Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51220
Automatic Translation
1, 1
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

Summary

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

Abstract

Kromatin çeşitli DNA-bağımlı işlemlerini denetleyen DNA ve proteinlerden oluşan bir derece dinamik Nukleoprotein karmaşıktır. Belirli bölgelerdeki kromatin yapısı ve fonksiyonu transkripsiyon faktörleri ve DNA da dahil olmak üzere metilasyon histon post-translasyonel modifikasyonlar (hPTMs) ve türevleri, kromatin bağlayıcı proteinler, lokal zenginleşmesi ile düzenlenir. Farklı fonksiyonel bölgelerde kromatin kompozisyon proteomik karakterizasyonu kadar kütle spektrometresi (MS) tarafından daha sonraki derinlemesine analiz için uygun saflıkta ve miktarda bu tür etki zenginleştirmek için verimli protokollerin olmaması engel olmuştur. Biz burada, hazırlayıcı Kromatin immüno-çökeltme, özellikleri, hPTMs açısından, varyantları ve co-ilişkili olmayan proteinler ayrı histonic kromatin bölgeleri izole etmek için kullanılır ve bu arada ChroP (Chro kaska roteomics P) olarak adlandırılan, yeni tasarlanmış kromatin proteomik strateji tarif MS ile analiz edilmiştir. Biz he göstermekhiston H3 lizin 9 arasında tri-metilasyon varlığı ile işaretlenir transkripsiyonel sessiz heterokromatik bölgelerin zenginleştirme ve analizi için ChroP kurulmasına re. Elde edilen sonuçlar iyice heterokromatinin proteomesini karakterize ve kromatin farklı protein belirleyicileri etkileşim ve lokus spesifik yapısal ve işlevsel yapılandırmaları kurmak synergize nasıl anlamak için güçlü analitik strateji olarak bunu kanıtlamak içinde ChroP potansiyelini göstermektedir.

Introduction

Kromatin bütün DNA dolayımlı süreçler için temel şablon olarak dahil olan bir yüksek dinamik bir nükleoprotein karmaşıktır. Nükleozom kromatin temel tekrarlanan birimi olan ve DNA 147 bp 1,2 sarılır etrafında her bir kanonik histon H2A, H2B, H3 ve H4, iki protein molekülü ihtiva eden bir oktamer çekirdek oluşur. Tüm çekirdek histon bir küresel etki ve nükleozom dışında çıkıntı esnek bir N-terminal "kuyruk" olarak yapılandırılmıştır. Kromatin yapısı ve dinamikleri düzenlenmesi için önemli mekanizmalardan biri esas olarak histon 3,4 N-uçlarının üzerinde meydana gelen kovalent bir post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. Histon modifikasyonlar histon-DNA arasında veya nükleozom arasında temas değiştirerek, yüksek dereceli kromatin yapısını değiştirmeden ve böylece DNA-bağlayıcı proteinler (sis mekanizmaları) erişilebilirliğini kontrol edilmesi yoluyla işlev görebilir ya da dockin olarak hareket ederekdüzenleyici proteinler için, ya da tek bir birim ya da multimerik kompleksleri gömülü olarak g siteleri. Bu gibi düzenleyici proteinlerin farklı şekillerde işlev gösterebilir: doğrudan gen ifadesi (örneğin, TAF proteinleri) modüle edilmesiyle, ya da nükleozom konumlandırma (yani kromatin kompleksler yeniden) değiştirerek ya da başka bir histon artıkları (metil-transferaz ya da örneğin proteinler asetil-değiştirerek transferaz aktivitesi) (trans mekanizmaları) 5. Belirli kromatin loci farklı PTM desenler küme farklı sitelerde farklı modifikasyonlar yatan DNA'nın fonksiyonel durumunu aracılık moleküler kodu üretmek için sinerji olabilir hipotezin hazırlanmasına neden olduğunu gözlem. "Histon kodu hipotezi" yıllarda büyük uzlaşma kazanmıştır ancak deneysel doğrulama teknik sınırlamalar 6,7 ile geri düzenlenen olmuştur.

Kütle spektrometrisi (MS) bazlı bir proteomik olarak ortaya çıkmıştırgüçlü bir araç histon modifikasyonu desenleri haritasına ve kromatin-bağlayıcı proteinlerin 8 karakterize etmek. MS bir peptidin deneysel ve kuramsal kütle arasında belirli bir modifikasyonunu Δmass olarak tespit eder. Bireysel histonların seviyesinde, MS bunların 9-14 arasında yeni modifikasyon ve açığa etkileşimlere saptanmasını sağlayan, PTMS eşlemek için bir ilgili ve kapsamlı bir yöntem sağlar.

Son yıllarda, bir dizi strateji sağlam mitotik kromozom 15, çözünür HPTM bağlayıcı proteinlerin 16-18 tanımlanmasında ve özel kromatin bölgelerin izolasyonu ve analiz karakterizasyonu dahil olmak üzere, kromatin proteomik bileşimini incelemek için geliştirilmiştir (örneğin telomer) 19,20. Ancak, histon PTMS, varyantları ve kromatin ile ilişkili proteinler arasındaki lokus spesifik sinerji soruşturma hala tamamlanmadı. Burada, biz (ChroP adında yeni bir yaklaşım, tarifBiz verimli, fonksiyonel olarak farklı kromatin alanları tanımlamak için gelişmiş olduğunu Chro matin P roteomics) 21. Bu yaklaşım, zenginleştirilmiş numunenin etkin MS-tabanlı proteomik analizi için Kromatin immüno-çökeltmesi (çip), epigenetik araştırmalarda kullanılan köklü bir protokol, uyum sağlar. Bu giriş ve MS ile ele alınan sorun olarak kullanılan kromatin türüne bağlı olarak, iki farklı protokol geliştirdik; özellikle: MNase ile sindirilmiş sabitlenmemiş yerli kromatin 1) yonga mono-nükleozom arındırmak ve ko-ilişkilendirme hPTMs (N-ChroP) incelemek için kullanılır; 2) sonikasyon ile parçalanır çapraz bağlantılı kromatin ChIP proteinleri (X-ChroP) bağlayıcı tüm eş zenginleştirmek kromatin karakterize etmek için bir SILAC bazlı interactomics stratejisi ile kombinasyon halinde kullanılır. Biz burada İmmünopresipitasyon adımlar için yem olarak H3K9me3 kullanarak, heterokromatine zenginleştirmek ve eğitim için N-ve X-ChroP kombinasyonunu göstermektedir. ChroP kullanılması uzatılabilirBöylece epigenetik çeşitli uygulamalara önünü, ayrı kromatin bölgeleri, ya da farklı bir işlevsel durumuna geçiş sırasında aynı bölge içinde kromatin bileşimindeki değişiklikleri ya çalışmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Hücre Kültürü

  1. Yerli ChIP için standart ortam
    1. ,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1 glutamin,% 1 Pen / Strep ve 10 mM HEPES pH 7.5 ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde HeLa hücreleri büyütün.
  2. ChIP çapraz bağlama için SILAC etiketleme
    1. ,% 10 diyaliz edilmiş FBS,% 1 glutamin,% 1 Pen / Strep, 10 mM HEPES, pH 7.5 ve ışık L-lisin (Lys 0) ve L-ya da takviye lizin ve arginin tükenmiş SILAC DMEM ortamı içinde HeLa hücreleri, büyütün arginin (Arg 0) ya da bunların ağır meslektaşları, L-lisin (Lys 8) ve L-arginin (Arg 10) (Tablo malzemeler), sırasıyla, 73 mg / L ve 42 mg / L arasında nihai konsantrasyonlarda.
    2. Tam izotop kodlu amino asitler dahil edilmesini sağlamak için SILAC ortam içinde sekiz nesiller için hücreleri büyümek. Bu AC onları tohumlama, 1.0-1.5 x 10 6 hücre / ml 'lik bir yoğunluğa ulaştığında, her iki günde bir hücreleri KATKISIoncentration 5 ila 10 x 3 hücre / ml.
    3. SILAC ortamın zayıf bileşiminden neden olabilir fizyoloji herhangi bir olası değişikliğe ayırt etmek için SILAC ortam içinde hücrelerin büyüme ve uygulanabilirliğini değerlendirmek; Bunu yapmak için:
      1. Görme hücreleri etiketleme sırasında her gün mikroskopla Morfoloji inceleyin.
      2. Standart ortamda karşı SILAC içinde gelişen hücrelerin hücreleri ve arsa büyüme eğrileri sayılır.

