Summary
アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。
Abstract
アデニル酸シクラーゼ（AC）シグナル伝達の感作は、薬物乱用やパーキンソン病などの神経精神や神経疾患の様々に関与している。のGαi/ o-ジ連結型受容体の急性の活性化は、AC活性を阻害する、ACの異種感作におけるこれらの受容体の持続的活性化および細胞内cAMPのレベルの増加に対し。以前の研究は、AC応答のこの増強は、D 2ドーパミンなどのオピオイド受容体μのGαi/ oの連結型受容体のいくつかのタイプの慢性的活性化に続いて、インビトロおよびインビボの両方で観察されることを実証した。交流の異種感作が最初に4年前に報告されたが、この現象の根底にあるメカニズムはほとんどわかっていない。機械論的データの欠如は、おそらく偏りのないアプローチが識別するのを補助できることを示唆し、この適応応答に関与複雑さを反映している交流の異種感作に関与する分子経路をING。これまでの研究では、交流の異種感を調整するコンポーネントの重複などのキナーゼとGbγシグナリングを示唆されている。交流の感作に関連したユニークで、追加の重複標的を同定するために、拡張性のcAMPの感作アッセイの開発と検証がより大きなスループットが必要になります。感作を研究する従来のアプローチは、連続的な細胞培養維持だけでなく、複数の洗浄工程を伴うcAMP蓄積を測定するための複雑な方法論を含む一般扱いにくい。これにより、384ウェルフォーマットでハイスループットスクリーニング（HTS）のために使用することができる強固な細胞ベースのアッセイの開発は、将来の研究を容易にするであろう。 2、D 2ドーパミン受容細胞モデル（ すなわち 。CHO-D 2LおよびHEK-AC6 / D 2L）を使用して、我々は5-Sに私達の48ウェル感アッセイ（> 20ステップ4〜5日間）に変換しているTEP、384ウェルフォーマットにおける単一日間のアッセイ。この新しいフォーマットは、小分子のスクリーニングに適している、と我々は、このアッセイの設計も容易に標的とするsiRNAライブラリースクリーニングを予想してsiRNAのリバーストランスフェクションのために使用することができることを実証している。
Introduction
異種または超感として知られている適応型アデニル酸シクラーゼ（AC）シグナル応答が最初にノーベル賞受賞者、博士マーシャルニーレンバーグの研究室で発見された。博士ニーレンバーグ、慢性δオピオイド受容体の活性化後に観察増加交流応答性はアヘン耐性および依存性1に関与する機構であったことを提案した。慢性δオピオイド受容体の活性化に加えて、交流信号伝達のこの神経適応応答は、他のいくつかののGαi/ O共役受容体2の持続的な活性化に続いて発生します。注目すべきことに、これらの受容体の多くは、痛み、神経精神障害および神経障害に関連する、μ/κオピオイド、D 2月4日 、ドーパミン、5HT 1AおよびM 2/4ムスカリン受容体2が含まれています。博士ニーレンバーグの調査結果に加えて、多くの証拠は、両方の慢性オピオイド受容体の活性化にACシグナリングの感作を結ぶ存在
これらの研究は、重要な神経生物学的ターゲットとしてアデニル酸シクラーゼの感作のためのメカニズムを調べるための理論的根拠を提供する。同様に、個々のACアイソフォームは、この適応応答で開催8シグナリング交流の生理的関連性と重要性も2,9,10を認識すべきである。我々の研究の文脈において、ACの組換えアイソフォームの異種感作に関連する一般的な特徴は、それらの特性をパラレルデ交流の内因性のアイソフォームを研究するためcribed。具体的には、これまでの研究では、Gαiを/ Oタンパク質および後続のリリース/再配置βγサブユニットの活性化は、すべてのACアイソフォームの受容体誘起感のために重要な要件であることを発見した。さらに、いくつかの研究は、タンパク質キナーゼおよびGβγサブユニットからの信号を感作2,11-13に関与していることを示唆している。個々のACSでは、ユニークで明確な感パターン12が表示されます。密接に関連AC3を2増感されていないのに対し、例えば、アゴニストに対するD 2受容体の持続的な露出は、Ca 2 +の/カルモジュリン刺激14,15にAC1及びAC8の感作に関連している。 AC2、AC4、およびAC7は密接に関係しているが、しかし、唯一のPKC-刺激されたAC2活性は堅牢にアゴニスト7,14,16,17にD 2受容体の長期暴露後の増感されている。さらに、AC5およびAC6はheterの著しい度合いを示しているologous D 2受容体14,18-20の活性化に続いてガスとフォルスコリン刺激cAMP蓄積への感作が、Gβγサブユニット-交流の相互作用21のために彼らの要件が異なっているように見える。 AC感作のほとんどの研究は、モデル細胞株（ 例えば、HEK293細胞は、個々のACアイソフォームを発現する）を使用したが、これらの知見は、天然の神経細胞モデル4,22に変換するようである。より最近では、ACアイソフォームを発現するHEK293細胞において同定されたACアイソフォーム選択的小分子阻害剤の効果はまた、 インビボ行動研究23に変換することができる。
