Summary
Her beskriver vi en fremgangsmåde til hurtig og nøjagtig måling af flyveegenskaber i Drosophila, så high-throughput screening.
Abstract
Drosophila har vist sig at være en nyttig model for analyse af adfærd, herunder flyvning. Den indledende flyvning tester involveret droppe flyver ind i en olie-belagt måleglas, landing højde forudsat en foranstaltning søgning ydeevne ved at vurdere, hvor langt fluer vil falde, før de producerer nok stak at komme i kontakt med væggen af cylinderen. Her beskriver vi en opdateret version af flyvningen tester med fire store forbedringer. Først, vi tilføjet en "drop tube" for at sikre, at alle fluer ind flyvningen cylinder på et tilsvarende hastighed mellem forsøg, fjerne variation mellem brugerne. For det andet, vi erstattet olie-coating med aftagelige plastplader belagt i Tangle-Trap, et klæbemiddel designet til at fange levende insekter. For det tredje, bruger vi en længere cylinder at muliggøre en mere præcis diskrimination søgning evne. Fjerde vi bruge et digitalt kamera og imaging software til at automatisere scoring søgning ydeevne. Disse forbedringer giver mulighed for rapid, kvantitativ vurdering søgning adfærd, nyttigt til store datasæt og genetiske skærme store.
Introduction
Drosophila har længe været brugt til at studere det genetiske grundlag for adfærd 1, og forskere har udtænkt en række måder at analysere forskellige former for adfærd 2-6. Fluer har været særligt nyttige til at give brugbare modeller af neuromuskulære lidelser 7. En fælles analyse anvendes til at undersøge lokomotorisk adfærd er flyveegenskaber. Den oprindelige flyvning testeren er nyttig til at identificere flyvning mutanter og kvantitativ vurdering søgning evne 1, men det har flere mangler, som begrænser dens anvendelse til high throughput skærme: brugen af olieovertrukne cylindre er rodet og besværligt, visse funktioner såsom længden af cylinderen og indførelse af fluer ind i røret med variabel kraft reducere kvantitativ nøjagtighed, og det er vanskeligt at genvinde levende fluer fra testeren. For at overvinde disse begrænsninger, har vi ændret flyvningen testeren til at omfatte en række forbedringer. Vi har tilføjet en "drop tuvære "at indføre fluer at fjerne variation mellem eksperimenter og brugere. Vi bruger flytbare acrylplader belagt med et klæbemiddel, der giver mulighed for lettere oprydning og genopretning af de enkelte fluer. Vi har øget længden af flyvningen røret for at forbedre kvantitativ nøjagtighed og pålidelighed. Endelig vi bruge et digitalt kamera og billedbehandling software til at beregne landing højder af fluer. Vi mener, at disse forbedringer vil være nyttigt at alle laboratorier interesseret i at gennemføre genetiske skærme storstilede for defekter i flyveegenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Saml Flight Tester
- Secure Flight cylinder til Ring Stand 1 ved hjælp af kæde klemmer. (Efterlad cirka 3 cm under cylinder til veje skålen.)
(Bemærk: Flyvningen cylinder vi bruger, er 90 cm lang med en diameter på 13,5 cm.) - Indsæt vejes skålen med et tyndt lag af mineralsk olie under flyvningen cylinder.
- Sikker tragt til Ring Stand 2 ved hjælp af en ring klemme og klo klemme. Juster højden af tragten, således at bunden af tragten flugter med toppen af flyvningen cylinder. (Bemærk: spids diameter af tragten skal være mindre end den ydre diameter af hætteglas placeres i faldrør, således at hætteglassene ikke vil falde igennem.)
- Sæt faldrør ind i toppen af tragten og fastgør det med en klo klemme.
(Bemærk: Vi bruger en dråbe rør, der er 25 cm lang Dropper flyve-holdige hætteglas fra denne højde tillader konsekvent udstødning af alle fluerne med ensartet kraft Den indvendige diameter af dråben slangen skal være Sligh..tly større end den ydre diameter af hætteglasset for at tillade hætteglasset til at falde frit.) - Skær polyacrylamid ark (s) til den korrekte størrelse. (Bemærk: For at hjælpe med at indsætte og fjerne arket bør bredden være lidt mindre end den indre omkreds af flyvningen cylinderen).