2.. Native Kromatin Immunoprecipitation (N-Chip)

  1. Kültürlenen hücrelerden alınan çekirdekler hazırlanması
    1. Deneme başına 1-2 x 10 8 etiketsiz HeLaS3 hücreleri kullanır. Hasat hücreler, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 340 x g 'de 50 ml tüpler ve santrifüj içinde 50 x 10 6 hücre bir eş paym hazırlanması buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
    2. 8 ml Lizis Tamponu (Tablo 1) 'de her bir hücre pelletini ve dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edilir. Ca dökünrefully her hücre sitoplazmadan çekirdek ayırmak için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 3270 x g'de dışarı salınan bir rotor, bir sakroz yastığı (Tablo 1) ve santrifüj lizat.
    3. , Süpernatantlar atın nükleer pelet tutmak ve her yıkamada süpernatant atın, santrifüj ile buz gibi soğuk PBS içinde iki kez yıkayın.
  2. Micrococcal Nükleaz (MNase) sindirim (küçük ölçekli) ve sindirim sonra kromatinin kalite kontrol
    1. 1 ml Sindirim Tamponu (Tablo 1) 'de yıkanmış nükleer pelet yeniden süspanse edin; 500 ul iki bölüm olarak bölmek ve buz üzerinde tutun.
    2. Tümbölenin bir 260 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçün,% 0.2 sodyum dodesil sülfat (SDS) içinde 1:200 seyreltilmiş Not:. OD = 1 kromatin DNA yaklaşık 50 ug / ml 'ye karşılık gelir. Tipik olarak, 2 x 10 hücre 8 başlayarak OD 40-60 aralığındadır.
    3. , Çekirdeklerin% 1 alın 0 nihai konsantrasyona MNase enzim ekleyin.005 U enzim / çekirdeklerinin ul ve farklı zaman geçerse (0, 10, 20, 40, 60 dakika) 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Her zaman noktasında, sindirilmiş çekirdeklerin 4 ul toplamak ve MNase reaksiyonu durdurmak için 1 mM EDTA ekleyin. Buz üzerinde tutmak.
    5. PCR saflaştırma kiti ile DNA örnekleri ekstrakte edin ve 50 ul TE tamponu (Tablo 1) bunları elüt edilmesi.
    6. , Her bir DNA numunesi 20 ul alın Tamponu (Tablo 1) 10 ul ekle yükleme ve% 1 örnekleri yük (ağırlık / hacim) bir boyut kontrol olarak PCR bir işaretleyici ile Etidyum Bromür içeren agaroz jel.
    7. MNase inkübasyon tarafından üretilen kromatin nucleosome merdiveni değerlendiren sindirim edin.
    8. Hazırlanmasında mono-nükleozomlann yaygınlığı dayalı, sindirim için en uygun zamanı seçin. . Tipik MNase sindirim uygun zaman 60 dakika (Şekil 1B, sol panel) olan çekirdeklerin enzim / ul 0.005 U Not: digesti en uygun MNase konsantrasyon / zamanistenen hücre türüne ve nükleozom gerilme boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir.
  3. Large-scale/preparative MNase sindirim ve eriyebilir kromatin fraksiyonlarının geri
    1. Her eş payın ekle çekirdeklerin enzim / ul 0.005 U bir son konsantrasyona tekabül eden, 5 ul MNase (2.2.1); yavaşça karıştırın ve (küçük ölçekli testine göre optimize edilmiş bir zaman aralığı için ya da genel olarak,) 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Reaksiyonu durdurmak ve buz üzerinde tutmak için 1 mM EDTA ekleyin. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 7800 x g santrifüjleme ile sindirilmiş çekirdek Pelet. Yeni bir tüp içinde süpernatantlar (fraksiyon S1) aktarın ve 4 ° C Not saklamak: S1 mono-nükleozom içeren kromatin birinci çözünür fraksiyonu içerir. Proteaz inhibitörleri (Tablo 1) ekleyin.
    3. Dikkatlice tekrar süspansiyon 1 ml diyaliz tamponu (Tablo 1) de pelet ve 4 ° C, (c C'da gece boyunca diyalizeDiyaliz tüpün kapalı ut) 3.5 kDa iken, sabit hafif karıştırma ile 3 L Diyaliz Tampon içinde. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7800 x g'de santrifüj diyaliz edilmiş malzeme ve toplamak Yeni bir Eppendorf tüp süpernatant (S2 fraksiyonu) aktarın ve 4 ° C Not saklamak: S2 içermektedir MNase sindirim derecesine bağlı EPTA-nükleozomlann, di-için.
  4. Immunoprecipitation önce kromatin Kalite Kontrol
    1. (A NanoDrop sisteminde 260 nm'de OD ölçülmesiyle) S1 ve S2 kromatin fraksiyonların 5 ug tekabül eden bir kısım al. PCR saflaştırma kiti ile ekstrakte DNA ve 50 ul TE tamponu (Tablo 1) elute.
    2. S1 ve S2 DNA 20 ul alın Tamponu (Tablo 1) 10 ul yükleme ile karıştırın ve (ağ / hac) agaroz jeli üzerinde% 1 yükleyin. Kalite ve nukleosomlar merdivenin görsel muayene ile MNase sindirim verimliliğini kontrol edin Not:. Kesir S1 yüksek olduğunufraksiyon S2 ağırlıklı poli-nükleozom (Şekil 1B, sağ panel) içermekle birlikte, mono-nükleozom zenginleştirilmiş.
  5. Antikor ile kuluçkalama kromatin
    1. -20 ° C'de daha sonra Kütle Spektrometre analizi için S1 fraksiyonun 50 ul saklayın.
    2. Fraksiyon S1 ChIP Seyreltme Tamponu (Tablo 1) 1 hacim.
    3. Ilgilenilen HPTM (veya protein) karşı antikor ekleyin; 4 ° C Not dönen bir tekerlek üzerinde bir gece boyunca inkübe edilir: Tipik olarak, 2 x 10 8 hücreleri için 10 ug antikor 20 ug için kullanın. Antikor miktarı ve başlangıç ​​hücre sayısı arasındaki en uygun oranı dikkatle numune içindeki yem olarak kullanılan HPTM / protein bolluğu ve antikor verimi ile ilgili olarak, duruma göre ayarlanması gerekir. Optimizasyon aşağıdaki testlere dayanarak, deneysel:
      1. Giriş ve akış-through (FT arasındaki çıkar HPTM / protein miktarını karşılaştırmak,immüno özel kromatin bölgenin önemli bir bölümünü zenginleştiren doğrulamak için Western Blot veya MS ile 2.7.2) bkz Not:. HPTM / protein yem en az% 50, FT (Şekil 1C) olarak tükendiği zaman bu genellikle elde edilir .
      2. Ilgilenilen imüno protein malzemesinin yeterli bir miktarı MS analizi için kullanılabilir olmasını sağlar SDS-PAGE jeli üzerinde tespit edilebilir olup olmadığını kontrol Not:. Doğru stoikiometride dört çekirdek histon karşılık gelen bantların jeli üzerinde varlığı dokunulmamış nükleozom N-ChroP (Şekil 1D) ile immunopresipite edilmiş olduğunu gösterir. Uygun stoikiometrinin eksikliği nükleozom açılımı kısmi bir bozulma / göstergesidir aslında.
    4. Buna paralel olarak, (2.6), protein G-bağlanmış manyetik taneler hazırlamak.
  6. Dengeleme ve protein G-bağlanmış manyetik boncuk bloke
  7. Için bulamacın 100 ul kullanımı, boncuk bağlama kapasitesi şunlardır:. Protein 100 ul dengeye G-bağlanmış manyetik boncuk Çözelti (Tablo 1), üç kez yıkama ve dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de gece boyunca kuluçka Not Engelleme çamur antikorun 2-20 ug.
  8. ChIP Seyreltme Tamponu (Tablo 1) ile iki kez daha sonra bloke etme çözeltisi ile bir kez bloke boncuk yıkayın.
  • Manyetik boncuklar kullanılarak kromatin izolasyonu
    1. S1 kromatin örnek bloke boncuklarının 100 ul ilave edin ve 3 saat boyunca 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe. Ipuçları kapaktan numune aşağı spin 1 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj. Boncuk pelet için manyetik bir rafa koyun.
    2. Yeni bir Eppendorf tüpüne süpernatantı aktarın. Bu (FT) boyunca akış, antikora bağlanmayan kromatin yani fraksiyonudur.
    3. Boncuklar dört yıkayınHer yıkamadan (75, 125 ve 175 mM NaCl) ile tuz yoğunluğunu yükselterek Tamponu (Tablo 1) yıkama kez.
    4. Imüno kromatin elüte etmek için, 70 ° C'de 5 dakika boyunca 50 mM ditiyotreitol (DTT) ile desteklenmiş LDS Sample Buffer 30 ul, boncuk inkübe ,% 4-12 Bis-Tris akrilamid SDS-PAGE prekast gradyan jeli üzerinde elüt proteinleri ayırın ve Kolloidal Coomassie boyama kiti (Şekil 1D) ile jel leke.