異種感作のために特定の分子メカニズムの欠如はおそらく適応応答の複雑さだけでなく、個々のAC 12アイソフォームのユニークな調節特性を反映している。このような複雑さの解明をさらに面倒な方法論tの使用により複雑である帽子は公平なアプローチを採用することから、学術研究者が限られている。そして48ウェル組織培養フォーマット15 -たとえば、私たちの前の機械論的研究では、24を使用して継続的に培養された細胞モデルの使用を含んだ。培養した細胞は通常、48時間増殖させた後、細胞の洗浄及びインキュベーションのシリーズ（ 図1）に続いて、アゴニスト薬物治療（2月18日時間）にかけた。 ACアイソフォーム特異的cAMP蓄積プロトコルが次に方法論15,24を結合面倒で時間がかかる[3 H] cAMPを用いたcAMP蓄積を測定し使用した。各アッセイのために最初から最後までの期間は、通常、細胞播種からデータ分析（ 図1）に四から五日間の合計を必要とした。新しい技術や自動化の適用は産業およびHTSセンターの設定で感作性試験のためにマークの強化につながっている。たとえば、グループはケミコンのためのナショナルセンターでの作業校正ゲノミクスは、2日は1,536ウェルフォーマット25にμオピオイド受容体誘発される感作の小分子阻害剤を同定するためのアッセイ方法をHTS報告した。
本稿では、ほとんどの学術研究機関で利用できる技術を使用して、異種感の研究のためのHTSアッセイを開発するための取り組みを説明します。この戦略は、異種内因性または個々の組換えアデニリルシクラーゼアイソフォーム（CHO-D 2L又はHEK-AC6 / D 2 L）との組み合わせでD 2ドーパミン受容体を発現する細胞モデルからの凍結保存細胞の使用を組み込むことによって達成された。私たちのスループットを向上させるために、我々は基本的に「ミックス読み」だった384ウェルフォーマットで5段階の、一日アッセイに私達の48ウェル感アッセイ（4-5日間の約 > 20ステップ）を再設計。新しいフォーマットは、cAMPのACCを測定するために、市販の均一時間分解蛍光（HTRF）アッセイを使用していますマルチモードプレートリーダーを用いて無傷の細胞内umulation。アッセイは、堅牢で、小分子のスクリーニングに適している、そして効果的に異種感作の阻害剤をスクリーニングするために適用することができる。加えて、我々は一般的なアプローチへのわずかな修正を加えてターゲットまたは全ゲノムのsiRNAライブラリースクリーニングのためのsiRNAのリバーストランスフェクションで、このアッセイを使用することを可能にするデータを提供する。
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Protocol
1。アッセイレディ細胞の増殖および凍結保存
- 1.0100μMのL-グルタミン、800μgの/μLG418、300μgの/μLハイグロ、100 U /μLを補ったハムF12培地さ15cm 2細胞培養ディッシュ上で培養したCHO-K1-DRD 2L（CHO-D 2L）は、細胞ペニシリン、100μg/ml/μlのストレプトマイシン、及び10％ウシ胎児血清（FBS）。
- 細胞が90〜95％コンフルエントになるまで、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートする。 10μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、37℃で5分間、細胞解離緩衝液3μlのを添加することにより細胞を採取培養液12μlのを使用して細胞を再懸濁し、トリパンブルー排除を用いて細胞を数える。
- 室温で5分間、500×gで細胞懸濁液を遠心分離する。上清を吸引除去し、凍結培地を5μl（10％ジメチルスルホキシド、90％Fで細胞ペレットを再懸濁BS）。所望の細胞濃度（ 例えば、1〜20×10 6細胞/μl）を達成するために、細胞懸濁液を希釈する。
- 各クライオバイアルに細胞溶液の一定量1.0μL。 -80℃で一晩細胞凍結容器中の凍結バイアルをインキュベートします。長期保存のために液体窒素タンクに凍結バイアルを転送します。
2。アッセイレディ細胞（およびリバーストランスフェクションオプション）メッキ
- 急速に37℃の水浴中で細胞の凍結クライオバイアルを解凍する。細胞を解凍したら、のOpti-MEM 9μLを含む15μlのコニカルチューブに細胞を移し、チューブ3-5X転倒混和。
- 室温で5分間、500×gで細胞を遠心分離する。上清を吸引し、1μLのOpti-MEM中で細胞を再懸濁。
- 細胞生存率を決定し、必要に応じて（ 例えば、図3×10 5細胞/μlの濃度）中で生存細胞を希釈し、トリパンブルー排除を用いて細胞を数えるのOpti-MEM。組織培養中の細胞のプレートに10μl/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、384ウェルプレートを処理した。
- （勧告を製造していますによると - セクション7を参照）細胞によるcAMP産生を推定するための標準曲線を作成するのOpti-MEM中のcAMPの連続希釈液を作る。プレートにcAMP標準の10μL/ウェルを追加します（注）。単一の標準曲線は、アッセイプレートの1に別のプレートやブランクウェルに調製することができる。
