Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren zum schnellen und genauen Messung der Flugleistung in Drosophila, was eine Hochdurchsatz-Screening.
Abstract
Drosophila hat sich als ein nützliches Modellsystem für die Analyse des Verhaltens, einschließlich der Flug sein. Die ersten Flug Tester beteiligt Drop fliegt in eine Öl-beschichtet Messzylinder; Landehöhe ein Maß für die Flugleistung durch die Beurteilung, wie weit entfernt fallen wird vor der Herstellung genug Schub, um den Kontakt mit der Wand des Zylinders zu machen. Hier beschreiben wir eine aktualisierte Version der Flug-Tester mit vier großen Verbesserungen. Zuerst haben wir eine "Fallrohr", um sicherzustellen, dass alle Fliegen geben Sie die Flug Zylinder bei einer ähnlichen Geschwindigkeit zwischen Studien, wodurch die Variabilität zwischen den Nutzern. Zweitens, die Ölschicht ersetzt wir mit herausnehmbaren Kunststoffplatten in Tangle-Falle, einem Klebstoff entwickelt, um lebende Insekten einzufangen beschichtet. Drittens verwenden wir einen Zylinder mehr, um genauere Unterscheidung der Flugfähigkeit zu ermöglichen. Vierte verwenden wir eine Digitalkamera und Bildbearbeitungssoftware, um die Scoring der Flugleistung zu automatisieren. Diese Verbesserungen ermöglichen die Rap-id, quantitative Bewertung der Flugverhalten, nützlich für große Datenmengen und große genetische Bildschirme.
Introduction
Drosophila ist seit langem verwendet, um die genetischen Grundlagen von Verhalten 1 zu studieren, und Forscher haben eine Reihe von Möglichkeiten, um verschiedene Arten von Verhalten analysieren 2-6 entwickelt. Fliegen haben sich als besonders nützlich, um nützliche Modelle von neuromuskulären Erkrankungen 7 gewesen. Ein gemeinsamer Test verwendet, um Bewegungsverhalten zu studieren, ist Flugleistung. Die ursprünglichen Flug Tester ist nützlich für die Identifizierung Flug Mutanten und quantitative Bewertung der Flugfähigkeit ein, aber es hat einige Mängel, die seine Anwendung für Hochdurchsatz-Screening zu begrenzen: die Verwendung von Öl-beschichteten Zylindern ist chaotisch und umständlich, bestimmte Features wie die Länge des Zylinders und der Einführung der Fliegen in das Rohr mit variabler Kraft zu reduzieren quantitative Genauigkeit, und es ist schwierig, lebende entfernt von dem Testgerät zu erholen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir den Flug Tester modifiziert, um eine Reihe von Verbesserungen enthalten. Wir haben einen "Tropfen tuwerden ", um Fliegen, um die Variabilität zwischen den Experimenten und Benutzer zu beseitigen einzuführen. Wir verwenden abnehmbaren Acrylplatten mit einem Klebstoff, der für eine einfachere Bereinigung und Wiederherstellung einzelner Fliegen ermöglicht beschichtet. Wir haben die Länge der Flugrohr erhöht, um quantitative Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu verbessern. Schließlich verwenden wir eine Digitalkamera und Bildbearbeitungssoftware, um die Landung Höhen von Fliegen zu berechnen. Wir glauben, diese Verbesserungen sinnvoll, jedem Labor interessiert bei der Durchführung von Großbildschirme für genetische Defekte in Flugleistung sein.
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Protocol
1. Montieren Flug Tester
- Sichere Flug Zylinder Ring Stand 1 mit Spannketten. (Lassen Sie ca. 3 cm unterhalb des Zylinders für wiegen Gericht.)
(Anmerkung: Der Flug Zylinder wir benutzen, ist 90 cm lang, mit einem Durchmesser von 13,5 cm.) - Legen Sie wiegen Schale mit einer dünnen Schicht von Mineralöl unter der Flug Zylinder.
- Sichere Trichter Ring Stand 2 mit einem Klemmring und Klauenklemme. Einstellen der Höhe des Trichters, so daß der Boden des Trichters ist bündig mit der Oberseite des Luftzylinders. (Anmerkung: der Spitzendurchmesser des Trichters muß kleiner als der Außendurchmesser der Röhrchen in die Fallrohre angeordnet, so daß die Ampullen nicht durchfallen können.)
- Legen Fallrohr von oben in den Trichter und befestigen Sie sie mit einer Klaue Klemme.
(Hinweis: Wir verwenden ein Fallrohr, die 25 cm lang ist Dropping fliegen haltigen Fläschchen aus dieser Höhe ermöglicht die konsistente Ausstoß aller Fliegen mit gleichmäßiger Kraft Der Innendurchmesser des Fallrohres sollte sligh sein..tly größer als der Außendurchmesser der Ampulle, damit das Fläschchen fallen frei.) - Schneiden Sie Polyacrylamid-Blatt (n) auf die richtige Größe. (Hinweis: Um beim Einführen und Entfernen der Folie zu erleichtern, sollte die Breite geringfügig kleiner als der Innenumfang des Luftzylinders sein).