    • 3.. Çapraz Kromatin Immunoprecipitation (X-Chip)

    1. Formaldehid ile çapraz bağlanması hücrelerin
      1. Kısa bir süre karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir, SILAC etiketli hücreler% 0.75 formaldehit ekleyin. 125 mM glisin eklenerek formaldehit söndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
      2. 5 x 10 7 tümbölenler hücreleri bölmek; 430 'de santrifüj ile onları buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın5 4 ° C'de minimum ve her yıkamadan sonra süpernatantlar atılması için xg. Son yıkamadan anda, süpernatant atmak ve pelet tutun. Not: hücreler çapraz bağlanmış kez hemen kullanılmazsa, bunlar, -80 ° C'de saklanabilir.
    2. Çekirdekler hazırlık
      1. 10 ml Lizis Tamponu (Tablo 1) 'de her bir hücre pelletini. Rotasyon ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 430 x g'de santrifüje Süpernatantlar atın; nükleer pelet tutmak.
      2. Tamponu (Tablo 1) yıkama 10 ml her bir nükleer pelet tekrar. Dönen bir tekerlek üzerinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
      3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 430 x g'de santrifüje Süpernatantlar atın ve pelet toplamak.
      4. 3 ml ChIP İnkübasyon tamponu (Tablo 1) 'de her bir nükleer pelet yeniden süspanse edin. Buz üzerinde tutmak.
    3. Kromatin Sonication ve kalite kontrol
      1. Sonicate ch. 200 W, soğutulmuş Bioruptor in ("kapalı" ve 1 dakika "on" 30 saniye döngüleri), kromatin parçalara en romatin Not: döngüleri ve sonikasyon aralıklarının sayısı, hücre türüne ve nükleozomal ortalama uzunluğuna bağlıdır İstenilen germek. Tipik olarak, 30 dakika sonikasyon di-ve tri-nükleozom karşılık gelen uzunluklarda 300-500 bp'lik DNA parçalarını üretmek için gereklidir. Fragmanlar boyutunun seçimi araştırılmaktadır kromatin etki tipine bağlıdır.
      2. ChIP inkübasyon tamponu içinde 1 saat arasında, en az 65 ° C'de inkübasyon yoluyla çapraz bağlanma, ters toplam girişine% 2 al. , PCR saflaştırma kiti ile ekstrakte DNA 50 ul TE tamponu içinde elüte ve parçalanma kromatin kontrol etmek için agaroz jel üzerinde DNA yükleyin.
    4. Antikor ile kuluçkalama kromatin
      1. Sonike kromatin% 10 Triton X-100 içinde 1/10 hacim. Pelet haline getirmek üzere, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin debris.
      2. Etiketli hücrelerde SILAC amino asitlerin dahil edilmesi seviyesinin test etmek için ve protein profil ağır hücrelerden kromatin giriş 50 ul kaydedin.
      3. Kalan ağır ve hafif etiketli sonike kromatin için tercih edilen bir antikor ekleyin ve dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Işık kanal olarak, aynı zamanda, çözünür peptidin bir kat fazla ekleyin. Dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe Notlar:. 2.5.3 olarak tartışıldığı gibi antikor ug ve hücrelerin başlangıç ​​malzemesi arasındaki en uygun durum, her bir durum seçilir. Antikora ilişkin olarak çözünür peptidin optimum fazla kat molarite dikkatli bir şekilde duruma göre titre edilmelidir.
    5. Manyetik boncuklar kullanılarak kromatin izolasyonu
      1. Dengelenmeye ve 2.6 açıklanan adımları izleyerek ve ChIP Kuluçka Tampon kullanarak protein G-çiftli manyetik boncuk engellemek.
      2. Engellenen b 100 ul ekleyinkromatin örnekler ve 4 ° C'de 3 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe EADS Ipuçları kapaktan numune aşağı spin 1 dakika boyunca 340 x g'de santrifüj. Boncuk pelet için manyetik bir rafa koyun. Yüzer ilişkisiz nükleozom içeren, (FT) üzerinden akışıdır. Yıkama artan tuz konsantrasyonuna (iki 150 mM'de yıkama ve 300 mM NaCl'de iki) ile Tamponu (Tablo 1) yıkama dört kez boncuk.
      3. Elüe ve de çapraz imüno proteinleri hem de 95 ° C 'de 30 ul SDS-PAGE yükleme Numune Tamponu (Tablo 1)' de ve 25 dakika boyunca boncuk inkübe edin. Ayrı proteinler% 4-12 Bis-Tris akrilamid SDS-PAGE pre-kast jel (Şekil 3D).