- 室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。
3。 * siRNAトランスフェクション·オプションを逆転
このセクションでは、図3にはオプションと関連しています。
- RNaseフリーのddH 2 O（ 例えば 0.4ピコモル/μL）でのsiRNAの溶液を調製する。 384ウェルプレートの各ウェルに5μLを追加し、15 SEの100×gで遠心プレート室温でC。
- 0.006倍のOpti-MEM中でリポフェクタミン2000を希釈（ 例えばのOpti-MEM千μlにリポフェクタミン2000の6μLを加える）、そして上下にピペッティングにより混和する。
- 室温で5分間、リポフェクタミン2000/Opti-MEM溶液をインキュベートする。すでにsiRNAのが含まれている384ウェルプレートの各ウェルに希釈したリポフェクタミン2000/Opti-MEM溶液5μlを加える。室温で15秒間100×gでプレートを遠心分離する。
- 室温で30分間プレートをインキュベートする。
- 上記のようなプレートアッセイ準備細胞（第2節）。室温で15秒間100×gでプレートを遠心分離する。
- （説明を参照してください）ノックダウン標的遺伝子のために決定された48〜96時間、37℃（5％CO 2）の加湿インキュベーターにアッセイプレートを返します。
4。低分子スクリーニング
- オプティに目的の薬物（ 例えば、小分子阻害剤）を希釈する-MEM所望の最終濃度が6倍にする。連続希釈は、手持ちピペット又は液体ハンドリングステーションを使用して完成させることができる。
- 試験化合物の2.5μL/ウェルを追加したり、マルチチャンネルピ ペットを用いて、ウェルの側に車両（ 例えば 、DMSO）を含有する緩衝液。
- 遠心分離機、室温で15秒間、100×gでプレート（インキュベーションはオプションです）。
5。永続的なアゴニスト治療
- のOpti-MEM中キンピロールの600 nMの（ すなわち 。100 nMでの6回の所望の最終濃度）溶液を調製する。
- 2.5μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、ウェルの側に600 nMのキンピロールソリューションを追加します。
- 室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、2時間、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。
6。のcAMP蓄積の刺激
- 2時間のインキュベーションの間、stimulatiを準備のOpti-MEM内の溶液に。刺激溶液を、40μMのフォルスコリン、2μMの3 - イソブチル-1 - methyxanthine（IBMX）、及び4μMのスピペロン（ステップ6における全ての濃度は、所望の最終濃度を4倍している）から構成されている。
- 5μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、ウェルの側面に刺激溶液を加える。
- 室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間室温でインキュベートする。
7。 cAMPの蓄積の消光と評価
- 細胞によるcAMPの産生を、製造業者の説明書に従ってcAMPのダイナミック2キットを用いて測定される。簡潔には、蒸留水中の抗cAMP-クリプテートおよびcAMP-d2とを再構成する。短期保存のために-20℃で一定分量を凍結する。
- 作業溶液を作るために製造業者の指示に従って溶解緩衝液中で別々に抗cAMP-クリプテートおよびcAMP-D2の一方のアリコートつのアリコートを希釈する。
- ADD抗cAMP-クリプ作業溶液および10μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、384ウェルプレートにcAMPの-D2の作業溶液の10μlの/ウェル。
- 室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間室温でインキュベートする。
- 337 nmの励起を用いた蛍光プレートリーダー（感度の自動スケール設定）でプレートを読んで、あたりの620 nmおよび665 nmでの排出量を測定する指示を製造しています。
- 指示を製造してあたりのcAMP標準曲線を評価するためのレシオメトリック分析を適用します。得られた値を用いて、データ解析ソフトウェアを用いて、試験ウェル中の推定されたcAMP蓄積を推定する。
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Representative Results
パートI.市販の細胞モデルを用いた小分子阻害剤を同定するための384ウェルの異種感作アッセイを開発する。