- Tragen Sie eine dünne Schicht der Tangle-Falle auf das Blatt. Man lässt 1 h vor der Verwendung zu sitzen. (Hinweis: Lassen Sie genug Platz am oberen und unteren Rand des Blattes (ca. 3 cm) unbeschichtet, um das Blatt zu Einfügen / Entfernen zu erreichen.)
- Legen Sie die Polyacrylamid-Blatt in der Flug Zylinder.
- Montieren Sie die Kamera Spur mit Pinien Halterungen. (Hinweis: dafür sorgen, dass der Boden der Spur kann die Kamera ohne die Blockierung der Linse unterstützt siehe Abbildung 1B.).
- In Stopfen und festschrauben. (Anmerkung: Ort, die Anschläge an Orten, damit die Kamera die gesamte Kunststofffolie in Panoramamodus anzeigen wird.)
2. Führen Experiment
- <li> Sammeln Fläschchen entfernt getestet werden. Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie nicht mehr als 20 Fliegen / Fläschchen.
- Klopfen Sie leicht nach unten fliegt der Fläschchen, trennen, dann in Fallrohr stecken und lassen Fläschchen.
(Anmerkung: Das Fläschchen fällt das Fallrohr, bis er den schmalen Trichteröffnung trifft, wenn die Ampulle trifft den Trichter, sind die Fliegen in die Flucht Zylinder ausgestoßen.). - Heben Sie das Fallrohr, um die leere Flasche zu entfernen.
(Hinweis: Mehrere Fläschchen von Fliegen aus dem gleichen Testgruppe können auf einem einzigen Blatt untersucht werden Polyacrylamid Wir finden, dass bis zu 200 Fliegen (10 Fläschchen mit je 20 entfernt) kann getestet und leicht abgebildet werden auf einem einzigen Blatt.. - Entfernen Sie die Plastikfolie und legen Sie es auf eine ebene weiße Fläche.
(Anmerkung: weißes Plakat Bord verwendet werden, wenn Tischplatten sind dunkel gefärbt.) - Montieren Sie die Kamera Spur über die Kunststofffolie. Die Kamera sollte ausreichend hoch über dem Blatt, um sowohl den oberen und unteren Rand des Blattes in dem Sichtfeld zu haben.
- Schieben Sie die Kamera entlang the Spur, während die "Capture"-Taste gedrückt halten, um ein Panoramabild zu erwerben.
- Die Anzahl der Fliegen Landung in der Öl kann manuell für jeden Versuch gezählt.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,7 für alle Bedingungen in einem gegebenen Experiment. Die Fliegen können aus dem Bogen zwischen jedem Versuch entfernt werden. Alternativ können mehrere Folien verwendet werden, mit einem neuen Blatt für jeden Versuch.
3. Data Collection
- Bilddateien öffnen mit ImageJ Software.
- Crop Bilder, wenn notwendig, nur die Landefläche umfassen. (Dies ist der Bereich, in Tangle-Trap-beschichtet.)
- Konvertieren von Bildern in 8-Bit-Graustufen.
- Erstellen Sie eine "Schwelle" zu filtern, die weißen Hintergrund.
(Bild → Einstellen → Threshold). - Stellen Sie die Parameter, jede Fliege über das Menü "Analyse-Partikel" zu identifizieren.
(→ Analysieren Analysieren Partikel) Definieren Sie die verwendet werden, um ein Teilchen zu identifizieren Parameter. Mit unserem eingerichtet ist, finden wir, dass mit einFläche von 5-90 Pixel 2 und einer Rundheit von 0,4-1,0 wird genau zu identifizieren, alle Proben. - Messen Sie die Lage der einzelnen Fliege unter Verwendung der erzeugten Liste von Koordinaten für jedes Teilchen. Die x-Koordinate in Pixeln in Zentimeter umgerechnet werden, um die Landehöhe zu berechnen.
- Importieren Tabelle in einer Tabellenkalkulation (zB Microsoft Excel).
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Representative Results
1A zeigt eine schematische Darstellung des aktuellen Flug Tester Montage. 1B zeigt die Spur Design ermöglichen die Kamera zu einem Panoramabild, ohne dabei das Sichtfeld zu nehmen. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2, wo die Flugleistung der Langweiler mutierten Fliegen, die eine bekannte Flug Defekt 8-10 haben, werden zu Wildtyp-Canton-S fliegt Vergleich gezeigt. Kontrolle fliegt konsequent landen in der Nähe der Oberseite des Zylinders, mit sehr wenig Verbreitung unter den Individuen und einer durchschnittlichen Höhe von 73 Lande ± 2,0 cm. Im Gegensatz dazu zeigen slowpoke Fliegen eine viel abwechslungsreiche Landung Verbreitung und Land deutlich niedriger, im Durchschnitt 44 ± 4,1 cm. Alle Fliegen wurden auf 3 Tage bei Raumtemperatur (23 ° C) erhöht.