    Önceki MS 4. Numune Hazırlama

    1. In-Gel N-çipinden zenginleştirilmiş histonların sindirim
      Not: Protein sindirimi ve peptid çıkarma adımlar ilgilenir sırasındaDaha önce 22, 23 tarif edildiği gibi, LC-MS/MS ile müdahale keratin kirletmesini en aza indirmek için.
      1. Kesim jel dilimleri çekirdek histon bantları (Şekil 1D) tekabül. Jel küçültmek için% 100 ACN ile sırayla değişen, GKD 2 O içinde% 50 asetonitril (ACN) ile jel parçaları De-leke. Jeller adet tamamen de-lekeli kadar tekrarlayın ve bir vakum santrifüj onları kurutun.
      2. D6-asetik anhidrid ekleme 01:09 (v / v) 1 M amonyum bikarbonat içinde (NH4 HCO 3) (tipik olarak 60-100 ul son hacim) ve katalizör olarak 3 ul sodyum asetat (CH3 COONa). Güçlü çalkalama ile 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe Not:. Örnek reaksiyonun montaj sonrası ilk dakikada kabarcıklar oluşturabilir: önemli dikkatle ele almak ve üretilen gaz, zaman zaman açıklığını serbest bırakmak için borular inkübasyon sırasında.
      3. Birkaç kez w jel parçaları durulayınIth NH4 HCO 3, tamamen D6-asetik anhidrit kalıntılarını ortadan kaldırmak için artan bir yüzde (% 50 ila% 100) olarak ACN ile alternatif.
      4. 100% ACN içinde jel parçaları shrink; komple de-hidrasyon sağlamak için bir vakum santrifüj içinde kurutun. Dötere asetik anhidrit ve tripsin sindirim kullanılarak lisin kimyasal modifikasyon kombinasyonu üreten bir "Arg-: buz gibi soğuk 100 ng / 50 mM NH4 HCO 3 ul tripsin solüsyonu ve 37 ° C de bir gece boyunca inkübe Not ile yeniden hidrat jel parçaları Histonların 21,24 jel sindirim desen "gibi C.
      5. Fazla solüsyonu atın ve jel parçaları tamamen kapsayacak şekilde 50 mM NH4 HCO3 bir hacim eklemek; 37 ° C de bir gece inkübe
      6. Yeni bir Eppendorf tüpü içinde çözünür sindirilmiş peptitleri toplamak. Peptidler lyophilize. ,% 0.5 asetik acid/0.1% trifloroasetik asit (TFA) bunları yeniden süspanse edin. Desalt ve konsantrebir ters faz el yapımı microcolumns on C18 / Carbon "sandviç" ve iyon değişim kromatografisi (SCX) (StageTip) 25 üzerinde peptitler.
      7. 200 ul ipuçları hareketsiz C 18 / Karbon ("sandviç") ve SCX boncuklar içeren teflon ağ örgüsü diskleri koyarak StageTip microcolumns hazırlayın. Karbon filtre ile yüklü bir ikinci ucunun üzerine C18 mikrokolonlu yüklenerek "sandviç" elde edilir Not:. C18 filtre üzerinde tutulan olmayan çok kısa peptidler, direkt olarak yüklenen akış yoluyla geçmesi genellikle onları yakalar Karbon İpucu. SCX StageTips örneğin H3 gibi belirli peptidler, etkin bir şekilde ters faz kromatografi ile tutulmayan (3-8) peptidi, zenginleştirebilir.
      8. SCX StageTips üzerine C18 / Carbon "sandviç StageTip" ve% 50 üzerine yük peptidlerin 50%. % 80 ACN/0.5% asetik ac kullanarak C 18 / Karbon İpuçları onları Zehirid ve% 5 amonyum hidroksit ile SCX ipuçları (NH4 OH) /% 30 metanol dan. % 0.1 FA liyofilleme tekrar süspansiyon peptidler sonra ve LC-MS/MS ile analiz.
    2. Proteinlerin immüno içinde jelde Sindirim
      Proteinlerin In jelde sindirim küçük değişiklikler ile, daha önce tarif edildiği gibi, 22 gerçekleştirilir.
      1. On dilimleri (Şekil 3D) her şeritli ve 1 mm 3 küçük küpler her dilim kesti. 50 mM NH4 HCO 3/50% etanol ile jel parçaları De-leke ve jeller küçültmek için mutlak etanol ekleyin. Jeller tamamen de-lekeli kadar tekrarlayın.
      2. Karanlıkta, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca alkilleme tampon maddesi (Tablo 1) ilave edildi ve ardından 56 ° C de 1 saat karıştırıldı, jel parçaları indirgeme tamponu (Tablo 1) ekleyin. Vakum santrifüjde jel parçaları yıkayın ve kurutun.
      3. Buz soğukluğunda 12.5 ng / ml tripsin sol jel parçaları ile rehidrate50 mM NH4 HCO 3'te ution ve jel parçaları tam bir tekrar nemlendirme kadar buz üzerinde inkübe edilir. Fazla tripsin çıkarın.
      4. Jel parçaları tamamen kapsayacak şekilde 50 mM NH4 HCO3 ekleyin. 37 ° C de bir gece inkübe
      5. Sıvı kısmını toplayın. Jel parçaları için ekstraksiyon tamponu (Tablo 1) ilave et; Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kuvvetli çalkalama ile inkübe edin. Iki kez tekrarlayın.
      6. Kuvvetli çalkalama ile, 10 dakika boyunca ACN içinde jel parçaları inkübe edin. Iki kez tekrarlayın ve tüm Süpernatantlar havuz.
      7. Peptidler liyofilize edilir. ,% 0.5 asetik acid/0.1% TFA içinde kurutulmuştur peptidler yeniden süspanse edin.
      8. Tuzunun giderilmesi ve 26, 27 tarif edildiği gibi, bir ters faz C18 StageTip üzerindeki peptitler konsantre.
      9. % 80 ACN/0.5% asetik asit kullanılarak C 18 StageTip peptidler Zehir. Bir vakum santrifüj içinde buharlaştırarak organik çözücünün çıkması ve% 0.1 FA (tipik olarak 5-10 ve en peptidleri tekrar süspansiyon# 181; l), ne zaman MS analizi için hazır.

    5. LC-MS analizi

    1. Sıvı kromatografi analizi
      1. Bir kullanılarak sabit bir helyum basıncı (50 bar) ters-fazlı (RP) C 18, 3 um, metanol reçine kullanılarak, bir 15 cm kaynaşık silika yayıcı (75 mm iç çapı, dış çapı 350 mikron) 'de analitik sütun paketleme bomba-yükleyici cihaz, daha önce 28 açıklandığı gibi.
      2. Çift doğrudan bir 20-cm uzunluk (25 mm iç çap) ile HPLC 6-bağlantı valfinin çıkışına paketlenmiş yayıcı (C 18 RP kolonu) ön sütun veya bölünmüş cihazı kullanmadan silis kaynaşık.
      3. 500 nl / dak Mobil faz A (GKD içinde% 0.1 FA /% 5 ACN 2 O) akış da C18 RP sütunu sindirilmiş peptidler yerleştirin.
      4. Numune yükleme sonra aşağıdaki gradyanları kullanılarak peptidlerin ayrılması:
        1. % 0-40 mobil faz B (% 0.1 FA/99% ACN uygula250 nl / dk 'da GKD 2 O) histonlann türeyen peptidlerin, yıkama için, 5 dakika boyunca, 10 dakika ve 60-80,% 40-60,% gradyanı, ardından 90 dakika boyunca (2) görüyoruz.
        2. İmmüno proteinlerinden türetilen peptidlerin, yıkama için, 5 dakika boyunca, 10 dakika ve% 60-80, (3 e bakınız),% 36-60 gradyanı, ardından 250 nl / dakika, 120 dakika boyunca% 0-36 at mobil faz B uygulanır.
    2. LTQ-FT-ICR-Ultra kütle spektrometresi kullanarak Kütle Spektrometre analizi
      1. Otomatik olarak MS ve MSMS edinimi arasında geçiş yapmak için bir veri bağımlı iktisabı (DDA) modunda çalıştırın. MS tam tarama spektrumları 200-1,650 tipik m / z aralığında, elde edilen, 400 m / z de çözünürlüğü R = 100,000 ile elde edilir. Beş (Top5) en yoğun iyonları 5000 bir hedef değeri bir çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanarak lineer iyon kapanı parçalanma için izole edilir.
      2. Tablo 2 fo listelenen parametreleri kullanınr "Tuning" satın alma dosyası.
      3. Tablo 2'de listelenen standart satın alma ayarlarını ayarlayın.