細胞モデルにおける異種感作を検討するために、私たちは "混ぜて読む」フォーマットに分析を効率化することができました多くの改良を行いました。キー修飾のいくつかは、以下の強調表示され、議論においてより詳細に記載されている。最初の重要なステップは、凍結保存した細胞26に連続的に培養した細胞から私たちの細胞培養を修正しました。現在、日常的に1〜20×10 6細胞/μlの濃度で細胞の培養バッチを凍結保存することができる。それぞれのアッセイのために、細胞ストックを解凍し、希釈し、計数し、次いで384ウェルプレートに直接播種する。培養期間の必要性を排除し、アッセイの利便性を増大させる。我々の以前の感作アッセイのフォーマットは、48ウェルTISS利用UE培養プレート、および、洗浄、デカント、転写工程、および（ 図1）結合アッセイろ過ベースの[3 H] cAMPの数を含んでいた。このように、感作のためのこの形式は、ハイスループットのアプリケーションに適していないでした。したがって、我々は、96ウェルハイスループットスクリーニングに修正可能次いで384ウェルフォーマットに第アッセイを合理化するため多大な努力を発揮した。最適化は、細胞密度、および異なるインキュベーション期間を変化させる、洗浄工程及び培養/アッセイプレートの複数のタイプの評価の除去を含んだ。我々はまた、cAMPの検出のためのいくつかの方法論を模索し、現在のプロトコルで使用される十分に特徴づけのHTRF cAMPの技術は高度に再現可能で信頼性が高く、非常に安定していたことがわかった。このアッセイプラットフォームは、キットで提供される細胞により産生され、キャンプ（ すなわち 。のcAMP-D2）ラベルされたcAMPの間immunocompetitionに基づいています。これで成功し、異種sensitのためのプロトコルを開発し、適用している本質的に384ウェルフォーマットでブリダイゼーション（右パネル図1）」を混合して読み出す"。
内因的にAC6とAC7 27を発現する：我々の最初の目標は、市販のCHO-D 2L細胞 （NM_000795ヒトDRD 2L、アクセッション番号）を用いてハイスループットD 2L受容体の感作アッセイを生成することであった。凍結保存されたCHO-D 2L細胞を、ウェル、384ウェル組織培養プレート中に3,000細胞/で播種し、そして加湿インキュベーター中、37℃で1時間平衡化した。プレートをインキュベーター、室温で添加したキンピロールD 2作動薬の濃度の増加から除去した。次いで、細胞を加湿インキュベーター中、37℃で2時間インキュベートした。サイクリックAMPの蓄積は、その後、10μMフォルスコリン（ACの直接的な活性化剤）の添加により開始した。 cAMP蓄積バッファは、ホスホジエステラーゼ阻害剤、イソブチルメチルキサンチン（IBMXを含有）だけでなく、D 2拮抗薬、スピペロン（1μM、K I D、2L = 0.07 nM）をするため、cAMP蓄積期間中に残留するD 2受容体の活性化を排除するためである。細胞を室温で1時間インキュベートした。アッセイは、HTRF cAMPの試薬を含む溶解緩衝液の添加により停止させた。研究は、キンピロールで2時間の前処理は、異種感作（ 図2A）と一致して用量依存的に後続のフォルスコリン刺激cAMP蓄積を増強することを明らかにした。この実験の結果は、感作アッセイは、384ウェル形式で行うことができることを実証している。新しいアッセイ形式は、それ作る洗浄液やデカント工程の必要性「ミックス読み」アッセイ（ 図1）することなく、以上の20から4ステップからのステップ数を減少させた。
第二の一連の実験は、この新しいアッセイは流線型に利用することができるかどうかを調査しCHO-D 2Lモデルで感作のssess阻害剤。凍結保存されたCHO-D 2 L細胞/ウェルのOpti-MEMで3,000細胞の密度で384ウェル組織培養プレートに播種した。既知のD 2アンタゴニストは、D 2受容体によって誘発される感作をブロックするために追加されました。 100nMのキンピロール（最終濃度）を含有のOpti-MEM次いで、15μlの総体積に添加し、細胞を加湿インキュベーター中、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、cAMP蓄積を、フォルスコリン（最終濃度10μM）の直接添加により開始し、アッセイを終了し、cAMPはHTRFを用いて測定した。初期の結果は、フォルスコリンのスピペロンやハロペリドール（プロトタイプD 2拮抗薬）を用いた前処理を完全に防止キンピロール誘発性感がcAMP蓄積（ 図2B）を刺激したことを明らかにした。これらの結果は、このアプローチが小識別するために利用することができることを検証を提供D 2受容体によって誘発される感作の分子阻害剤。第2の実験では、我々は、これらの化合物が感作を阻害するかどうかを試験するためにD 2アンタゴニストの一連の効力を評価するためにこの方法を用いる。以前の結果と同様に、これらの研究はD 2アンタゴニストは、用量依存的に（ 図2C）中のアゴニスト誘導性感作を阻害することを実証した。感作の抑制のための効力の順位は、D 2受容体拮抗薬とD 2受容体28で彼らの前に説明した薬理学としての彼らの行動と一致した。
パートII。スクリーニングの努力でのsiRNAのトランスフェクションのための逆方向384ウェル増感アッセイのアプリケーション。