- Påfør et tyndt lag af Tangle-Trap til arket. Lad det sidde i 1 time før brug. (Bemærk: der er plads nok på toppen og bunden af arket (ca. 3 cm) ulakeret at forstå ark til isætning / fjernelse.)
- Sæt polyacrylamid ark i flyvningen cylinder.
- Saml kameraet spor ved hjælp af fyrretræ støttebeslag. (Bemærk: at sikre, at bunden af sporet kan støtte kameraet uden at blokere objektivet Se figur 1B..)
- Tilføj propper og skru på plads. (Bemærk: sted propperne på steder, der vil gøre det muligt for kameraet at se hele plastfolie i panoramisk tilstand.)
2. Kør eksperiment
- <li> Saml hætteglas af fluer, der skal testes. For de bedste resultater ved at bruge mere end 20 fluer / hætteglas.
- Bank forsigtigt på fluer til bunden af hætteglasset, tag derefter indsætte i faldrør og slip hætteglasset.
(Bemærk: Hætteglasset falder ned i faldrøret, indtil den rammer den smalle tragtåbningen Når hætteglasset rammer tragten er fluerne skubbes ind flyvningen cylinderen.). - Løft faldrøret for at fjerne den tomme hætteglas.
(Bemærk: Flere hætteglas af fluer i samme testgruppe kan analyseres på et enkelt polyacrylamid ark Vi finder, at op til 200 fluer (10 hætteglas af 20 fluer hver) kan testes og filmede let på et enkelt ark.. - Fjern plastik plader og placere den på en flad hvid overflade.
(Bemærk: hvid plakat bord kan bruges, hvis bænk toppe er mørk.) - Saml kameraet sporet over plastfolie. Kameraet bør være tilstrækkeligt højt over arket at have både toppen og bunden af pladen i det synsfelt.
- Skub kamera sammen the spor, mens du holder "capture"-knappen for at erhverve et panoramabillede.
- Antallet af fluer, der lander i olien, kan medregnes manuelt for hvert forsøg.
- Gentag trin 2,2-2,7 for alle forhold i et givet eksperiment. Fluerne kan fjernes fra arket mellem hvert forsøg. Alternativt kan flere ark blive anvendt, med et nyt ark for hvert forsøg.
3. Dataindsamling
- Åbn billede filer ved hjælp ImageJ software.
- Beskær billeder, hvis nødvendigt at medtage kun landing areal. (Dette er det område belagt med Tangle-Trap.)
- Konvertere billeder til 8-bit gråtoner.
- Opret en "Threshold" for at bortfiltrere den hvide baggrund.
(Billede → Juster → Threshold). - Indstil parametrene til at identificere hver flue ved hjælp af "analysere partikler" menuen.
(Analyze → Analyser Partikler) Definer de parametre, der anvendes til at identificere en partikel. Med vores sat op, finder vi, at ved hjælp af enareal på 5-90 pixels 2 og en cirkulær 0,4-1,0 vil præcist identificere alle prøver. - Måle placeringen af hver flue vha. den genererede liste over koordinater for hver partikel. X-koordinaten i pixels kan omdannes til centimeter til beregning landing højde.
- Importere tabel i et regneark (såsom Microsoft Excel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser skematisk den opdaterede flyvning testeren forsamling. 1B illustrerer sporet design giver kameraet til at tage et panoramabillede uden at blokere synsfeltet. Repræsentative resultater er vist i figur 2, når flyvningen ydeevne Slowpoke mutant fluer, som har en kendt fly defekt 8-10, er i forhold til vild-type Canton-S fluer. Kontrol flyver konsekvent lander nær toppen af cylinderen, med meget lidt spredning mellem individer og en gennemsnitlig landing højde på 73 ± 2,0 cm. I modsætning hertil viser Slowpoke fluer en langt mere varieret landing spredning og jord betydeligt lavere gennemsnit 44 ± 4,1 cm. Alle fluer var 3 dage gammel, hævet ved stuetemperatur (23 ° C).