    6.. Veri Analizi

    1. Kromatin etki eş zenginleştirilmiş histon modifikasyonları ücretsiz miktarının Etiket
      1. Edinilen ham dosyaları Raw2msm yazılımı (sürüm 1.10) 29 kullanılarak mgf'den dosyalarına dönüştürebilirsiniz.
      2. Tablo 3'te açıklanan parametreleri ayarlayarak, Maskot DEAMON (versiyon 2.2.2) kullanılarak histon modifikasyonları arayın.
      3. Maskot çıkış peptid listesinde, 15 daha düşük puan ile veya 5'ten fazla farazi FTM 29 ile peptitler kaldırın Not:., Tek tek her peptid ID, yüksek Maskot puana sahip peptid seçmek ve aynı kimliği ile tüm diğer gereksiz peptidler süzmek .
      4. Bas, her değiştirilmiş peptitlere karşılık gelen her bir ön için ekstre edilmiş iyon kromatogramları (XIC) ConstructQualBrowser kullanarak m / z değeri ile ilgili ed. Her bir tepe (Şekil 2A) için eğri (AUC) altındaki alanı hesaplanır.
      5. QualBrowser (Şekil 2B) kullanılarak MS / MS spektrumları, görsel muayene ile değişiklik içeren her bir tespit peptidler doğrulama.
      6. Her bir tadil edilmiş peptid için göreli bolluk hesaplayın. Yonga ed malzemede, her değişiklik nispi zenginleştirme hesaplayın Not:. Göreli bolluk, aynı peptidin tüm modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş formları AUC toplamı üzerinden her belirli tadil edilmiş peptidin AUC arasında bir oran olarak hesaplanır ise göreli Giriş (Şekil 2C) üzerindeki çip spesifik bir modifikasyon itibarıyla nispi bolluk bir oranı olarak zenginleştirme.
    2. Proteinlerin Kantitatif proteomik analizi kromatin alanları içinde co-ilişkili
      1. Proteinler için tanımlama ve miktar MaxQuant paketini kullanabilirsiniz(Http://www. Maxquant.org /) 30. AndromedaConfig.exe 31 kullanılarak yerleşik arama motoru "Andromeda" yapılandırın ve Tablo 3'te listelenen arama parametrelerini ayarlayabilirsiniz.
    3. Ortaklığın testi
      1. Aşağıdaki gibi, MaxQuant yazılımı kullanılarak, ağır-etiketli kromatin giriş protein içine ağır amino asitlerin dahil edilmesi derecesini tahmin:
        1. 6.2 'de açıklanan ancak yeniden ölçmek seçeneğini devre dışı bırakma gibi parametreleri ayarlayın.
        2. Birleşme olmayan gereksiz peptid oranları aşağıdaki formül uygulanarak yüzdesini hesaplayın:. Ortaklığın (%) = oranı (H / L) / oranı (H / L) + 1 × 100 (Şekil 3B) Not: Kabul sadece şirketleşme> 95 %.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Kromatin immüno genomu boyunca bir protein veya bir histon modifikasyonunun lokalizasyonu profil için kullanılan güçlü bir tekniktir. Bir proteomik eşdeğer olarak, çip, ilgilenilen değiştirilmesi veya protein ile birlikte imüno "yem" olarak kullanılan nicel ve nitel olarak hPTMs, histon varyantları ve kromatin bağlayıcı proteinleri belirlemek için MS tabanlı proteomik izlemektedir. N-ChroP yaklaşımda, kromatin MNase (Şekil 1 B) ile sindirilmiş edildiği Şekil 1A, yerli Chip, belirtilen ayrı bir alanı işlevsel bir kromatin kütleden arındırmak için girdi olarak kullanılmaktadır. Mono-nükleozom zenginleştirilmiş sindirildi kromatin spesifik bir antikor ile inkübe edilir ve immüno proteinler SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Gösterilen örnekte, H3K9me3, sessiz kromatin 32,33 of marker yaklaşımı kurmak için kullanılır. Seçimi esasına dayanmaktadır edilene hem fonksiyonel rolüonun protein interactors bazı iyi tarif edilmiştir sıra. Ayrıca, sağlam nükleozom doğru stoikiometride çekirdek histon ile, MS (Şekil 1D için uygun miktarlarda zenginleştirilmiştir Coomassie jel görsel inceleme tarafından teyit Dahası, yonga için optimize edilmiş yüksek düzeyde spesifik ve etkili bir antikor, 34 mevcuttur .)

    Akış yoluyla (FT) ve giriş (IN) içinde mevcut H3K9me3 miktarı arasındaki karşılaştırma küçük bir alt-nüfusa zenginleşmesine nedeniyle bir önyargı riskini hariç, ilgili bölgenin yaklaşık% 50 olduğunu gösterir İmmüno kromatin (Şekil 1C). Her çekirdek histon poliakrilamid jel içinde sindirim "gibi Arg-C", bir elde etmek amacıyla özel tasarlanmış bir protokol kullanılarak sindirilmiştir: MS zenginleştirilmiş nükleozom içinde eş ilişkili PTMS karakterize etmek için kullanılır. Aslında, bir yandan Arg-C hPTMs b MS analizi için en iyi proteazdırecause optimal uzunlukta peptidler oluşturur; Öte yandan, bir jel içinde etkili bir şekilde klivaj değildir. Bu sınırlamayı aşmak için, bizim özel protokol şekilde tripsin emdirme ile, ardından döterlenmiş (D 6)-asetik anhidrit ile histon jel bantlar inkübe edilmesi ile elde lizin kimyasal alkilasyon patlatır. Tripsin D 3-asetil lisin, elde edilen karışım, taklit eden peptidler desen (Şekil 1E), bir "gibi Arg-C" bölen etmediğinden.

    Bir lizine bir D 3-asetil yarımının eklenmesi MS doğal ve kimyasal olarak ilave asetilasyon arasında ayrım, 45,0294 Dalton kesin bir delta kütle üretir. Ayrıca, D-3 asetilasyon izobarik modifiye edilmiş peptidlerin ayırt kolaylaştırmak iki ek avantajlar sunmaktadır: İlk olarak, alkilasyon değil, di-ve tri-metillenmiş tortuları, yalnızca değiştirilmemiş ve mono-metillenmiş bir lisin üzerinde oluşur; Bu tür modifiye edilmiş peptidler, aynı tot dayanmaal değişiklikler sayısı ancak farklı düzenlerde farklı olarak kesin m / z vardiya üretmek D 3-asetil grupların farklı bir dizi ile dekore edilmiştir. İkinci olarak, D-3 alkilasyon farklı desenler izobarik modifiye peptitler için 21 ayırma ek bir düzeyde oluşturmak ters faz kolon üzerinde sıvı kromatografi biraz farklı tutma süresine neden olur.

    Mukabil MS / MS spektrumları (Şekil 2B) elle muayene tüm hPTMs doğrulama sonra, etiket serbest miktar iki adımda elde edilir: İlk olarak, modifiye edilmemiş ve modifiye türler sinyal yoğunluğu kullanarak her bir modifikasyon relatif çokluğunu hesaplamak ekstre iyon kromatogram (XIC) 'nin hesaplanması (Şekil 2A ve 2C, üst panel) ile ölçülen karşılık gelen peptid için; İkinci olarak, göreceli zenginleştirme her modificatio nispi bolluk arasında bir oran olarak tahmin edilmektedirn ChIP-ed oktamer ve giriş (Şekil 2C, alt panel) karşılık gelen nispi bolluk. H3 analizi (9-17) peptidi, değiştirilmemiş ve mono-metillenmiş form (Şekil 2C) karşılık gelen tükenmesi ile birlikte, di-ve tri-metillenmiş K9 zenginleştirme göstermektedir. Bu antikor özgüllüğü için pozitif kontrol sonuçları ile, ko-birleşme ya da diğer tüm modifikasyonlar incelmesi olan başka ko-zenginleşmiş histonlar üzerinde, aynı H3 intra-moleküler düzeyde ve inter-moleküler seviyede, her ikisi de değerlendirilebilir Aynı nükleozom. Gen susması ile ilişkili bilinen belirteçlerin önemli zenginleştirme, gen aktivasyonu ile bağlantılı marker mukabil tükenmesi ile görülmektedir: Bu hPTMs H3K9me3 alanları içinde çapraz görüşmelerinin tarama, sözde "heterokromatin modificome" (Şekil 2D) sağlar: . Buna ek olarak, yeni dernekler gibi H3K18m bir zenginlik olarak algılanıre1.