我々の次の目的は、スケーラブルなリバーストランスフェクションsiRNAライブラリーのスクリーニングを行うために使用することができる384ウェル感作アッセイを開発することであった。予備研究であったおよびAC6（ラットADCY6、アクセッション番号：NC_005120）（ すなわち、HEK-AC6 / D 2L細胞 ）異種D 2Lドーパミン受容体（NM_012547ラットDRD 2L、アクセッション番号）の両方を発現するHEK細胞モデルを用いて行った。最初の実験は、細胞株におけるACのアゴニスト誘導性感作を示す能力を評価した。簡潔には、凍結保存さAC6 / D 2L細胞を、384ウェル組織培養プレート中で（1,000細胞/ウェル）を播種した。 1μMのキンピロール（最終濃度）を含有のOpti-MEMを、15μlの総体積に添加し、細胞を加湿インキュベーター中、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、cAMP蓄積を、漸増濃度のフォルスコリンの添加により開始した。アッセイは、HTRF試薬を含む溶解緩衝液の添加により停止させた。結果は2時間アゴニストキンピロールへの細胞の曝露は、フォルスコリン刺激カムの著しい向上につながったことを明らかにしたPの蓄積（ 図3A）。 100 nMおよびフォルスコリンの300 nMの両方でのcAMPの蓄積の増加は、ビヒクルで処理した細胞（ 図3A）と比較して15倍よりも大きかった。
次に、我々は、公開されたsiRNAを用いる種々のリバーストランスフェクション条件の評価に含まれる最適化の努力を導くために29,30を方法論（ 例えば、トランスフェクション試薬、トランスフェクション効率、細胞密度、インキュベーション時間、等 ）。予備研究は、最適なリバーストランスフェクション条件を決定するために、リポフェクタミン2000と組み合わせて、トランスフェクションのインジケータをsiGloRedを使用した。実験は0.03μlのリポフェクタミン5分の2000μlののOpti-MEMと組み合わせる2-4ピコモルのsiRNA /5μlのH 2 O（データは示さず）HEK細胞において観察可能な毒性なしに72時間でほぼ95％のトランスフェクション効率を提供することを示した。次に、異種感作性に関するGαsでsiRNAの効果を検討したフォルスコリンAC6 / D 2L細胞においてcAMP蓄積を刺激した。 Gαsでは、いくつかのACアイソフォーム（すなわち AC1、AC2、AC5およびAC6）19〜21のための異種感作の重要な要素として認識されているので、ガスsiRNAは、潜在的なポジティブコントロールとして提案された。さらに、我々のAC6 / D 2L細胞モデル （ 図3A）での15倍感信号はリバーストランスフェクションの効率を評価するために、ノイズウィンドウに強いシグナルを提供しています。上記の条件を用いて、我々は、陽性対照としてのGαsのsiRNAを評価する予備研究を完了し、我々の結果は、感作（データは示さず）のロバスト遮断（> 90％）を示した。
感作信号の劇的siRNAによる削減は、siRNAスクリーニング工程のための適切なポジティブコントロールを提供します。 AC異種感作のsiRNAスクリーニングのためのより定量的な評価を得るために、我々は、データを生成しZ '因子は、AC6 / D 2Lセル 31を用いた試験条件のシリーズを計算した。この実験のために、我々は0.03μLリポフェクタミン5分の2000 384ウェルプレート（総量10μl）の中のウェルあたりμLのOpti-MEMで5μLで、2ピコモルのGαsのsiRNA、または非標的とするsiRNAコントロールを組み合わせる。凍結保存細胞を解凍のOpti-MEM中に再懸濁し、次いで、いくつかの細胞密度を用いたsiRNA /リポフェクタミン混合物を含む個々のウェルに添加した（ すなわち 。500〜5,000μlのcells/10 /ウェル）。キンピロール処理（2時間対 18時間）の期間中だけでなく、フォルスコリンの最終濃度（100〜300nmの）も、私たちのAC6 / D 2L感アッセイで調べた。 750細胞/ウェル、72時間トランスフェクション持続時間、2時間キンピロール処理、cAMP蓄積（ 図3B）を刺激するために300 nMのフォルスコリン：これらの実験の結果は、ロバストZ '因子は、以下の条件にて得られたことが明らかになった。これらの共下nditions、我々のGαssiRNAの存在下で94パーセント減少した15倍の感作反応を得る（VSのGαsのsiRNAのための0.6のZ 'を。対照siRNA）。
図1：従来のフォーマットでは、細胞を、48ウェル形式でプレーティングし、48時間にわたって成長させて集密化した。増殖培地をデカント小分子阻害剤を添加し、D 2作動薬の添加が続く。 2時間のインキュベーションの後、アッセイ培地をデカントし、細胞を洗浄/デカント一連の工程に供される。次に、ACを刺激し、細胞を溶解する。サイクリックAMPの蓄積は次に濾過工程、シンチレーション計数を必要とする2日間のアッセイで[3 H] cAMP結合アッセイを用いて評価される。しばらく96ウェルフォーマットのelimin洗浄及びデカント工程の多くをated、我々は、この形式は、HTSや自動化に容易に適用できないことがわかった。 HTSフォーマットは、384ウェルプレートに直接播種する凍結保存細胞を使用する。これらの凍結保存した細胞は、1時間の平衡以下「準備アッセイ」である。この最初のインキュベーション期間の後、小分子阻害剤は、2時間のインキュベーションのためにD 2作動薬を加え、続いて添加することができる。 ACを刺激し、細胞をアッセイプレート中のHTRF検出試薬を用いて溶解させる。