s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Diagrammer over Flight Tester, kamera, og Track. (A) Illustration af den sat op til den opdaterede flyvning tester. Ring Stand 1 holder 90 cm-høje flyvning cylinder, ring Stand 2 holder tragten og 10 cm lange "drop tube". (B) Diagram af kamera og spor bruges til at producere et panoramabillede. Kameraet bør støttes af sporet uden at hindre udsigten fra linsen. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Repræsentative resultater fra en stikprøve flyvning eksperiment. Sammenligning søgning evne 3-dages gamle CaNTON-S kontrol flyver til Slowpoke mutanter (slo TS1). (A) Skærm fanger for Slowpoke og kontrol fluer viser landing højder af de enkelte fluer. Hver blå cirkel repræsenterer placeringen af en individuel flyve. Disse lander højder bruges til at beregne den gennemsnitlige landing højde (B) samt overordnede fordeling (C) for hver genotype. Mandlige og kvindelige fluer blev samlet sammen i hver prøve. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjælp af de metoder der er beskrevet her, har vi været i stand til hurtigt at vurdere flyvning udførelsen af en lang række Drosophila mutanter, hvilket giver større effektivitet end hidtil muligt. For vores eksperimenter, vi rutinemæssigt adskille mænd og kvinder og hæve dem ved lav densitet (mindre end 20 fluer / hætteglas) at begrænse aggression, der kan skade vinger. En anden vigtig overvejelse er at kontrollere ordentligt for forskelle i flyvning ydeevne på grund af forskelle i genetisk baggrund. Vi finder også det hjælper at lade fluer minimum 24 timer at komme sig efter bedøvelse med kuldioxid før prøveflyvninger. Alternativt kan fluer bedøves ved udsættelse for kulde (4 ° C) for at give mulighed for hurtigere genopretning uden potentielt påvirke adfærd.
Det hastighedsbegrænsende trin i denne protokol er at fjerne fluer fra plastpladen mellem forsøg. En metode til at øge effektiviteten er at bruge et stort antal of ark samtidigt, braklægning arkene, efterhånden som de anvendes, og rense dem alle på én gang efter dataindsamling. Fluer, der falder til bunden skal tælles manuelt, da de ikke vil blive medtaget på arket. Stadig, det er let i forhold til manuelt beregne landing højde. Behovet for at genanvende Tangle-Trap til hvert ark vil variere afhængigt af hvor tyk coating. Det er vores erfaring, vil en individuel plade vare måned før en ny belægning er nødvendig.
En yderligere fordel ved at bruge Tangle-Trap i mineralsk olie er evnen til at genoprette levende fluer fra arket. Da fluerne simpelthen holde sig til overfladen af Tangle-Trap snarere end at blive nedsænket kan individuelle fluer nemt fjernes. "Flightless" fluer, der falder til bunden også kan inddrives ved at erstatte mineralolie bakke med en tom kolbe.
Vi tror automatiseret måling søgning adfærd beskrevet her giver et numlet af fordele i forhold til tidligere metoder, der giver mulighed for et højere niveau af gennemløb, reproducerbarhed og nøjagtighed for genetiske skærme. Automatiseret scoring er også blevet anvendt til at øge throughput adfærdsmæssige assays, såsom RING assay 11. Desuden direkte måling af landing højde giver en større følsomhed end en simpel bestået / ikke-måling (% løbesedler osv.), Hvilket giver os mulighed for at opdage mere subtile forskelle i flyvning ydeevne.
Den her beskrevne assay kan suppleres med efterfølgende yderligere analyser, der måler mere komplekse aspekter af flyvningen adfærd, herunder visuel kontrol af flyvehastighed 12 og fri flyvning reaktioner på bevægelse 13. Mens disse tests er mere tidskrævende og ikke gøres til genstand for genetiske skærme store, kan de medvirke til at give flere oplysninger om et bestemt gen funktion i en bevægelsesreaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter til at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud F32 NS078958 (DTB), og R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
- Benzer, S.
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