    Heterokromatin içinde co-ilişkilendirme tüm proteinlerin taranması için, klasik çapraz bağlama yonga (hücre kültüründe Amino asitler ile istikrarlı İzotop Etiketleme) SILAC ile birleştirilir (Şekil 3A). SILAC deneyde, lisin ve arginin (açık bir şekilde) kültür ortamı içinde kendi izotopik olarak etiketlenmiş bir analoglan (ağır bir şekilde) ile değiştirilir. Hafif ve ağır ortam hem de büyütülmüş ve hücre çoğaltma üzerine, iki diferansiyel olarak izotop ile kodlanmış amino asitler nedeniyle, belirli bir metabolik Δmass için MS tarafından ayırt sırasıyla proteinlerin hafif ve ağır formları, üreten, protein içine dahil edilir. Büyük çaplı bir SILAC deney başlamadan önce, etiketleme etkinliği sadece ağır etiketli örnek içinde bulunan ağır ve hafif olanları toplamı, karşı ağır peptidlerin yüzdesi fraksiyonu olarak ölçülen birleşme seviyesi hesaplanırken, değerlendirilir. Ağır arginin ve o ikisi için de% 95 daha üstün OrtaklığınAvy lizin protein miktarının doğru (Şekil 3B) için gereklidir. Ağır ve hafif hücrelerinin çapraz bağlanması sonrasında, kromatin sonikasyonla parçalanır. SILAC kökenli spesifik H3K9me3 inter aktörlerin ayırmak amacıyla K9 tri-metilasyonu taşıyan eriyebilir H3 peptid (QTAR K STGG) aşırısı kat kullanan bir rekabet analizi ile bağlantılı olarak kullanılır. Çözünür peptid bu antikorun bağlanma kapasitesi, bu nedenle, buna göre, spesifik inter aktörlerin H3K9me3-nükleozom çoğunluğu "out rekabet" ve doyurur iki SILAC ChIP deney, biri aşırı miktarda ilave edilir. Diğer SILAC kanalında, rekabet eden peptit çipe ilave edilir ve immünopresipitasyon normal olarak gerçekleşir değildir. SILAC rekabet deneyleri, genellikle, fazla çözünür peptid ile rekabet th açıldıktan sözde "ileri" ve "geri" biçimleri, iki kopya halinde gerçekleştirilene ışık (L) kromatin örnekleri (H) ağır. Bu spesifik olmayan bağlayıcı ikinci orijinal seçici için kullanılan ters tamamlayıcı SILAC oranı okumalar ile sonuçlanır: özel olarak zenginleştirilmiş proteinler deneyinde hafif bir şekilde (protein oranı H / L> 1) ile karşılaştırıldığında, ağır biçimde daha yüksek bir yoğunlukta bulunduğu yerlerde aşırı peptid ışık kanalı (Forward) (Şekil 4A, üst panel) ilave edilir; tam tersi bir eğilim (protein oranı H / L <1) Ters kopya (Şekil 4A, alt panel) gözlenmiştir. , Yoğunluğu, ağır ve hafif biçimde hem ileri ve hem de ucuz olan ve Ters deneyler 1, sabit bir oran yakın üretmek ve arka (Şekil 4B) olarak sınıflandırılır proteinler.

    Çözünür peptit için en uygun fazla kıvrımın seçimi önemlidir ve doğru bir şekilde ayarlanması gerekmektedir. Tipik olarak, bir rekabet tahlili USI yerine doğru antikor-to-peptid oranı ayarlamakfazla peptid seri dilüsyonları ng ve Western Blot veya MS ile peptid eklenmez pozitif kontrol çipi arasındaki "yem" (HPTM / protein), ve farklı seri rekabet cips, seviyesinin karşılaştırılması. Genel olarak, uygun kat fazla peptid% 90 imüno malzeme HPTM / protein miktarını azaltır. Aslında, bir taraftan daha büyük olan, elde edilen protein oranı, SILAC olan ilişkisini daha yüksek; Öte yandan, peptid tarafından aşırı bir satürasyonu böylece miktar ve istatistiksel analiz için H / L oranı eksik yol açan, tam olarak antikorundan belirli bağlayıcılar tahliye edebilir. H3K9me3 antikor için biz, QTARK (me3) STGG peptid için H / L oranını ölçerek doğru oranını tanımlanan bir Forward yürütülen bir yarışma testinde kurmak ve biz rekabet verimlilik (Şekil 3C bir önlem olarak bu değeri aldı .)

    Bir ileri bir kesişmeX-Chip deneyler Ters d iki deneyde de bulunan ve en az 2 sayısı oranı ile belirlendi 635 proteinlerin tanımlanmasına yol açar. Onların H / L oranlarının günlük 2 arsa hakiki H3K9me3 interaktörler açıkça proteinlerin oranının dağılımlarının üst% 40 (sağ üst kadranda içinde mevcut proteinler olarak tanımlanan sözde "heterochromatome" (Şekil 4C) temsil dağılım arsa ve Şekil 4D).

    Şekil 1
    Şekil 1:. N-ChroP iş akışı MS analizi ile birlikte yerli ChIP A) Plan şematik görünümü. Hücrelerinden Kromatin MNase ve mono-nükleozom (S1) zenginleştirilmiş fraksiyon, bir anti-H3 kullanılarak imüno-çökeltilir ile sindirilmektedirK9me3 antikor. Immünoglobülinleri proteinler SDS-PAGE ile ayrılmış ve çekirdek histon jel-sindirilmiş bir Arg-C sindirimi taklit bir ad hoc protokolü ile vardır. Peptidler nano-LC-MS/MS tarafından analiz edilir. Histon PTMS MS / MS spektrumları elle muayene ile doğrulanır ve sayısal tespit edilmiştir B) Küçük ölçekli MNase testi:. Farklı zaman atlamalı (sol panel) MNase ile kromatin sindirim sonra% 1 agaroz jeli üzerinde çözülmüş DNA; Büyük ölçekli MNase sindirim:. DNA zenginleşme C) Tahmini poli-nükleozom (sağ panel) ihtiva eden, S2 fraksiyonundan mono-nükleozom ihtiva MNase kromatin sindirim 60 dakika sonra ve S1 fraksiyonun ayrılmasından sonra bir% 1 agaroz jeli üzerinde çözüldü / değiştirilmemiş tükenmesi, mono-, di-, ve akış yoluyla tri-metillenmiş K9 (FT) girişi (IN) ile karşılaştırıldığında. Histogram her değişiklik kromatin giriş ve co-immün. D) SDS-PAGE için üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SEM temsil eder Saflaştırılmış proteinler:. çekirdek H3, H4, H2A ve H2B histonlar immüno-nükleozom ve giriş hem de her bir çekirdek histon (kullanarak kimyasal olarak dötere alkillenerek görünür çevresinde ve 17kDa bandının altında, H2B, H3 ve co-göç (siyah kareler) E) sahip bulunmaktadır Jel sindirime "gibi Arg-C", bir elde etmek amacıyla, tripsin muamelesi vasıtasıyla, önce D 6)-asetik anhidrid. D 6-asetik anhidrit modifiye edilmemiş ve mono-metillenmiş bir lisin epsilon amino grubu ile reaksiyona giren fakat di-metillenmiş, metil-ve tri asetil lisin ile. Sonuç olarak, tripsin enzimatik aktivitesi bu şekilde sindirim modeli "gibi Arg-C" üreten bir, tüm yerel ve kimyasal asetillenmiş lizin engellenir. Bu rakam referans olarak Şekil 1, Şekil S1 ve Şekil S5 kullanarak, 21 modifiye edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

    "Fo: keep-together.within-page =" always "> Şekil 2,
    Şekil 2:. Mütekabil m / z değeri ile inşa Kütle Spektrometresi H3K9me3 "modificome" A analizi) Zoomed kütle spektrumu ve ekstre iyon kromatogramları, (XIC) 2 + şarj değiştirilmemiş, mono-, di-, ve tri-metillenmiş H3 K9 (9-17) peptid, her iki giriş ve ChIP örnekler için. B) Temsilcisi MS / MS spektrumları CID parçalanma kullanarak. B-ve y-iyon iyon serisi (H3 dizisini (9-17) peptid ve spesifik olarak tanımlamak için tortu, K9. C tri-metilasyonunu lokalize) H3 K9 üzerinde metilasyon farklı derecelerde nispi bolluk sağlamak 9-17) peptidi, tümüne karşılık gelen alanların toplamı her modifiye edilmiş peptid, eğri (AUC) altındaki alanı bölünmesiyle hesaplanmaktadır unmodifi gözlenened ve giriş ve yonga-ed oktamer bu peptidin değiştirilmiş biçimleri de dahildir. Histogram her değişiklik (üst panel) için üç bağımsız deneyden elde ± SEM ortalama temsil eder. H3 (9-17) peptidi olarak K9 metilasyonla nispi zenginleştirme. Zenginleştirme giriş karşılaştırmak olarak parçalara-ed oktamer her bir metilasyon görece bolluğu arasında bir log 2 oranı olarak ifade edilir. Histon H3, H4 ve H2A üzerinde tespit edilen tüm eş ilişkilendirme hPTMs zenginleşmesini özetleyen Histogram, üç bağımsız deneyin (alt panel) için ± SEM ortalamalar temsil eder. D) İlgi haritası. Her satır, farklı bir modifikasyonu (nd değişiklik tespit edilmez) karşılık gelir. Bu rakam Şekil 1, Şekil 2, referans olarak Şekil 3 ve Şekil S10 kullanarak, 21 modifiye edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.


