28 sowie Werte Affinität (Ki) mit Radiorezeptorbindungsassays erhalten wird (siehe: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). Die vorliegende Assay-Design ohne weiteres aufnehmen HTS Bemühungen, wo Verbindungen werden über eine pintool geliefert oder in Testplatten vorplattiert bereit. Zusätzlich zu den beschriebenen Sensibilisierung Assays sollten die hier angewandten Methoden auf andere Werbung stehenaptive Assays, bei denen mehrere Medikamente / Reagenzien vor einem Endpunkt Maßnahme in 384-Well-Format angelegt.
Wir haben uns bemüht, wichtige Entwicklungsschritte für die gesamte 384-Well-Assay zu markieren, sondern wollen auch zu beachten, dass die Entwicklung der Rückwärts Transfektion siRNA-Assays war eine besondere Herausforderung. Unser langfristiges Ziel für diese Tests ist es, eine genomweite Anstrengungen, um die sich überlappenden und einzigartigen Gene in heterologen Sensibilisierung der AC-Isoformen beteiligt sind durchzuführen. Mit unserem ersten Test siRNA als Richtlinie, bieten wir die folgenden abgekürzt Vorschläge für die Entwicklung eines Reverse-siRNA-Transfektion Assays: (1) zu untersuchen Transfektionseffizienz mit Verhältnissen von einem Indikator wie Siglo und Transfektionsreagenz (. ZB Lipofectamine 2000), (2) Bestimmung der optimalen Aussaatdichte (z. B. 500-5000 Zellen / Vertiefung), (3) zu erkunden Transfektion Dauer (z. B. 48 bis 96 h) und (4) zu beurteilen entsprechenden Testbedingungen (z. B. Drogen treatments, Endpunkt Maßnahmen und robusten Kontrollen) für eine optimale Signal (z. B. Z-Faktor-Analyse). Weitere Einzelheiten und mehr allgemeine Informationen für den Einsatz von siRNA in Screening-Bemühungen auch in den zuvor erwähnten Methoden 29,30 Artikel gefunden werden. Jene Forscher, die sich für HTS Bemühungen sollte auch die Anpassungsfähigkeit ihrer Untersuchungen zu erforschen, um Automation (zB. Pintool und Robotik). Darüber hinaus sind andere Faktoren oder Kontrollen für das Screening Bemühungen umfassen formale Assay-Validierung, die Lebensfähigkeit der Zellen-Tests und entsprechende Gegen Bildschirme. Zur zusätzlichen Führung, würde der interessierte Leser aufgefordert, die NCGC Assay Guidance-Handbuch unter durch NCATS verfügbar untersuchen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.
Wir haben unseren Ansatz für die Optimierung einer mühsamen mehrtägigen Test in eine effiziente "Mix und lesen"-Test, der in einem einzigen Tag durchgeführt werden kann, beschrieben. Die hier beschriebenen Methoden und einaktuellen Studie von 1.280 Verbindungen in μopioid Rezeptor induzierte Sensibilisierung in 1536-well Format 25 legt nahe, dass Sensibilisierung kann jetzt leicht mit HTS abgefragt werden. Der hier beschriebene Assay ist zugänglich für Kleinmolekül-Tests und kann auf genetische Ansätze wie siRNA angewendet werden. Unsere Test-Format basiert auf dem adaptiven Antwort als heterologe Sensibilisierung von AC bekannt konzentriert, jedoch kann der allgemeine Ansatz und Methoden weit verbreitet, um andere zellbasierte Tests, die mehrere Drogen-und Reagenzzugaben (. ZB Desensibilisierung und Neuroprotektion) angewendet werden. Die Arbeit hier berichtet wird, einfach in einem akademischen Umfeld mit Mehrkanalpipetten und einem Multi-Mode-Plattenlesegerät lesen kann den gewünschten Endpunkt in 384-Well-Format durchgeführt.
Tabelle 1. Zellmodelle für Agonisten induzierten Sensibilisierung getestet.
| Rezeptor | AC Isoform | Die Zelllinie | Sensibilisierung Signal |
| D 2L Dopamin | Endogene (AC6 und AC7 27) | CHO-D 2L | 2-3 fach |
| D 2L Dopamin | Rekombinante AC2, AC5 und AC6 | HEK 293 stabil transfizierten | AC2 = 2-3 fach AC5 = 50-fach AC6 = 15-fach |
| μ-Opioid | Rekombinante AC1, AC2 und AC5 | HEK 293 stabil transfizierten | AC1 = 6-7 fach AC2 = 2-3 fach AC5 = 10-15 fach |
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Herrn Richard Zink und Todd Wiernicki für methodische Ausbildung und Assay-Führung zu bestätigen. Wir danken auch John Paul Spence für sorgfältiges Lesen und redaktionelle Vorschläge. Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, und Eli Lilly and Company über den Lilly Research Award-Programm (LRAP) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
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