図2凍結保存CHO-D 2L細胞を3000細胞/ウェル、1時間平衡化を直接384ウェルアッセイプレート中に播種した。A.）D 2作動薬の濃度を増加させる、quinpirオーレ、添加し、細胞を加湿インキュベーター中、37℃で2時間インキュベートした。サイクリックAMPの蓄積は、室温で1時間スピペロンおよびIBMXの存在下で10μMのフォルスコリン（最終濃度）で刺激した。反応は、HTRF cAMPアッセイ試薬（n = 1で少なくとも3回の実験の代表）を用いてクエンチした。データは、ビヒクル処理細胞の反応パーセントとして表される。B.）CHO-D 2L細胞を接触させない場合（対照）又は示されたD 2受容体拮抗薬（ すなわち、スピペロン又はハロペリドール）の存在下で前処理した。キンピロール（100 nM）を添加し、細胞を感作を誘導するために2時間インキュベートした。 AC物を室温で1時間10μMのフォルスコリン（最終濃度）で刺激した。サイクリックAMPは、HTRFを用いて決定した。データは=℃）、CHO-D 2L細胞が存在しない場合（対照で前処理したビークル処理された細胞の割合応答として表現される100％）または示さD 2受容体拮抗剤の増加する濃度の存在。キンピロール（100 nM）を添加し、細胞を感作を誘導するために2時間インキュベートした。 AC物を室温で1時間10μMのフォルスコリン（最終濃度）で刺激した。サイクリックAMPは、HTRFを用いて決定した。データはキンピロール誘発性感作反応のパーセントとして表現されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3：凍結保存HEK-AC6 / D 2L細胞を1000細胞/ウェルで播種し、1時間平衡化した。 A.）細胞を、加湿インキュベーター中で2時間、ビヒクルまたは100nMのキンピロールとともにインキュベートした。交流WAsは室温で1時間フォルスコリンの濃度を増加させながら刺激した。サイクリックAMPは、AC6 / D 2L細胞におけるGαsでのsiRNAブロック感作のHTRF。B.）リバーストランスフェクションを用いて決定した。 GαsでsiRNAまたは非標的siRNA対照（2ピコモル）を10μlの総体積0.03μlのリポフェクタミン2000（リポ）と混合し、溶液を384ウェルプレート中の個々のウェルに添加した。凍結保存しAC6 / D 2Lの細胞を次に、逆トランスフェクションのために添加し、加湿インキュベーター中、37℃で70時間インキュベートした。 D 2受容体アゴニスト、キンピロール（最終1μM）またはビヒクルで2時間インキュベートし、続いて加えた。サイクリックAMPの蓄積は1時間300 nMのフォルスコリン（最終濃度）で刺激し、HTRFを用いて測定した。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
異種感作の研究を促進する努力において、我々は、我々の以前の広範囲に合理化された方法の達成修飾されている「ミックスを読み「ハイスループットスクリーニングと試験作用機序に修正可能なフォーマットである。次のように我々のプロトコルへの主要な変更は、要約することができる。1）」アッセイ対応」試薬として凍結保存した細胞の使用、384ウェルフォーマットへのアッセイの2）小型化、3）のHTRF測定の活用cAMPを。
私たちの細胞ベースのアッセイのための凍結保存の採用が大幅に一日実験やスクリーニングの努力に私たちの一日のための効率性と再現性を向上しています。このアプローチは、業界標準であり、容易に26を設定すること学術研究に変換することができます。細胞培養効率を向上させるために、細胞のバイアルを解凍し、希釈した後、384ウェルプレートのfoで直接プレーティングするが、その細胞株に「棚試薬オフ」として使用される各アッセイR。我々は以前、無脊椎動物Gタンパク質共役型受容体のアンタゴニスト32,33の同定を目的とした研究において、凍結保存細胞を組み込んだ。この方法論は、最初の作業は、我々の研究室で行われ、課題を提示し、可能性が高い変動性を導入し、キャンパス全体で培養した細胞を輸送必要とされなかったことに有利であった。私たちの新しいアプローチを利用して、凍結細胞は現在、直前にアッセイの開始にサイト上で解凍し、希釈することができる。再現性を向上させることに加えて、凍結保存はまた、アッセイの実行に細胞播種から48時間の期間（ 図1）を排除した。我々が正常にcAMP蓄積およびβ-アレスチンの動員（ブラスト、TF、Ejendal、KFK、およびワット、VJ未発表の観察）を含む機能の読出しと組換え受容体とのACSのサブタイプのさまざまな方法を使って安定した一過性のトランスフェクション実験で凍結保存法を適用している。 DESこれまでに私たちの肯定的な経験をPITE、研究者がそれらの受容体やターゲット、およびモデル電池システムは前に任意の大規模な研究を開始する凍結保存と互換性があることを確認する必要があります。