    Şekil 3:. MS analizi ile kombine ChIP çapraz bağlama X-ChroP iş akışı A) Şema şematik görünümü. Formaldehit ve kromatin girişler DNA parçalarını üretmek için sonikasyonla parçalanmış ile hafif ve ağır medya yetiştirilen hücreler sabittir. Bir Forward kurmak olarak, sonike ağır etiketli kromatin ışık etiketli kromatin K9me3 açısı çözünür H3 peptidin bir fazla kat ile doyurulmuş, aynı antikor ile inkübe edilir ise anti-H3K9me3 antikoru kullanılarak imüno-çökeltilir. Ağır ve hafif chromatins ikinci çökeltilmiş proteinler, bir araya getirilmiş, ekstre edilmiş ve SDS-PAGE ile ayrılmıştır. SILAC etiketleme) proteinler tripsin ile sindirilir ve peptidler nano-LC-MS/MS. B ile analiz edilir Verim ağır Lys birleşme hesaplanması izlenirine (Lys8) ve arginine (arg10) proteinlere. Arsa, lisin ve arginin peptidler yoğunluk dağılımının ortanca sırasıyla 0,974 (yeşil hat) ve 0.964 (kırmızı çizgi),. C) 2 + şarj tri-metillenmiş gelen m / z değeri ile Zoomed kütle spektrumları eşittir Her iki hafif ve giriş ve yonga-ed oktamer ağır formları için H3 K9 (9-17) peptidi,. Giriş ağır ve hafif peptidin yoğunluklar SILAC ileri parçası içinde, 1 yakın olsa da, hafif peptidin yoğunluğu bu şekilde etkili bir rekabet gösteren ağır meslektaşı olandan çok daha düşüktür. Işık D) SDS-PAGE (L) ve ağır (H) kromatin giriş etiketlenmiş ve ko-immünopresipitasyon malzemesi: girişinin sadece iki dilim katkısı test analizleri (analiz ise yonga ed malzemesine karşılık gelen şerit, on dilimleri (siyah çizgi) kesilir mavi çizgi). Bu rakam yeniden olarak Şekil 4 ve Şekil S6 kullanarak, 21 modifiye edilmişFerence. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

    Şekil 4,
    Şekil 4: H3K9me3 "interactome" Kütle Spektrometre analizi. A) HP1 gelen peptidler ve makro-2A proteinlere karşılık SILAC-çiftini gösteren Temsilcisi dolu spektrumları: Ters yinelemede oranları H / L <1 ile yansıtılmış oranları İleri deney (üst panelleri H / L> 1), (alt paneller), Heterokromatinde bu proteinlerin spesifik zenginleştirme göstermek B) SILAC-çift, bir arka plan proteini peptidine tekabül eden Örnek, tam spektrumu:. Sayısallaştırılmış proteinleri) ilet H / L oranları ve tekrarlamalı olarak 1 ° C'ye eşittir ters. distribut vardırOnların Forward'da SILAC-oranlarının (sırasıyla x ve y eksenleri) Ters deneylere dayalı bir dağılım arsa ed; kırmızı noktalı çizgiler belirtildiği gibi, üst% 40 ve protein oranları% 30 temsil eder. girişinden D) Protein oranları dağılımı (H / L) siyah () 01:01 karışık, İleri (mavi) ve Reverse (turuncu) X-ChroP deneyleri; kırmızı noktalı çizgiler gerçek uygulayıcılarını seçmek için eşik olarak ayarlanmış protein oranları, üst% 40 temsil eder. Bu rakam referans olarak Şekil 5 kullanıyorum, 21 modifiye edilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

    Bölüm 2 için Tampon Bileşim
    Lysis Buffer % 10 sukroz, 0.5 mM EGTA, pH 8.0, 15 mM NaCl, 60 mM KCI, 15 mM HEPES,% 0.5 Triton, 0.5 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 mM NaF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml Aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml Löpeptin
    Sukroz minder Liziz Tamponu, 20 ml 2 g sükroz
    Sindirim Tampon 0.32 M sukroz, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.1 mM PMSF
    TE Tampon 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA
    Diyaliz Tampon 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 5 mM NaF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, proteaz inhibitörleri kokteyli
    ChIP Seyreltme Tampon 100 mM Tris HCl pH 7.6, 100 mM NaCl ve 10 mM EDTA
    Çözüm Engelleme PBS içinde% 0.5 BSA
    Buffer Yıkama 50 mM Tris-HCl, pH 7.6,10 mM EDTA
    Proteaz İnhibitörleri EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri kokteyli, 0.5 mM PMSF, 5 mM NaF, 5 mM Na3VO4, 5 mM NaButyratE
    Yükleme Tamponu H20 içinde portakal yükleme boyası,% 50 (v / v) gliserol
    3. kısım için Tampon Bileşim
    Lysis Buffer 50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 10 gliserol,% 0.5 NP-40,% 0.25 Triton-100, 0.5 mM PMSF, 5 mM NaF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml Aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml Löpeptin
    Buffer Yıkama 10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0.5 mM PMSF, 5 mM NaF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml Aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A , 5 mg / ml Löpeptin
    Kuluçka tampon ChIP 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA,% 0.1 sodyum deoksikolat,% 0.5 sodyum lauroylsarcoside, 0.5 mM PMSF, 5 mM NaF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate 5mg / ml Aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml Löpeptin
    Buffer 2 Yıkama 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM EDTA,% 0.1 SDS,% 1 Triton-100,
    Yükleme Örnek Tampon 250 mM Tri-HCl, pH 8.8, 0.5 M b-merkaptoetanol,% 2 SDS
    Bölüm 4 için Tampon Bileşim
    Alkillemesi Tampon 55 mM 50 mM NH4 HCO3 içerisinde iyodoasetamit
    Azaltma Tampon 10 mM, 50 mM NH4 HCO 3 ditiotreitol
    Ekstraksiyon Tampon GKD 2 içinde% 30 ACN ve% 3 TFA 0

    Tablo 1. Tamponlar Bileşimi.

    Edinimi dosyasını Tuning Parametreler
    FT tam SCAn birikimi hedef değer 1 x 10 6; maksimum dolum süresi 1.000 msn
    Msn birikimi hedef değer 10 x 10 4; maksimum dolum süresi 150 msn
    Alma ayarı Parametreler
    Elektro gerilim 2.4 kV
    Kılıf ve yardımcı gaz akışı Hayır
    İyon transferi kılcal sıcaklık 200 ° C
    Dinamik dışlama MSMS üzerine 60 saniye kadar 500 öncüsü iyonlar
    Dışlama kitle genişliği 10 ppm
    Geniş-bant aktivasyon modunu kullanarak normalize çarpışma enerjisi % 35
    İyon seçim eşikleri 100 sayım
    Aktivasyon q 0.25
    Activtirme zamanı 30 msn

    Tablo 2.. MS ayarları.