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Fig. 1 ist. Diagrams of Flight Tester, Kamera, und der Spur. (A) Darstellung der für den aktuellen Flugprüfer festgelegt. Stand 1 Ring hält die 90 cm hohe Flug Zylinder; Ring Stand 2 hält den Trichter und die 10 cm lange "Fallrohr". (B) Schematische Darstellung der Kamera und Track verwendet werden, um ein Panoramabild zu erzeugen. Die Kamera sollte durch die Spur, ohne zu behindern den Blick von der Linse unterstützt werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Repräsentative Ergebnisse aus einer Stichprobe Flugexperiment. Vergleich von Flugvermögen der drei Tage alten Canton-S Steuer fliegt Mutanten (slo ts1) Langweiler. (A) Bildschirm fängt für Langweiler und Kontrollfliegen Anzeige der Landung Höhen der einzelnen Angaben. Jeder blaue Kreis stellt die Position einer einzelnen Fliege. Diese Landehöhen werden verwendet, um die durchschnittliche Zielhöhe (B) sowie die Gesamtverteilung (C) für jeden Genotyp zu berechnen. Männliche und weibliche Fliegen wurden in jeder Probe zusammengelegt. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Mit den hier beschriebenen Methoden haben wir in der Lage, schnell zu beurteilen Flugleistung aus einer großen Anzahl von Drosophila-Mutanten, die Bereitstellung effizienter als bisher möglich. Für unsere Experimente haben wir routinemäßig zu trennen Männer und Frauen, und heben Sie sie bei geringer Dichte (weniger als 20 Fliegen / Fläschchen), um Aggression, die Flügel Schaden zu begrenzen. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist für die Unterschiede in der Flugleistung wegen der unterschiedlichen genetischen Hintergrund richtig zu steuern. Wir finden auch, es hilft, um Fliegen zu ermöglichen mindestens 24 Stunden, um von Betäubung mit Kohlendioxid vor der Flugerprobung erholen. Alternativ kann Fliegen durch Kälte Temperatur (4 ° C), um eine schnellere Wiederherstellung ohne das Verhalten potenziell beeinflussen lassen betäubt werden.
Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in diesem Protokoll wird die Fliegen Entfernen von der Kunststoffscheibe zwischen Studien. Eine Methode, um die Effizienz zu erhöhen, ist eine große Anzahl o verwendenf Blätter gleichzeitig, abgesehen von den Platten, wie sie verwendet werden und Reinigungs sie alle auf einmal folgende Datenerfassung. Fliegen, die auf den Boden fallen, müssen manuell gezählt werden, da sie nicht auf der Platte enthalten sein. Dennoch ist dies einfach im Vergleich mit Landehöhe manuell berechnen. Die Notwendigkeit, die Tangle-Falle auf jedem Blatt erneut wird je nachdem, wie dick die Beschichtung variieren. Nach unserer Erfahrung wird ein Einzelblatt einen Monat dauern, bevor eine neue Beschichtung erforderlich ist.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Tangle-Falle über Mineralöl ist die Möglichkeit, Live-Fliegen aus dem Blatt zu erholen. Da die Fliegen nur an der Oberfläche der Tangle-Falle stecken, statt sie eingetaucht ist, können einzelne Fliegen leicht entfernt werden. "Flightless" Fliegen, die auf den Boden fallen, kann auch durch den Austausch des Mineralöl-Tablett mit einer leeren Flasche zurückgewonnen werden.
Wir glauben, dass die automatisierte Messung der hier beschriebenen Flugverhalten bietet eine numBER von Vorteilen gegenüber früheren Verfahren, so dass für einen höheren Durchsatz, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit für genetische Screens. Automatisierte Scoring wurde auch verwendet, um den Durchsatz für die Verhaltenstests wie dem RING-Assay 11 zu erhöhen. Weiterhin ist die direkte Messung der Landehöhe eine größere Empfindlichkeit als ein einfacher Pass / Fail-Messung (% Flieger, etc.), So dass wir mehr feine Unterschiede in der Flugleistung zu erkennen.
Der hier beschriebene Assay kann durch nachfolgende weitere Tests, die komplexere Aspekte der Flugverhalten, einschließlich visuelle Kontrolle der Fluggeschwindigkeit 12 und Freiflug-Reaktionen auf Bewegung messen 13 ergänzt werden. Während diese Tests zeitaufwendig und nicht zugänglich große genetische Screens, kann sie dazu beitragen, mehr Informationen bezüglich eines bestimmten Gen-Funktion in eine Bewegungsantwort bereitzustellen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt F32 NS078958 (DTB) und R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
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