デカントの感作アッセイ、関係排除を合理化します（ 図1）の手順を洗うための努力することが重要であった第二の修正。これらの変更は、96ウェルフォーマット（コンリーとワット、未発表の観察）にアッセイの私達の小型化と同時にだった。具体的には、修正された感プロトコルは（中央のパネルの図1を参照）、cAMP蓄積が任意の洗浄やデカントのステップが存在しない場合におけるD 2アゴニストのインキュベーション後、アッセイ緩衝液中にフォルスコリンの直接添加によって開始された場所に設計されました。さらに、cAMP蓄積バッファはスピペロンの比較的高濃度（1μM）、D 2について0.07のKi値を有するD 2アンタゴニストを含有してい受容体15。この100は、ACステップ15を刺激し、それによってフォルスコリンの際にアゴニストによる残留D 2受容体の活性化（ 例えばキンピロール）を排除し、cAMP蓄積フェーズの間に完全なD 2受容体職業にペロン結果の過剰濃度をまとめておきます。この変更は、初期のアゴニストのインキュベーション後3デカントし、3回の洗浄工程を排除した。 96ウェルフォーマットの開発の一環として、我々はまた、クエンチング前、細胞を溶解し、最終デカント工程を排除することができた。 3から9パーセントおよびcAMP蓄積バッファへの直接の試薬 を添加する工程（TCA。 すなわち、トリクロロ酢酸）本変形例は、我々の溶解試薬 の濃度を増加させることによって達成された。修飾された96ウェル増感アッセイの有望な結果は、384ウェルフォーマットに感作アッセイの変換のためのサポートを提供した。残念ながら、cAMPを定量化するための我々の以前の方法論は、面倒filtratioたN系[3 H] cAMPのタンパク質結合アッセイ（> 5段階）。例えば、アッセイは、一般的に15,24を計数フィルター乾燥させ、シンチレーションを可能にするために、2日間かけて完了する。これらの欠点は、高スループットの384ウェルフォーマットのために利用することが非現実的に結合する[3 H] cAMPのタンパク質を作った。
第三の主要な開発は、384ウェルフォーマットに適した方法でcAMPを測定し、定量化するための方法論を組み込むことを経由して来た。例えば、我々は、cAMP応答エレメント（CRE） -ルシフェラーゼ系384ウェル形式32,33の相対的なcAMPの測定のためのレポーター系を使用して有意な経験を持っています。このアプローチが成功のGαs共役受容体の多くの研究のために、我々の研究室で使用されてきたが、CRE-LUCレポーターはスクリーニングアッセイ34時の偽陽性と陰性の数の対象となっている。このアプリでさらに、我々の予備D 2感作性試験ゴキブリは、我々はルシフェラーゼシグナル（データは示さず）の見かけのフィードバック阻害が観察されたことを奨励されなかった。したがって、我々は彼らの「第一」および「第二」世代GloSensorベクトルの両方を使用して、安定した細胞株を構築し、特徴付けることによってGloSensor cAMPの技術の実施に関する努力を焦点を当てた。 GloSensorはルシフェラーゼタンパク質35内のcAMP結合部位を含む設計ルシフェラーゼレポーターである。システムは、運動のcAMP定量化のために非常に有用であるが、この方法は、アゴニスト誘発感作（コンリーとワット、未発表の観察）を測定するための効果的ではなかった。我々はまた、cAMP蓄積を評価するための費用対効果の高い手段として、我々の研究のためのBRETベースのcAMPバイオセンサー36を探った。残念ながら、一過性にトランスフェクトバイオセンサーに関連するバックグラウンドノイズは、我々の感作アッセイにこの方法を適応させる当社の能力を制限した。最後に、我々は、均一時間分解蛍を採用した、いくつかのキットを評価した384ウェルフォーマットでcAMPを測定するためのアプローチとしてescence（HTRF）。我々は、この確立された方法論は、彼らは、堅牢で高感度、安定した、使いやすいされたことの学術研究所やスクリーニング施設と最も互換性のあることがわかった。学術研究者のための主な欠点は、試薬のコスト、試薬および384ウェルフォーマットへの小型化の一方一括購入のELISAベースのアッセイおよびこれまでの「自家製」[3 H] cAMPのタンパク質を含む他のキ ット、との価格を超える競争力なりですアッセイ15結合 。
代表的な研究は、組換え細胞株におけるACシグナル伝達のD 2ドーパミン受容体誘導性感作の研究に384ウェル増感アッセイの適用可能性を実証する。いくつかの予備的研究では、我々は、D 2ドーパミン受容体を評価するためのわずかな変更を加えて、このアッセイを使用していたし、（いくつかのACアイソフォームのオピオイド受容体誘発性感作をμ表1）。これらの研究は、複数の細胞株、受容体サブタイプ、およびACアイソフォームに384ウェルアッセイの一般的な適用性を強調する。同様のアッセイ形式を開発することに興味のある人は、そのような細胞密度は、アゴニストの前処理時間、AC活性化プロトコル/状態、およびそれらの細胞モデルのためのHTRF cAMPの検出方法論などの変数を探索することが奨励されるであろう。本明細書に提示されるデータは、増感アンタゴニストの小分子阻害剤を同定するアッセイの能力を実証する。効力値は、他の機能アッセイ28だけでなく、放射性受容体結合アッセイを使用して得られた親和性（KI）値（：http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.phpを参照）を用いて測定したものと一致している。現在のアッセイデザインは、容易に化合物が、ピンツールを介して配信されるか、検定準備プレート内preplatedされたHTS努力を収容できる。記載の感作アッセイに加えて、ここで適用される方法論は、他の広告に適用可能であるべきである複数の薬物/試薬を384ウェル形式で前に終点メジャーに適用されるaptiveアッセイ。
我々は全体の384ウェルアッセイのための重要な開発段階を強調しようとしましたが、また逆のトランスフェクションのsiRNAアッセイの開発が特に困難であったことに留意したいしている。これらのアッセイのための我々の長期的な目標は、ACアイソフォームの異種感作に関与重なり、ユニークな遺伝子を同定するためのゲノムワイドな努力を行うことである。ガイドラインとして、当初のsiRNAアッセイを用いて、我々は、siRNAの逆トランスフェクションアッセイを開発するための以下の略記の提案を提供する：（1）例えば、シグロおよびトランスフェクション試薬（ 例えば、リポフェクタミン2000）のようなインジケータの比を用いてトランスフェクション効率を調べ、（2）最適な播種密度（ 例えば、500〜5,000細胞/ウェル）を決定し、（3）トランスフェクションの持続時間（ 例えば、48〜96時間）を探索し、（4）適切なアッセイ条件を評価する（ 例えば、薬物のtr最適な信号（ 例えば、Z '因子分析）を達成するためのeatments、終点対策、堅牢対照）。スクリーニングの努力でのsiRNAの使用のための追加的なディテールや、より一般的な情報は、先に引用した方法の記事29,30に記載されています。 HTSの取り組みに興味を持っているものの研究者らはまた、（ 例えば 。ピンツール、ロボット）の自動化へのアッセイの適応性を検討すべきである。また、スクリーニングの努力のための他の因子またはコントロールは、アッセイ形式的検証、細胞生存率アッセイ、および適切なカウンタースクリーンを含む。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/：追加のガイダンスについては、興味のある読者は、NCATSを通じて利用NCGC検定ガイダンスマニュアルを調べることが奨励されることになる。
我々は、効率的に骨の折れる複数日アッセイの合理化」ミックスと読み、「一日で実行することができるアッセイをするために我々のアプローチを記載している。ここで説明する方法論と1,536ウェルフォーマット25内μopioid受容体誘発性感作1280化合物の最近の研究では、増感は、今すぐにHTSを使用して調べることができることを示唆している。ここに記載されるアッセイは、小分子試験に従順であり、siRNAなどの遺伝的アプローチを適用することができる。我々のアッセイ形式は、ACの異種感作として知られている適応応答に焦点を当てているが、一般的なアプローチおよび方法が広く、複数の薬物および試薬の添加を必要とする他の細胞ベースのアッセイ（ 例えば、神経保護および脱感作）に適用することができる。ここで報告作業が容易にマルチチャンネルピペットおよび384ウェル形式で所望のエンドポイントを読み取ることが可能なマルチモードプレートリーダーを用いて、学術設定内で達成される。
表1。細胞モデルは、アゴニスト誘発感作のためにテストされています。
| 受容体 | ACアイソフォーム | 細胞株 | 感作 信号 |
| D 2Lドーパミン | 内因性の （AC6とAC7 27） | CHO-D 2L | 2〜3倍 |
| D 2Lドーパミン | 組換えAC2、AC5およびAC6 | 安定的にトランスフェクトしたHEK 293 | AC2 = 2〜3倍 AC5 = 50倍 AC6 = 15倍 |
| μオピオイド | 組換えAC1、AC2、およびAC5 | 安定的にトランスフェクトしたHEK 293 | AC1 = 6-7倍 AC2 = 2〜3倍 AC5 = 10月15日倍 |
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、方法論的なトレーニングや検定の指針としてリチャード·ジンクとトッドWiernickiを承認したいと思います。また、熟読し、編集上の提案のためにジョン·ポール·スペンスに感謝します。この作品は、リリー研究賞プログラム（LRAP）を通じて健康MH 060397、脳と行動研究財団、およびイーライリリー·アンド·カンパニーの国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384-well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase- and RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Nontargeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
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