    Mascor Deamon arama Parametreler Notlar
    Veritabanı (:; 87.061 girdiler insan veritabanı sürümü 3.68 yani HeLa hücreleri) organizmaya bağlıdır
    Enzim Arg-C Her arginin kalıntısının C-terminalinde Arg-C cleave
    Değişken modifikasyonlar asetil (K), oksidasyon (M +), D-3 asetilasyon (K), metil-D 3 - asetil (K), dimetil (k), trimetil (K) asetil [42.010 Da], oksidasyon [15.995 Da], D3-asetilasyon [45,0294 Da], metil-D3-asetil [14,016 Da ve 45,0294 Da toplamı], dimetil [28.031], trimetil [42.046 Da]
    Cevapsız bölünmelerin 2 kadar
    Arama ana iyonların kütle doğruluğu 10 ppm
    CID MSMS için Mass-doğruluk 0.5 Da
    MaxQuant arama Parametreler Notlar
    Veritabanı organizmada bağlıdır
    Enzim tripsin / P Tüm lisin ve arginin kalıntısının C-terminalinde Tripsin. Arama hesabına tripsin verim lisin ayrılması için ve bir sonraki amino asit, prolin (/ P) olduğunda arginin azalır gerçeğini alınarak gerçekleştirilir.
    Sabit modifikasyonu karbamido
    Değişken modifikasyonlar N-asetil (protein), oksidasyon (M +)
    Cevapsız bölünmelerin 3'e kadar
    Etiket parametreleri lys8 ve arg10
    Maksimum etiket amminoacid Tripsin 3
    Ilk "Andromeda" arayışı içinde ana iyonların kütle-doğruluk 20 ppm
    Ana "Andromeda" arayışı içinde ana iyonların kütle doğruluğu 6 ppm
    CID MSMS için Mass-doğruluk 0.5 Da (Da per100 altı üst tepe)
    Peptit yanlış keşif oranları (FDR) 0.01
    Protein yanlış keşif oranları (FDR) 0.01 0.01 peptid ve protein için FDR ayarlama tespit hem peptidlerin ve proteinlerin, yanlış pozitif% 1 içermesi beklenmektedir anlamına gelir. Bu değer, hedef-yem veritabanı kullanılarak tahmin edilmektedir
    Maksimum posterior error olasılık (KEP) 1 PEP bir tek peptid bir yanlış pozitif maç olduğunu olasılığıdır. Ayarlarınızı 1'e eşittir KEP tüm peptidler böylece filtreleme FDR münhasıran dayalı bakılmaksızın KEP alınması anlamına gelir.
    Minimum peptid uzunluğu 6
    Peptidler asgari sayısı 2
    Eşsiz peptidler asgari sayısı 1
    Sadece değiştirilmemiş peptidler ve oksidasyon (M) kullanılarak / asetil (Protein N-Dönem) seçeneğini etkinleştirin Bunların bolluğu karşılık gelen proteinin oranı yansıtmıyor olabilir çünkü modifikasyonlarla peptidler genel olarak protein miktarının belirlenmesi için sayıldı olmamalıdır.
    Minimum oran sayısı 1
    "Koşular arasında Maç" seçeneğini etkinleştirin

    Tablo 3. Veri Analizi.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Yakın zamanda ChroP, kromatin protein bileşenlerinin büyük ölçekli karakterizasyon için nicel bir strateji tarif edilmiştir. ChroP epigenetik alanında kullanılan iki tamamlayıcı yaklaşımlar, Chip ve MS, güçlerini istifade ve kendi sınırlarını aşma birleştirir. Derin dizileme (ChIP-Seq) birleştiğinde ChIP birkaç nükleozomların 35 çözünürlükte histon modifikasyonları genom haritalama sağlar. Duyarlılık için avantajlı olsa da, antikor-bazlı deneyler benzer değişiklikler ayırt etme yeteneği ve histon kod 36 birleştirici yönü diseksiyon sınırlıdır. MS hPTMs, tek başına ve kombinasyon 9 içinde kapsamlı ve ilgili analizini sağlar iken, diğer yandan, bu şimdiye kadar lokus spesifik PTMS patters ile ilgili bilgileri ve bunun sonucunda eksikliği ile, dökme kromatin analizi uygulanmıştır. Biz işlevsel izole etmek ChIP değiştirilmiş bir sürümünü kullanırhiston PTM desen ve olmayan histonic proteinleri karakterize etmek için farklı kromatin etki ve kütle spektrometresi özellikle co-zenginleştirilmiş.

    N-ChroP kullanarak, H3K9me3 ile birlikte bağlantılı hPTMs analizi sessiz kromatin ile bağlantılı marker önemli bir zenginleştirme ve aktif kromatin ile bağlantılı değişikliklerin bir tükenmesi saptandı. Önceki çalışmalarda 37 ile bu sonuçlar anlaşma stratejisinin sağlamlığını kanıtladı. H3K9me3 etki X-ChroP olarak, kromatin etkileşen proteinlerin SILAC tabanlı soruşturma ve böylece doğrulama yöntemi, bazı daha önce tarif edilen inter aktörlerin doğruladı.

    ChroP kromatin proteomik bileşeni araştırmak için zaten mevcut stratejileri açısından iki ana orijinal yönlerini sunar: Örneğin, aynı bozulmamış mono-Nucl içinde farklı çekirdek histonları dekorasyon değişiklikler arasında inter-moleküler birlikteliğini ortaya çıkarmak için olasılıkN-Chip tarafından arıtılmış eosome; histon varyantları ve bağlayıcı histon alt tiplerinin belirli compartmentalization değerlendirmek için ikinci şans. Histon varyantları soruşturma kaliteli reaktifler (yani antikorlar) eksikliği geri düzenlenen olduğundan, ChroP onların konumu ve fonksiyonel rolünü değerlendirmek için mevcut eşsiz bir araç olarak ortaya çıkmaktadır.

    Bugünkü içinde ChroP bir sınırlama kısa peptidler ve değişiklikler arasında uzun mesafe bağlantı tespit sonucu değer düşüklüğü sindirilir histonlarla, MS kullanılan peptid-merkezli ("Bottom-up") yaklaşımı yatıyor kurmak. Bu nedenle, "alt-up" MS analizi ile ChroP bir birleşme histon kod kombinasyon yönünün kısmi değerlendirilmesine olanak tanımaktadır. Biz daha uzun peptitler üzerinde hPTMs haritalama için "Orta ve Üst-Aşağı" gibi alternatif MS stratejiler, (> 20 aa) kadar sağlam proteinler üzerinde için 38-40, uygulanması üstesinden olacağını öngörüyoruzBu kısıtlama.

    Genel olarak, N-ve X-ChroP mono-oligo-nükleozomlann çözünürlüğe sahip, fonksiyonel olarak farklı etki de kromatin yapısının karmaşıklığını diseksiyon imkanı ile, tamamlayıcı nitelikte. Biz ChroP örneğin transkripsiyon faktörleri (TF) için, spesifik olmayan histonic nükleer proteinlerin varlığı ile işaretlenir kromatin bölgelerin bileşiminin karakterize edilmesi için de yararlı olacağı tahmin. Buna ek olarak, ChroP küresel transkripsiyonel aktivasyon sırasında, örneğin, çeşitli düzensizlikler üzerine belirli lokusların kromatin dinamik bileşimi harita fonksiyonel çalışmalarda da kullanılabilir. Bu nedenlerle, ChroP kromatin proteomik manzara incelemek için mevcut analitik stratejileri cephanelik ek yararlı bir araç olarak ortaya çıkmaktadır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Acknowledgments

    Bu araştırma aslında Mol Cell Proteomics yayınlandı. Soldi M. ve Kromatin Fonksiyonel Alanlar Bonaldi T. Proteomic İncelenmesi Farklı Heterokromatin Bileşenler MCP arasında Roman birlikteliğini ortaya çıkarır. 2013; 64-80: 12. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için American Society. Biz yazının eleştirel okuma için Roberta Noberini (Teknoloji ve Ieo İtalyan Enstitüsü, İtalya) teşekkür ederim. TB iş Giovanni Armenise-Harvard Vakfı Kariyer Geliştirme Programı, Kanser Araştırma ve İtalyan Sağlık Bakanlığı için İtalyan Derneği hibe tarafından desteklenmektedir. MS çalışma Firc burs ile desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
    2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
    3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
    4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
    5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
    6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
    7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
    8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
    9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
    10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
    11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
    12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
    13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
    14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
    15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
    16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
    17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
    18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
    19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
    20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
    21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
    22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
    23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
    24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
    25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
    26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
    27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
    28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
    29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
    30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
    31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
    32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
    33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
    34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
    35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
    36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
    37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
    38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
    39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
    40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

    Tags

    Biyokimya Sayı 86 kromatin histon translasyon sonrası modifikasyonlar (hPTMs) epigenetik kütle spektrometresi proteomiks SILAC kromatin immunopresipitasyon histon varyantları chromatome hPTMs çapraz görüşmeler
    ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP… More

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter